Воспроизводство крупного рогатого скота

способен отличить нормальные сперматозоиды от аномальных, мог бы удовлетворительно выполнить эту процедуру, важно уметь определять различные часто встречающиеся аномалии сперматозоидов и понимать их значение.

Приготовление препарата

Оценка морфологии сперматозоидов зависит от качества мазка спермы. Для его приготовления берут чистое тёплое предметное стекло; следует учитывать, что даже некоторые «новые» стёкла могут быть загрязнены моющими средствами и другими веществами, мешающими окрашиванию. На протяжении многих лет для окрашивания препаратов спермы использовали тушь. Она не окрашивает сами сперматозоиды, а создаёт тёмный фон, на котором видны неокрашенные белые клетки. В настоящее время для применения в полевых условиях рекомендуют витальный краситель эозин-нигрозин благодаря простоте использования и стабильности окрашивания. Эозин проникает в мёртвые сперматозоиды и окрашивает их в розовый цвет («красный — значит мёртвый»), тогда как живые клетки остаются неокрашенными (белыми) на тёмном фоне, который создаёт нигрозин. Мазок, окрашенный по методу Diff Quik, позволяет лучше различать лейкоциты; этот метод также подходит для оценки морфологии сперматозоидов. Ещё один полезный метод — окрашивание по Фёльгену. Сначала готовят мазок и дают ему высохнуть в течение часа. Затем помещают предметное стекло в 5 N раствор HCl на 30 мин. Стекло промывают в течение 2 мин, направляя струю воды в угол ёмкости для окрашивания, в которой оно находится. Затем стекло помещают в реактив Шиффа на 30 мин. После этого его снова промывают, как описано выше, и высушивают на воздухе. Окрашивание по Фёльгену лучше всего подходит для выявления дефекта в виде ядерной вакуоли («кратера»); кроме того, поскольку в ходе процедуры удаляются жировые глобулы, этот метод отлично подходит для окрашивания мазков разбавленной спермы.

Чтобы окрасить образец спермы, сначала наносят на предметное стекло небольшую каплю красителя, затем добавляют каплю спермы и смешивают их. Если сначала нанести сперму, а затем краситель, раствор красителя может загрязниться при случайном соприкосновении кончика флакона или пипетки со спермой. После смешивания красителя со спермой смесь распределяют по стеклу с помощью второго предметного стекла так же, как при приготовлении мазка крови. Поскольку для оценки лучше всего подходит тонкий край мазка, можно при распределении смеси несколько раз останавливать и возобновлять движение, создавая несколько участков с постепенным изменением толщины. Часто имеет смысл одновременно приготовить второй препарат: сделать сразу два быстрее, чем позднее возвращаться к приготовлению ещё одного, если первый окажется непригодным для диагностики (рисунок 8.5).

После высыхания стекла мазок можно исследовать с помощью фазово-контрастной или светлопольной микроскопии при увеличении 1000× (то есть с иммерсионным объективом светлопольного микроскопа).

Классификация аномалий сперматозоидов

Для более точного количественного учёта аномалий сперматозоидов было разработано несколько систем классификации.^6,11Обычно используют классификации «первичные/вторичные», «значительные/незначительные» и «компенсируемые/некомпенсируемые». Кроме того, можно отдельно подсчитывать сперматозоиды с каждым конкретным дефектом; так часто поступают, когда обследование быков на пригодность к воспроизводству (BBSE) проводят в диагностических целях. Такой подсчёт может быть трудоёмким, поскольку в настоящее время известно не менее 25 дефектов сперматозоидов.¹²

Система классификации аномалий сперматозоидов на первичные и вторичные, которой до сих пор пользуется SFT, относит аномалию к той или иной категории исходя из предполагаемого происхождения дефекта. Первичные аномалии возникают в семенниках или, точнее, в процессе сперматогенеза,¹³тогда как вторичные возникают в придатке семенника. Однако по мере развития знаний аномалии постоянно переклассифицируют; некоторые из них могут возникать на любом из этих двух этапов.⁶Кроме того, первичным аномалиям нередко придают большее значение, что может быть неоправданно в отношении отдельных дефектов (таблица 8.1).

Система классификации аномалий сперматозоидов на значительные и незначительные основана на их предполагаемом влиянии на оплодотворяющую способность.¹⁴Значительными называют дефекты, наличие которых в эякуляте снижает оплодотворяющую способность. Незначительные дефекты во время разработки этой классификации не считались особенно важными, но позднее было показано, что при достаточно большом количестве они также снижают оплодотворяющую способность. Примечательно, что появившиеся позднее категории первичных и вторичных аномалий, выделенные по предполагаемому происхождению дефектов, лишь незначительно отличаются от категорий значительных и незначительных аномалий, определённых Бломом.

Классификацию дефектов сперматозоидов, приводящих к снижению доли наступивших беременностей, на компенсируемые и некомпенсируемые предложили Сааккеи соавт. .¹⁵Проще говоря, компенсируемые дефекты в эякуляте или, точнее, в дозе спермы для осеменения — это дефекты, которые не снижают оплодотворяющую способность, если дополнительно присутствует достаточное количество нормальных сперматозоидов. Таким образом, влияние этих дефектов можно «компенсировать» как при естественной случке, так и при искусственном осеменении, если нормальные сперматозоиды присутствуют в достаточном количестве. К ним относятся, например, дефекты, нарушающие подвижность сперматозоидов или их способность преодолевать барьеры половых путей самки: из-за этого сперматозоиды либо не достигают яйцеклетки, либо достигают её, но не могут инициировать оплодотворение.¹⁶

Напротив, влияние некоторых аномалий нельзя компенсировать дополнительным количеством нормальных сперматозоидов, поэтому такие дефекты относят к некомпенсируемым. Сперматозоиды с этими дефектами способны достигнуть яйцеклетки и инициировать оплодотворение, но не способны обеспечить его дальнейшее развитие либо приводят к низкой жизнеспособности эмбриона.^15,16Эти сперматозоиды с некомпенсируемыми дефектами

Таблица 8.1Аномалии сперматозоидов по классификации Общества териогенологии.

конкурируют с нормальными сперматозоидами и часто лишают их возможности оплодотворить яйцеклетку. Таким образом, некомпенсируемый дефект теоретически снижает оплодотворяющую способность пропорционально доле сперматозоидов с этим дефектом в эякуляте или дозе спермы для осеменения.

Отнесение дефектов сперматозоидов к компенсируемым или некомпенсируемым осложняется тем, что, как и в случае других классификаций, новые научные данные, вероятно, приведут к пересмотру категорий некоторых дефектов; дополнительную сложность представляет мужское бесплодие в целом. Тем не менее такой подход к оценке аномалий чрезвычайно полезен: он помогает ветеринарному врачу определить прогностическое значение дефекта, часто встречающегося в эякуляте.

Оценку морфологии сперматозоидов дополнительно осложняет тот факт, что в одном эякуляте могут присутствовать морфологически нормальные сперматозоиды с повреждённым хроматином. Такие сперматозоиды относятся к категории некомпенсируемых дефектов: они способны оплодотворить яйцеклетку, но образующийся эмбрион часто бывает низкого качества. Однако о вероятном наличии сперматозоидов с повреждённым хроматином, но нормальным внешним видом можно судить по преобладанию в эякуляте морфологически аномальных клеток. Это подтверждено исследованиями с теплоизоляцией мошонки, которые показали, что возникающие дефекты зависят от стадии сперматогенеза в момент повреждающего воздействия¹⁷и что количество и виды наблюдаемых дефектов указывают на наличие ещё большего числа дефектных, но внешне нормальных сперматозоидов.¹⁵

Поэтому оптимальный подход состоит в понимании того, что аномальные сперматозоиды в эякуляте указывают либо на состояние семенников, влияющее на сперматогенез, либо на генетическую причину. Следует тщательно исследовать не менее 100 сперматозоидов при увеличении 1000× и признавать пригодными только тех быков, у которых доля нормальных сперматозоидов составляет не менее 70%.

другие некомпенсируемые дефекты следует тщательно изучать. Поэтому при оценке быка с пограничными показателями спермограммы разумно учитывать виды дефектов и их распространённость и, возможно, проявлять повышенную осторожность.

Нормальные сперматозоиды

Поскольку у ветеринарных врачей, проводящих базовое обследование племенного быка (BBSE), могут возникать разногласия при отнесении аномальных сперматозоидов к определённым категориям, способность точно установить процент нормальных сперматозоидов может быть важнейшим аспектом оценки спермограммы. Некоторые ветеринарные андрологи даже предлагали отказаться или допускали возможность отказа от классификации аномальных сперматозоидов в рамках стандартного BBSE (6).

Большинство наших клиентов и практически все студенты-ветеринары, рассматривая под увеличением окрашенную популяцию сперматозоидов, способны интуитивно распознать нормальный сперматозоид. Однако новичок или наблюдатель без специальной подготовки легко пропустит малозаметные аномалии и даже те, которые мы, ветеринарные врачи, не сочли бы столь уж малозаметными, например дефект в виде ядерной вакуоли. Поэтому необходимо подробно описать нормальный сперматозоид.

Для целей описания, а также для более точного определения локализации дефектов нормальный сперматозоид (рисунок 8.6) можно разделить на головку и хвост. Головка длиной 8–10 мкм, шириной 4–4.5 мкм и толщиной 1–1.5 мкм⁷ состоит из ядерного материала и акросомы. Хвост длиной приблизительно 40–45 мкм, в свою очередь, можно разделить на шейку, среднюю, главную и концевую части.

Как отмечалось ранее, при окрашивании витальным красителем, например эозином-нигрозином, мёртвые клетки поглощают краситель и выглядят розовыми, причём акросома окрашивается значительно слабее,

что позволяет различить части головки. Поскольку головка сперматозоида почти полностью состоит из хроматина, форма ядра коррелирует с фертильностью;¹⁸ более того, головки сперматозоидов высокофертильных быков весьма однородны по размеру.¹³

Аномалии сперматозоидов: классификация, этиология и прогностическое значение

BBSE по своей сути представляет собой прогностическую оценку. Поэтому ветеринарному врачу, проводящему обследование, полезно понимать этиологию и значение аномалий сперматозоидов. Цель этого раздела — дать справочные сведения о классификации, этиологии и прогностическом значении каждого из наиболее распространённых дефектов сперматозоидов.

Цитоплазматическая капля

Небольшое число сперматозоидов с такими дефектами может встречаться в эякуляте нормальных быков, особенно в период, близкий к половому созреванию. В норме цитоплазматические капли должны «сбрасываться» при прохождении сперматозоидов через придаток семенника. Проксимально расположенные цитоплазматические капли, или просто проксимальные капли, возникают вследствие нарушения спермиогенеза,¹³ имеют тестикулярное происхождение и, по-видимому, свидетельствуют о функциональной неполноценности сперматозоидов. У мужчин показано, что снижение фертильности при повышенном количестве цитоплазматических капель обусловлено более высоким уровнем денатурации ДНК сперматозоидов.¹¹ Дистально расположенные цитоплазматические капли (дистальные капли), как полагают, не имеют большого значения и происходят из придатка семенника. Таким образом, проксимальную каплю относят к первичным или значительным дефектам, а дистальную — к вторичным или незначительным.

Дефект в виде дистальной капли считается компенсируемым, а дефект в виде проксимальной капли — некомпенсируемым.^6,13 Однако в пользу возможности компенсации дефекта в виде проксимальной капли могут свидетельствовать результаты работы, в которой для оплодотворения in vitro использовали эякуляты с высоким или низким содержанием сперматозоидов с этим дефектом.¹⁹ В этом исследовании частота оплодотворения снижалась по мере увеличения доли проксимальных капель в эякуляте, но среди оплодотворённых яйцеклеток частота дробления была сходной (следует отметить, что в этом исследовании в каждой популяции сперматозоидов, контактировавших с яйцеклетками, присутствовали нормальные сперматозоиды).

Это наглядный пример сложности классификации дефектов сперматозоидов. Если исходить из основного критерия — снижения фертильности при том уровне выраженности дефекта, который наблюдается в эякуляте, — дефект в виде проксимальной капли однозначно является некомпенсируемым. Однако согласно другому общепринятому определению, некомпенсируемый дефект позволяет инициировать оплодотворение, но не обеспечивает нормального развития эмбриона. Поэтому отнесение дефекта в виде проксимальной капли к категории некомпенсируемых проблематично: упомянутое исследование¹⁹ подтвердило литературные данные¹³ о том, что сперматозоид с проксимальной каплей не способен оплодотворить яйцеклетку (рисунок 8.7).

Возможно, оптимальный подход — рассматривать этот дефект (проксимальную каплю) как клинический признак или «маркер» нарушения спермиогенеза, причиной которого может быть как незрелость, так и, напротив, дегенерация семенников. Поэтому обследование молодых быков можно отложить и провести повторно, поскольку улучшение спермограммы вероятно; у быков старшего возраста с этим дефектом прогноз восстановления фертильности более осторожный или неблагоприятный.

Дистальный изгиб средней части хвоста

Дистальный изгиб средней части хвоста (DMR) — наиболее распространённая аномалия хвоста сперматозоида.¹³Поскольку считается, что этот дефект возникает в придатке семенника, его относят к вторичным, а также к незначительным и компенсируемым дефектам. Он компенсируем, поскольку сперматозоиды с таким дефектом не обладают поступательной подвижностью. О его происхождении свидетельствует быстрое появление дефекта в эякуляте быков в течение нескольких дней после температурного воздействия. Дефект выглядит как резкий изгиб шпилькообразной формы в дистальном отделе средней части хвоста,²⁰ причём внутри изгиба находится цитоплазматическая капля. Если капли нет, вероятно, «изгиб» возник из-за контакта с гипотоническим раствором, предположительно использованным красителем. Этот дефект можно также выявить при оценке подвижности, поскольку такие сперматозоиды движутся назад (рисунок 8.8).

Основная причина — нарушение функции придатка семенника вследствие снижения уровня тестостерона, которое, в свою очередь, может быть вызвано стрессом, температурным стрессом (как при высокой, так и при низкой температуре), экзогенным эстрогеном или индуцированным гипотиреозом. Вместе с тем у нормальных фертильных быков доля сперматозоидов с этим дефектом в эякуляте может достигать 25%,¹³ предположительно благодаря его компенсируемому характеру. Однако если доля сперматозоидов с этим дефектом в эякуляте быка, соответствующего нормативным показателям, составляет 20–25%