Воспроизводство крупного рогатого скота

Антиоксиданты

Антиоксиданты уменьшают образование в средах свободных радикалов, способных вызывать повреждения. В качестве антиоксидантов в средах для эмбрионов часто используют глутатион, BSA, аскорбиновую кислоту и каталазу.

Хелатирующие агенты

Хелатирующие агенты — это вещества, связывающие ионы тяжёлых металлов. В совершенно чистой среде они не требовались бы, однако всегда существует вероятность того, что следовые количества тяжёлых металлов попадут в состав среды с водой или солями реактивов. Трансферрин, BSA и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) действуют как хелатирующие агенты.

Осмолиты

Осмолиты — это органические соединения, которые участвуют в поддержании объёма клеток и внутриклеточных органелл, а также водного баланса. Когда клетки набухают под действием внешнего осмотического давления, в мембране открываются каналы, через которые осмолиты выходят из клетки, увлекая за собой воду и восстанавливая нормальный объём клетки. Глицин — осмолит и самая маленькая из так называемых заменимых аминокислот, которые обычно добавляют в культуральные среды и в некоторые составы сред для временного хранения и криоконсервации. Физиологические основы осмолитных свойств глицина при культивировании эмбрионов подробно описали Steeves и соавт. .⁴⁰

pH и буферные системы

Внутриклеточный pH (pHi) эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro, составляет 7.2 при измерении с помощью pH-чувствительного зонда.⁴¹ Это исследование также показало, что культивируемые эмбрионы крупного рогатого скота после воздействия кислой среды восстанавливались гораздо легче, чем после воздействия щелочной. В действительности при воздействии на эмбрионы среды с pH выше 8 значение pHi снижалось лишь приблизительно до 7.8. В классическом исследовании Kane⁴² показал, что наибольшая доля бластоцист кролика выходила из прозрачной оболочки в ходе IVC при pH в диапазоне 7.2–7.4; при pH ниже 7.0 или выше 7.8 эта доля резко снижалась. pH большинства сред для IVP крупного рогатого скота находится в диапазоне 7.3–7.4, за исключением сред для оплодотворения, у которых он обычно составляет 7.5–7.6.

Фосфатно-солевой буфер (PBS), широко применяемый при извлечении эмбрионов, полученных in vivo, содержит фосфат в качестве буферного компонента. Хотя фосфат не является особенно эффективным буфером, добавление сыворотки или BSA повышает буферную ёмкость PBS. Среды для IVP, напротив, обычно находятся в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% CO2. Бикарбонат в составе этих сред обеспечивает стабильный pH благодаря равновесию, устанавливающемуся между бикарбонатом и CO2. Однако после извлечения сред на основе этой системы из инкубатора pH быстро снижается и за несколько минут на воздухе достигает неприемлемого уровня кислотности. Поэтому среды, используемые для промывания яйцеклеток и зигот между этапами IVP, а также для их хранения на воздухе перед переносом или криоконсервацией, содержат цвиттерионные буферы MOPES или HEPES.

Осмолярность

Оптимальная осмолярность для поддержания жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота при получении эмбрионов in vitro составляет приблизительно 275 mmol/L. Это справедливо и для других видов, таких как кролик, крыса и свинья.⁴³На практике кратковременное воздействие среды с осмолярностью от 250 до 300 mmol/L не оказывает неблагоприятного влияния на эмбрионы крупного рогатого скота и, вероятно, лошадей. Исследования показали, что общая осмолярность от 250 до 270 mmol/L, по-видимому, оптимальна, когда эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vitro, культивируют в среде KSOM.⁴⁴

При регулировании осмолярности сред важно учитывать, какие вещества добавляют или содержание каких веществ уменьшают, чтобы повысить или понизить осмолярность. Наиболее распространённая соль во всех средах, используемых при процедурах ЭКО, — NaCl, однако было показано, что при концентрациях выше 95 mmol/L она отрицательно влияет на развитие эмбрионов крупного рогатого скота.⁴⁴Таким образом, положительный эффект осмолярности ниже 300 mmol/L, наблюдавшийся в большинстве исследований, вероятно, обусловлен снижением концентрации Na⁺, а не снижением осмолярности как таковой (осмолярность жидкости яйцевода составляет >300 mmol/L).

Созревание

Успех получения эмбрионов in vitro во многом зависит от качества исходного материала — ооцита. Микрофотографии свежеполученных ооцитов четырёх основных категорий представлены на рисунке 81.2. Потенциал ооцитов этих категорий к созреванию и развитию в эмбрионы существенно различается: от типа 1 с наибольшим потенциалом до типа 4, потенциал которого практически равен нулю.¹⁶В таблице 81.2 показана способность этих ооцитов к оплодотворению, развитию до стадии бластоцисты и наступлению беременности.

Ооцит, пригодный для получения эмбрионов in vitro, называют «созревшим». Созревание включает ряд процессов, которые начинаются во внутриутробном периоде с вступления в мейоз. К моменту рождения мейоз в ооцитах останавливается на стадии диплотены, хотя они продолжают расти. Мейотическая активность возобновляется лишь после полового созревания, когда ооциты подвергаются воздействию предовуляторных пиков гонадотропинов — лютеинизирующего гормона (LH) и FSH. Эти гормоны вызывают изменения экспрессии генов, а также морфологических и физиологических характеристик текальных клеток, клеток гранулёзы, кумулюса и ооцита в составе фолликула яичника. В каждом эстральном цикле часть ооцитов вовлекается в продолжение мейоза, который вновь останавливается на стадии метафазы II; на этой стадии происходит их овуляция. Изменения, происходящие между остановкой мейоза на стадиях диплотены и метафазы II, считаются созреванием.⁴⁵

Созревание незрелых ооцитов in vitro (IVM) происходит по иному механизму, чем созревание ооцитов in vivo. Извлечение ооцита из фолликулярной среды, сдерживающей его созревание, и последующее помещение в благоприятные условия культивирования приводят к спонтанному созреванию без той последовательности физиологических процессов, которая происходит in vivo , хотя могут наблюдаться некоторые морфологические изменения (например, разрастание клеток кумулюсаg).⁴⁶ Условия in vitro моделируют некоторые физиологические изменения благодаря добавлению гормонов, в том числе LH, FSH и эстрадиола-17β, характерных для преовуляторного фолликула, а также гормонов роста или эпидермального фактора роста.⁴⁷

Способ получения ооцитов и степень их зрелости определяют, как с ними следует обращаться после получения. Незрелые ооциты можно получать от коров, не подвергавшихся стимуляции,

I II
III IV

Рисунок 81.2 Типы ооцитов крупного рогатого скота, полученных из яичников до созревания in vitro (IVM). Краткое описание: I — более четырёх слоёв клеток кумулюса; II — от одного до трёх слоёв клеток кумулюса; III — ооцит без клеток кумулюса; IV — разросшийся кумулюс. Воспроизведено с разрешения Hasler.¹¹

Таблица 81.2 Потенциал оплодотворения и эмбрионального развития у различных типов незрелых ооцитов крупного рогатого скота.¹¹

Значения в пределах одного столбца, отмеченные разными надстрочными буквами (a, b или c), значимо различаются ( P < 0.025). Источник : воспроизведено с разрешения из: Hasler J. Перенос эмбрионов и оплодотворение in vitro. В кн.: Schatten H, Constantinescu GM (ред.) Сравнительная биология размножения . Эймс, Айова: Blackwell Publishing, 2007, с. 171–211.

у которых проводят трансвагинальную аспирацию ооцитов (OPU) каждые 3–7 дней независимо от стадии полового цикла; однако можно также приурочить аспирацию к периоду после стимуляции яичников и введения LH или гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH), чтобы получить зрелые ооциты. Такие В естественных условиях созревшие ооциты не требуют дальнейшего созревания in vitro , хотя несколько часов в среде для созревания перед оплодотворением могут быть полезны. Ооциты, аспирированные из яичников коров, забитых на бойнях, получают преимущественно из фолликулов диаметром 3–8 mm; полученные группы ооцитов различаются по степени зрелости. Тем не менее большинство этих ооцитов способны созреть за 24-часовой период IVM.

Оплодотворение

После завершения IVM ооциты готовы к оплодотворению. Для этого ооциты совместно инкубируют со сперматозоидами, обычно в планшете с 4 лунками, хотя это можно делать и

в микрокапле под слоем масла. В большинстве лабораторий совместная инкубация длится 18 часов, хотя большинство случаев оплодотворения происходит в течение первых 12 часов.

При эякуляции сперматозоиды подвижны, но ещё не способны оплодотворить ооцит. Совокупность изменений, через которые должен пройти сперматозоид, прежде чем он сможет оплодотворить ооцит, называется капацитацией. Хотя этот процесс был открыт в 1951 году Чангом⁴⁸ и Остином,⁴⁹ молекулярные механизмы капацитации остаются неясными. Обычно капацитация происходит в перешейке яйцевода, хотя у некоторых видов она может начинаться в шейке матки, где цервикальная слизь способствует удалению белков с поверхности сперматозоидов. Задача специалистов, проводящих IVF, — воспроизвести эти условия, создав для сперматозоидов среду, способствующую капацитации. Температура имеет решающее значение для успешной капацитации. Данные, полученные на овцах и свиньях, указывают на то, что капацитация наиболее эффективна при температуре тела, а не при 37 °C, на которую настроены многие инкубаторы (обзор см. в источнике 50). Это может

быть связано с физическим состоянием липидов мембраны вне физиологических условий. У крупного рогатого скота IVC, включая этап оплодотворения, обычно проводят при 38.5 °C.

Разработаны среды, обеспечивающие капацитацию in vitro . Среда для совместной инкубации сперматозоидов и ооцитов обычно имеет несколько более высокий pH (7.5 по сравнению с 7.3 в средах для созревания и культивирования). В качестве базовой среды можно использовать растворы Тироде и Кребса — Рингера с добавлением источников энергии (глюкозы, лактата и пирувата) и альбумина.⁵⁰ Основное вещество, добавляемое в среды для оплодотворения с целью капацитации, — гепарин. Предполагается, что, связываясь с белками и стимулируя отток холестерина и фосфолипидов, он способствует удалению компонентов семенной плазмы с поверхности сперматозоидов.^50,51 К другим веществам, способствующим капацитации, относятся кофеин — ингибитор фосфодиэстераз; бикарбонат, вызывающий зависимые от протеинкиназы A изменения структуры липидов; аденозин, взаимодействующий с мембранными рецепторами и повышающий внутриклеточный уровень циклического AMP; и активные формы кислорода (ROS), такие как супероксид-анион, перекись водорода и оксид азота, которые активируют мембранные мишени и запускают внутриклеточные механизмы, включая фосфорилирование тирозиновых остатков белков.⁵¹

Большинство сперматозоидов, используемых для IVF у крупного рогатого скота, предварительно замораживают и оттаивают. Криоконсервация вызывает в сперматозоидах крупного рогатого скота изменения, сходные с изменениями при капацитации. У них повышается внутриклеточный уровень кальция, происходит суммарная потеря белков плазматической мембраны и увеличивается количество ROS.⁵² Таким сперматозоидам также требуются менее продолжительное воздействие веществ, способствующих капацитации, и меньшие их дозы, чем свежим сперматозоидам, идеально подходящим для IVF. В хорошо организованной лаборатории IVF средняя частота оплодотворения при использовании замороженных сперматозоидов может достигать 80% или более.

Наиболее распространённый метод подготовки сперматозоидов к оплодотворению — центрифугирование в градиенте концентрации. Такой ступенчатый градиент готовят из раствора TALP для сперматозоидов, смешанного с Percoll® (Sigma) в разных пропорциях. Чаще всего слой смеси с 45% Percoll располагают поверх слоя смеси с 90% Percoll. Сперму или содержимое размороженной соломинки со спермой наносят поверх градиента и центрифугируют при 800 × g в течение времени, зависящего от высоты столба жидкости, через который должны пройти сперматозоиды. При этом интактные сперматозоиды собираются на дне центрифужной пробирки. Альтернативный метод выделения интактных сперматозоидов — метод «выплывания»: поверх содержимого размороженной соломинки наслаивают среду, дают сперматозоидам выплыть в неё, а затем через некоторое время отбирают их аспирацией.

Использование сперматозоидов, отсортированных в зависимости от того, несут ли они X- или Y-хромосому, становится всё более важной частью процесса IVP у крупного рогатого скота, особенно в молочном животноводстве.⁵³ Точность сортировки спермы составляет приблизительно 90%. В недавнем исследовании частота наступления стельности у молочных коров, которым переносили эмбрионы IVP, полученные с использованием спермы, сортированной по полу (30%), не отличалась от показателя у коров, получавших эмбрионы с использованием обычной спермы (27%). Однако потери стельности после переноса эмбрионов IVP, полученных с использованием сортированной по полу спермы, были значимо выше, чем у коров, искусственно осеменённых обычной спермой.⁵⁴ В этом исследовании, как и в большинстве коммерческих хозяйств, использовали замороженную и затем оттаянную сперму, которую сортировали до криоконсервации. В некоторых случаях замороженную сперму сортируют после оттаивания и используют для оплодотворения ооцитов сразу после сортировки. Это называется обратной сортировкой; при её применении

in vitro частота получения бластоцист и наступления стельности сопоставима с показателями при использовании свежей спермы, сортированной по полу, и выше, чем при использовании спермы, замороженной после сортировки по полу⁵⁵ (неопубликованные результаты предоставлены Trans Ova Genetics).

Культивирование in vitro эмбрионов

IVC эмбрионов крупного рогатого скота — заключительный этап процесса IVP; он включает приблизительно 6 дней культивирования от стадии 1-клеточной зиготы после IVF до стадии бластоцисты.

Наиболее распространённые среды для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота представляют собой варианты сред, описанных Tervit и соавт. ’s⁵⁶ исходной синтетической среды яйцевода (SOF) с добавлением аминокислот и, в некоторых случаях, небольшого количества сыворотки.^57–60 При культивировании на основе SOF может использоваться среда одного состава на протяжении всего периода культивирования in vitro (IVC) либо двух- или трёхэтапная «последовательная» система, в которой состав среды меняется в определённые моменты периода культивирования. Последовательные системы разработаны с целью воспроизвести физиологические изменения, с которыми in vivo сталкиваются зиготы, перемещаясь по яйцеводам в матку в течение первых 6 или 7 дней развития. Объём среды, используемой в системах IVC, также различается: в некоторых лабораториях эмбрионы культивируют в микрокаплях объёмом всего 25 μL под слоем масла, тогда как в других объём достигает 500 μL, с масляным слоем или без него. В некоторых системах IVC культивирование проводят в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% CO2 в воздухе; однако имеются убедительные данные о том, что в отсутствие совместного культивирования эмбрионы крупного рогатого скота лучше развиваются в атмосфере, содержащей 5% CO2, 5% O2 и 90% N2.^61,62

В прошлом при коммерческом получении эмбрионов in vitro (IVP) чаще всего использовали системы совместного культивирования, включавшие монослой соматических клеток. Для успешного совместного культивирования эмбрионов крупного рогатого скота применяли первичные клетки яйцеводов крупного рогатого скота или свиней, ампулярного отдела яйцеводов мышей, кумулюса, гранулёзы и матки, а также постоянные клеточные линии, такие как Buffalo Rat Liver (BRL) и Vero. В системах совместного культивирования эти клетки сочетали с различными средами, в том числе TCM-199, Menezo’s B2 и Ham’s F-10.

Сегодня системы совместного культивирования не получили широкого распространения, поскольку большинство лабораторий сосредоточилось на изучении систем IVP на основе сред с определённым составом. Это среды, все компоненты которых известны; соответственно, такие продукты, как сыворотка и бычий сывороточный альбумин (BSA), в них не входят. Теоретически систему с определённым составом можно в точности воспроизвести в любой лаборатории в любое время. Кроме того, использование таких систем необходимо для понимания потребностей предимплантационных эмбрионов при культивировании и оптимизации его условий. Однако при использовании химически определённых сред, не содержащих белка, сообщалось лишь об умеренных показателях получения бластоцист.^63,64 По этой теме опубликовано несколько весьма обстоятельных обзоров.^65–68

Коммерческие предприятия, занимающиеся переносом эмбрионов и IVP, прежде всего заинтересованы в эффективном и предсказуемом получении как можно большего числа жизнеспособных эмбрионов. Поэтому в различные среды, в том числе среды для IVC, часто добавляют BSA (полуопределённая среда), а в некоторых случаях — умеренное количество сыворотки (среда неопределённого состава). Кроме того, системы с неопределённым составом могут предусматривать совместное культивирование с включением различных соматических клеток. Такие системы бывает трудно воспроизвести из-за различий