между партиями коммерчески доступных клеток либо из-за отсутствия «бессмертия» у некоторых типов клеток при их культивировании на протяжении многих поколений в лабораториях IVP.
Многочисленные качественные и количественные различия между эмбрионами, полученными in vivo и in vitro, подробно описаны для крупного рогатого скота и других видов.16 Имеются данные о том, что у эмбрионов, полученных методом IVP, меньше клеток, а доля клеток внутренней клеточной массы (ICM) по отношению к клеткам трофобласта ниже, чем у эмбрионов, полученных in vivo на той же стадии развития; эти различия могут быть связаны с использованием разных систем культивирования.69,70 Однако общее число клеток не обязательно отражает целостность и жизнеспособность предимплантационных эмбрионов, полученных методом IVP. Ван Сом и соавт.71 с помощью дифференциального окрашивания показали, что, хотя у эмбрионов, полученных в среде Menezo’s B2, клеток было больше, чем у эмбрионов того же возраста, полученных в TCM-199, у эмбрионов, полученных в B2, разброс числа клеток ICM был шире. Дополнительные клетки у эмбрионов, полученных в B2, относились преимущественно к трофобласту. Добавление сыворотки также может увеличивать число клеток, но имеются данные о том, что это может снижать способность эмбрионов переживать криоконсервацию.72 Таким образом, не следует выбирать среду для IVC на основании увеличения числа клеток в эмбрионах.
Помимо различий в числе клеток, среды для IVC различаются по скорости развития эмбрионов.73–75 Очевидно, что в одной и той же среде для IVC быстрее развивающиеся эмбрионы часто имеют более высокое качество, если судить по числу клеток,76 конечной стадии развития77 и частоте наступления беременности после переноса.22
Исследование с применением флуоресцентной гибридизации in situ показало, что высокая доля (72%) эмбрионов крупного рогатого скота, культивированных в системе совместного культивирования со средой Menezo’s B2, была миксоплоидной, по сравнению с 25% бластоцист, развившихся in vivo .78 Из общего числа in vitro эмбрионы, 17%, содержали более 10% полиплоидных клеток. Напротив, все in vivo эмбрионы содержали менее 10% полиплоидных клеток. Авторы этого исследования предположили, что существует связь между полиплоидией in vitro эмбрионов и возможностью развития из них полиплоидных клеток плаценты. Это может приводить к чрезмерной активности плаценты, которая, в свою очередь, обусловливает рождение крупных телят (см. раздел «Стельность и потомство»).
Сопоставление процесса IVP с получением эмбрионов in vivo и стадиями развития эмбрионов представлено на рисунке 81.3.
Криоконсервация эмбрионов IVP
Криоконсервацию эмбрионов крупного рогатого скота регулярно проводят в исследовательских и коммерческих лабораториях ЭКО по всему миру. Традиционную криоконсервацию методом медленного замораживания широко применяют для полученных in vivo эмбрионов; в крупномасштабных исследованиях частота наступления стельности достигает 50–55%.22,79 При использовании замороженных и оттаянных эмбрионов IVP частота наступления стельности была ниже.
Наиболее распространённый протокол криоконсервации ооцитов крупного рогатого скота методом медленного замораживания предусматривает охлаждение эмбриона до –6 °C и выдержку при этой температуре. Во время выдержки в соломинке с эмбрионом инициируют образование кристаллов льда, затем температуру снижают до –32 °C со скоростью 0.3– 0.6 °C в минуту и погружают соломинку в жидкий азот. Эмбрионы крупного рогатого скота обычно замораживают в растворе, содержащем 1.5 mol/L этиленгликоля и 0.1–0.5 mol/L сахарозы. Использование этиленгликоля в качестве криопротектора позволяет переносить эмбрион реципиенту непосредственно из соломинки, тогда как
другие криопротекторы, например глицерин, перед переносом необходимо удалять путём разбавления среды для замораживания.80 К другим криопротекторам, применявшимся для замораживания эмбрионов крупного рогатого скота, относятся диметилсульфоксид, пропандиол, метанол, различные сахара и их сочетания.81
На выживаемость эмбрионов после оттаивания влияет несколько факторов, включая стадию развития. Морулы и бластоцисты переносят замораживание и оттаивание лучше, чем эмбрионы на более ранних стадиях, однако даже день формирования бластоцисты может влиять на её выживаемость после оттаивания. После переноса бластоцист, полученных методом ЭКО и замороженных на день 7, частота наступления стельности составляла 42%, но для бластоцист, замороженных на день 8, снижалась до 20%; при этом чаще наблюдались ранние аборты и дистоции.22 Качество эмбрионов также влияет на результаты после оттаивания. Данные о частоте наступления стельности после переноса замороженных и оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота в зависимости от категории качества опубликовали Hasler и соавт.22 : категория 1 — 63%; категория 2 — 57%; категория 3 — 44%; категория 4 — 36%.
Влияние скорости охлаждения и нагревания на эмбрионы различных видов широко изучалось. В одном исследовании эмбрионы крупного рогатого скота охлаждали со скоростью 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 или 1.5 °C/мин, а затем отогревали либо быстро в водяной бане при температуре 35 °C (скорость нагревания >1000 °C/мин), либо медленно на воздухе при температуре 25–28 °C (<250 °C/мин).82 Наилучший результат дало охлаждение со скоростью 0.3 °C/мин с последующим быстрым отогревом: 42.1% морул развились в бластоцисты, выходящие из блестящей оболочки. Эти результаты показывают, что очень медленное охлаждение повышает выживаемость морул и бластоцист крупного рогатого скота, полученных методом IVP, тогда как медленный отогрев вреден для морул и бластоцист даже в сочетании с очень медленным охлаждением.
Витрификация — альтернатива криоконсервации методом медленного замораживания. Она предполагает сверхбыстрое охлаждение, при котором вместо образования льда вещество переходит в стеклообразное состояние. С тех пор как в 1985 витрификация была предложена в качестве эффективного метода криоконсервации эмбрионов,83 её применяли главным образом в исследованиях. Ограничения витрификации включают токсическое действие высоких концентраций криопротекторов, повреждения вследствие осмотического шока и необходимость привлечения высококвалифицированных специалистов. Тем не менее витрификация оказалась более эффективной для криоконсервации чувствительных к ней эмбрионов, в частности эмбрионов IVP.84 Ещё одно преимущество витрификации состоит в том, что она не требует дорогостоящих установок для замораживания клеток, используемых при медленном замораживании; кроме того, на уравновешивание и последующую криоконсервацию каждого эмбриона уходит меньше времени. Исследования также показали, что по сравнению с витрификацией криоконсервация методом медленного замораживания может вызывать изменения уровня экспрессии генов, участвующих в развитии доимплантационного эмбриона крупного рогатого скота.85 Витрификация в сочетании с разбавлением криопротектора внутри соломинки могла бы стать альтернативой медленному замораживанию эмбрионов, полученных in vitro или in vivo .
Перенос эмбрионов, полученных методом ЭКО
В большинстве случаев эмбрионы, полученные in vitro (IVP), переносят так же, как и эмбрионы, полученные in vivo. После извлечения из инкубатора эмбрионы IVP обычно переносят немедленно, тогда как эмбрионы, полученные in vivo, можно до переноса выдерживать при комнатной температуре до 24 часов без потери жизнеспособности.
Частота наступления стельности после переноса эмбрионов IVP неизменно ниже, чем после переноса эмбрионов, полученных in vivo. Значительно более низкая
In vivo
Бахромка маточной трубы
Рог матки
Яйцевод
Яичник
День 1 День 2–4 День 5–7
(a) (b) (c) (d) (e) (f)
День –1 День 0 День 1–3 День 4–7
Созревание Оплодотворение Среда для культивирования эмбрионов 1 Среда для культивирования эмбрионов 2
Гормоны pH EDTA Незаменимые аминокислоты
EGF гепарин Таурин более высокая концентрация сахаров
цистеамин кофеин
In vitro
Рисунок 81.3 Сравнение развития эмбрионов in vivo и in vitro. В верхней части показано расположение эмбрионов на каждой стадии развития при их продвижении по половым путям. В нижней части выделены некоторые различия между средами, используемыми на разных этапах ЭКО. Микрофотографии: (a) зрелый ооцит с разросшимися клетками кумулюса (b) 2-клеточный эмбрион (c) 4-клеточный эмбрион (d) 16-клеточный эмбрион (e) ранняя бластоциста (f) бластоциста.
частота наступления стельности отмечалась, в порядке убывания, после переносаin vivo замороженных эмбрионов, свежих эмбрионов IVP дня -7, свежих эмбрионов IVP дня -8, замороженных эмбрионов IVP дня -7 и, наконец, замороженных эмбрионов IVP дня -8.22 Если рассматривать стадию развития независимо от возраста и категории качества, перенос большого числа эмбрионов, полученных in vivo, показал, что ранние бластоцисты (EB) и бластоцисты средней стадии развития (MB) обеспечивали более высокую частоту наступления стельности, чем морулы (M), экспандированные бластоцисты (XB) или вылупившиеся бластоцисты (HB).86 Перенос эмбрионов класса 1 на день -7 на стадиях EB, MB или XB обеспечивает более высокую частоту наступления стельности, чем перенос соответствующих эмбрионов на день -8.
Синхронность состояния коров-реципиентов со стадией развития эмбриона — важный фактор наступления стельности. Для эмбрионов IVP днём 0 считается день оплодотворения, тогда как у реципиентов день 0 начинается с наступления стоячей охоты. При переносе эмбрионов нулевая синхронность означает перенос эмбриона реципиенту с соответствующим номером дня: например, эмбрион дня -7 переносят реципиенту, у которого охота наблюдалась 7 дней назад. Синхронность минус 1 день означает перенос эмбриона реципиенту, у которого охота наблюдалась на 1 день позже, чем соответствует возрасту эмбриона: например, эмбрион дня -7 переносят корове, у которой охота была 6 дней назад. Хотя такая система обозначений общепринята, она вводит в заблуждение: овуляция у реципиента происходит приблизительно через 12 часов после окончания охоты, которая длится в среднем 18 часов (день 0 начинается с наступлением стоячей охоты), тогда как оплодотворение in vitro происходит в течение нескольких часов. Следовательно, эмбрион IVP, обозначенный как эмбрион дня 7, фактически на 1 день старше эмбриона дня -7, полученного in vivo.22,87 Эта асинхронность отражается на частоте наступления стельности. При переносе эмбрионов дня -7 реципиентам дня -6 она составляла 50.3% по сравнению с 55% у реципиентов дня -7 и 58% у реципиентов дня -8. Дополнительным подтверждением служат недавние данные Trans Ova Genetics, основанные более чем на 10 000 переносах: при использовании реципиентов дня -6, -7 и -8 для эмбрионов IVP дня -7 частота наступления стельности составляла соответственно 42, 50 и 49% (неопубликованные результаты Trans Ova Genetics). Чтобы избежать снижения частоты наступления стельности, по возможности не следует использовать реципиентов дня -6.
В настоящее время коммерческое получение эмбрионов крупного рогатого скота методом IVP успешно осуществляется в ряде лабораторий по всему миру. Компания BOVITEQ Inc. в Квебеке88 и компания Trans Ova Genetics89 и Em Tran, Inc.22 в США — компании, занимающиеся коммерческим переносом эмбрионов, которые успешно получали стельности после переноса эмбрионов, полученных методом OPU/IVP от бесплодных доноров. Кроме того, Trans Ova Genetics, Sexing Technologies и Ova Tech в США и BOVITEQ в Канаде в настоящее время получают большое количество эмбрионов IVP от здорового крупного рогатого скота. По оценкам, по состоянию на 2012 год эмбрионы OPU/IVP составляли приблизительно 10% от общего числа переносов эмбрионов в США (данные предоставлены Американской ассоциацией переноса эмбрионов).
Динамика числа переносов эмбрионов, полученных in vitro и in vivo, в мире по годам в период с 2000 по 2011 год показана на рисунке 81.4. Очевидно, что число переносов in vivo эмбрионов, полученных путём суперовуляции и извлечённых промыванием, оставалось относительно стабильным, тогда как число эмбрионов IVP ежегодно росло. В настоящее время в Бразилии получают больше эмбрионов IVP, чем в любой другой стране. Одна компания, In Vitro Brazil, сообщила, что в 2012 году перенесла более 200 000 эмбрионов IVP. По оценкам, на долю суперовуляции с последующим извлечением эмбрионов промыванием в настоящее время приходится лишь 9% переносов эмбрионов
Всего переносов эмбрионов in vitro Всего переносов эмбрионов in vivo
800 000
700 000
600 000
500 000
400 000
300 000
200 000
100 000
0
Год
2000 2002 2004 2006 2008 2010
Число переносов
Рисунок 81.4 Сравнение ежегодного числа переносов эмбрионов, полученных in vivo, и эмбрионов IVP в мире начиная с 2000 года. Предоставлено Международным обществом переноса эмбрионов.
Таблица 81.3 Аномальные признаки, связанные с синдромом крупного плода при стельности после переноса эмбрионов IVP и у родившихся телят.
| Крупные телята |
|---|
| Увеличение продолжительности стельности |
| Снижение интенсивности родовой деятельности |
| Повышение частоты абортов |
| Повышение частоты врожденных пороков развития |
| Повышение перинатальной смертности |
| Повышение частоты гидроаллантоиса у реципиентов |
работы в Бразилии, где OPU/IVP теперь обеспечивает получение 91% эмбрионов (данные предоставлены компанией In Vitro Brazil).
В Нидерландах эмбрионы методом IVP получают из ооцитов, извлеченных методом OPU у молодых доноров без нарушений репродуктивной функции, и переносят непосредственно в хозяйствах по всей стране.90 В Японии производство эмбрионов методом IVF из яичников с боен поставлено на коммерческую основу; в некоторых случаях получено очень большое количество эмбрионов. Куваяма и соавт.91 описали получение более 150 000 замороженных эмбрионов IVP за 1-летний период из более чем 21 000 яичников крупного рогатого скота японской черной породы.
Стельность и потомство
Ряд авторов описал проблемы при стельности, наступившей после переноса эмбрионов крупного рогатого скота, полученных методом IVP.16,32,59,90,92 Одна из наиболее очевидных проблем — рождение телят крупнее нормы; это явление называют синдромом крупного потомства. Некоторые связанные с ним проблемы приведены в таблице 81.3.
Согласно ряду публикаций, средняя масса при рождении телят, полученных методом IVF, больше, чем у телят, полученных в результате искусственного осеменения (AI).90,93,94 Кроме того, Фарин и соавт.92 показали, что плоды 7-месячного возраста, развившиеся из эмбрионов после IVC, были тяжелее плодов, развившихся из эмбрионов, полученных in vivo. Другие исследования показывают, что сыворотка, совместное культивирование, IVM/IVF и среда матки способны влиять на развитие плода
