Воспроизводство крупного рогатого скота

Считается, что в целом криозащитные агенты действуют за счет увеличения осмотического давления внеклеточной жидкости и, следовательно, вытягивают воду из сперматозоидов, тем самым снижая риск образования кристаллов льда и, следовательно, физического повреждения. Однако, они не облегчают, а могут даже усугублять проблему обезвоживания и увеличения концентрации растворенных веществ. Глицерин и диметилсульфоксид могут вызывать осмотический стресс и токсическое воздействие на сперматозоиды, степень которого варьируется в зависимости от вида и от их концентрации в растворе разбавителя.⁴⁴ Концентрация глицерина в разбавителе для оптимального криосохранения спермы быков колеблется от 6% до 9%, при этом верхние уровни вызывают повреждение сперматозоидов и снижают их выживаемость после оттаивания. При разработке разбавителей для спермы глицерин может быть добавлен сразу или позже в виде отдельной фракции после охлаждения спермы. В первой ситуации, также известной как одноэтапный метод, весь разбавитель вместе с глицерином объединяется после сбора спермы. Во второй ситуации или двухэтапном методе сначала присоединяется фракция разбавителя без глицерина. Затем следует охлаждение, после которого глицеринфракция добавляется непосредственно перед замораживанием спермы.⁵¹ Используемые протоколы ввода криопротекторов и замораживания в конечном итоге представляют собой компромисс между преимуществами и вредными последствиями их включения и могут варьироваться между отдельными племенными быками для получения оптимальных результатов.

Этапы криоконсервации спермы крупного рогатого скота

Процедуры криоконсервации спермы развивались в течение последних 50 лет. Однако, несмотря на постоянный прогресс в разработке новых наполнителей и криопротекторов, подвижность бычьей спермы после оттаивания остается на уровне около 50%. Это связано с тем, что криоконсервация спермы включает несколько общих этапов, из которых разбавление, криозащита, охлаждение и замораживание, хранение и оттаивание могут повлиять на структуру и функцию сперматозоидов.⁵² Считается, что сперма крупного рогатого скота относительно более устойчива к более высоким концентрациям криозащитных агентов и процессу замораживания.

Тем не менее, для оптимизации показателей подвижности после оттаивания и стабильности мембран, собранная сперма должна быть высокого качества, и следует уделять более пристальное внимание методам оценки качества семени, а не методам, которые выполняются во время рутинной оценки племенной устойчивости (BSE, по сути оценка фертильности на основе внешних параметров быка и его семени) . Также можно наблюдать индивидуальные различия, основанные на чувствительности спермы к разбавителям и методам замораживания у быков. Таким образом, необходимо делать поправки, упаковывая соломинки с большим количеством сперматозоидов или регулируя протоколы замораживания для отдельных быков.⁵³ Certified Semen Services Inc. (CSS), дочерняя компания, находящаяся в полной собственности Национальной ассоциации животноводов (NAAB), была создана для обеспечения стандартов и подлинности спермопродукции. Она также отвечает за распространение информации, касающейся обработки и обращения со спермой. В настоящее время существуют два стандартных протокола, одобренных CSS для коммерческого замораживания спермы крупного рогатого скота. Стандартный протокол CSS или двухэтапный метод является наиболее распространенным методом, используемым в Соединенных Штатах, тогда как одноэтапный метод (также известный как альтернативный протокол CSS) более популярен в Европе. Мы обычно используем двухэтапный метод замораживания спермы крупного рогатого скота, который будет описан позже более подробно.

Разбавление, начальное охлаждение и упаковка

После сбора и оценки сперму следует довести до соответствующего разведения / концентрации с использованием различных наполнителей / разбавителей. Стадия разбавления выполняется для минимизации любых потенциальных токсических эффектов семенной плазмы, для затормаживания сперматозоидов в замораживающем разбавителе и для увеличения объема семенной жидкости с целью максимального использования.⁵⁴ В успешных протоколах замораживания использовался широкий спектр разбавителей различного состава, но во всех случаях были одинаковые основные требования. Разбавитель должен поддерживать осмоляльность, pH и ионную силу (мера интенсивности электрического поля, создаваемого ионами в растворе) , обеспечивать энергетический субстрат, содержать криозащитный агент и, как правило, должен содержать антимикробные агенты. Ряд имеющихся в продаже разбавителей для спермы крупного рогатого скота, по-видимому, полностью удовлетворяют этим требованиям (таблица 71.1).

Таблица 71.1 Некоторые распространенные доступные разбавители для криоконсервации бычьей спермы и их компоненты.

a Яичный желток и вода должны быть включены перед добавлением спермы.

b Комбинация гентамицина сульфата, тилозина тартрата, линкомицина и спектиномицина. c Нет: одноэтапные разбавители требуют дополнительных количеств антибиотиков GTLS, обычно поставляемых производителем.

Наиболее часто используемые разбавители содержат трис-яичный желток / молоко-глицерин в качестве буферов и криозащитных агентов, хотя в настоящее время на рынке доступны несколько разбавителей, которые не содержат продукты животного происхождения, а вместо этого содержат фосфолипиды. Они были произведены с учетом текущей потребности в контроле болезней и, следовательно, не содержат биологически полученных веществ. Разбавители обычно доступны в виде смеси буферов и антибиотиков, к которым яичный желток добавляется во время разбавления семенной жидкости. Точно так же, в зависимости от процесса (одноэтапый или двухэтапный метод), глицериновая фракция разбавителя добавляется до или после рефрижерации и охлаждения разбавленной спермы. Используемый чаще двухэтапный протокол дает конечную концентрацию 20% яичного желтка, 7% глицерина, 50 мкг тилозина, 250 мкг гентамицина, 150 мкг линкомицина и 300 мкг спектиномицина в каждом миллилитре разбавленной замороженной спермы. Одноэтапный протокол дает концентрацию антибиотика в два раза больше, чем при двухэтапной процедуре. Степень разведения спермы крупного рогатого скота может варьироваться в зависимости от концентрации сперматозоидов в эякуляте. В целом, высокой степени разбавления (обычно 1: 5 сперма / разбавитель) как правило достаточно, поскольку дозы осеменения, используемые для оплодотворения крупного рогатого скота, на удивление низкие (обычно 10-15 миллионов) по сравнению с дозами, необходимыми для других видов, таких как лошади и свиньи. Однако, следует быть внимательным, чтобы соблюсти соответствующие объем и концентрацию разбавителя, поскольку чрезмерное разбавление может фактически привести к потере подвижности и усилению прижизненного окрашивания (метод окрашивания организмов или живых препаратов их тканей для повышения контраста при наблюдении под микроскопом) .⁵⁵ Это явление известно как «эффект разбавления» и представляет собой потерю жизнеспособности клеток, вероятно, из-за вымывания структурных компонентов клеточной мембраны.⁵⁶ Количественная разница в соотношении спермы к разбавителю между видами является важным фактором, определяющим фертильность криоконсервированной спермы.⁴ У видов, у которых для зачатия требуется большое количество сперматозоидов, степени разбавления соответственно низкие, что означает, что сперматозоиды более плотно расфасованы, что приводит к снижению устойчивости к процессу криоконсервации и к низкой выживаемости.

Разбавленную таким образом сперму затем медленно охлаждают до 4 ° C в течение 2-х часов. Это помогает значительно снизить скорость метаболизма сперматозоидов и минимизировать повреждения от холодового шока, возникающие, когда сперма охлаждается ниже 15°C.⁵⁴ Считается, что скорость метаболизма удваивается с повышением температуры на каждые 10 °C; следовательно, охлаждение спермы с температуры тела (около 39 °C) до температуры холодильника (4 °C) снижает скорость метаболизма примерно до одной десятой по сравнению со скоростью метаболизма при температуре тела. Хотя сперматозоиды быков чувствительны к охлаждению до низких температур, фосфолипидные компоненты, присутствующие в яичном желтке и сывороточные белки в обезжиренном молоке, играют важную роль в уменьшении повреждений, а также обеспечивают более быстрое охлаждение. Как только частично разбавленная сперма достигает температуры выдержки - 4 °C, ее разбавляют до конечной желаемой концентрации путем добавления фракции глицерина, если соблюдается двухэтапный протокол криоконсервации. (Обратите внимание, что в одноэтапном протоколе сперма доводится до желаемой концентрации и включает добавление глицерина перед процессом охлаждения.) Этап, связанный с добавлением глицерина, иногда ошибочно называют периодом уравновешивания глицерина (равномерное его распределение) . Поскольку глицерин обладает способностью довольно быстро проникать через клеточную мембрану при 5 °C, его можно добавить в любое время в течение периода охлаждения.^21,57 Считается, что период уравновешивания включает процесс стабилизации мембраны.

Таким образом, сперма, доведенная до соответствующей концентрации, содержит около 7% глицерина, и ее дополнительно выдерживают при 4 °C в течение нескольких часов. В течение этого периода выдержки сперма может быть расфасована, упакована и запечатана в поливиниловые соломинки 0,25 или 0,5 мл (стандартный размер, используемый в США) для дальнейшей обработки (рис. 71.1). Все процедуры, связанные с обращением с охлажденной спермой, выполняются в холодильном шкафу, чтобы поддерживать температуру уравновешивания спермы (рис. 71.2).

Скорость охлаждения и замораживания

В процессе замораживания и оттаивания сперматозоиды подвергаются повреждениям, вызванным быстрыми и резкими изменениями физикохимических условий, происходящих во время охлаждения и образования льда. Степень повреждения, вызванного этими резкими изменениями, сильно зависит от скорости охлаждения и состава криозащитной среды. Скорость охлаждения при криоконсервации спермы была определена для разных домашних животных и людей, иногда вместе с концентрацией криопротектора. Оптимальная скорость в идеале должна быть ни слишком быстрой, ни слишком медленной. В процессе охлаждения и замораживания первое изменение, с которым должны справиться сперматозоиды, - это снижение температуры до точки, близкой к точке замерзания воды.^1,6 Во время медленного охлаждения спермы (0,5–1 °C / мин) снижение температуры вызывает напряжение на мембранах, вероятно, связанное с фазовыми изменениями в липидных бислоях и изменением функционального состояния мембран.⁶

Считается, что это нарушает функцию мембранных белков, которые необходимы для структурной целостности (цитоскелет) или ионного метаболизма (ионные насосы).⁶ Основные изменения в сперматозоидах быков во время этой фазы происходят при температуре около 15–5 °C, но не происходят при температуре ниже 0 °C.⁶ Второе важное изменение в окружающей среде совпадает с образованием кристаллов льда после охлаждения раствора до температуры от –5 до –15 ° C. Высвобождение «скрытой теплоты плавления» (тепло, выделяемое при переходе из жидкой фазы в твердую или поглощаемое при переходе в обратном направлении) затем вызывает резкое нагревание образца до тех пор, пока не будет достигнута температура замерзания/таяния раствора (оставшейся незамерзшей фракции).⁶ Это приводит к самопроизвольному зарождению (нуклеации) льда, поскольку раствор переохлажден и кристаллы льда затем быстро растут во всех направлениях. Образование льда будет зависеть от скорости дальнейшего охлаждения среды, и остается так называемая незамерзшая фракция, в которой находятся все растворенные вещества. Осмоляльность этой фракции увеличивается из-за повышенной концентрации глицерина, сахаров и солей и вызывает быстрый отток воды из клеток или клеточную дегидратацию. Фактически, быстрое охлаждение на такой стадии может привести к очень внезапным изменениям размера, формы и ультраструктуры клеток, а также к структурной деформации. Сперматозоиды могут оказаться ограниченными очень узкими каналами незамерзшего раствора, зажатыми между растущими массами льда, что также может привести к механическому стрессу в клетках. По мере дальнейшего охлаждения эти процессы продолжаются до тех пор, пока вязкость незамороженной фракции не станет слишком высокой для дальнейшей кристаллизации. Двухфакторная теория объясняет влияние скорости охлаждения на сперматозоиды.^58,59 Медленные скорости охлаждения подвергают сперматозоиды влиянию "эффекта «растворения», при котором происходит увеличение концентрации соли, увеличение осмоляльности и изменение pH, тогда как высокие скорости могут не позволить внутриклеточной воде выйти, что приведет к нуклеации внутриклеточного льда. Оптимальная скорость охлаждения спермы перед замораживанием у домашних животных обычно находится в диапазоне 10–100 ° C/мин⁵⁴ и способствует хорошей выживаемости после оттаивания. У быков скорость охлаждения может составлять от 50 до 60 °C/мин, хотя Woelders и др.¹³ предложили скорость охлаждения до 100 °C/мин с оптимальными результатами. Одним из преимуществ таких высоких скоростей охлаждения может быть снижение концентрации глицерина в среде, поскольку считается, что глицерин защищает от повреждающих эффектов при медленном охлаждении. Это также поможет избежать осмотического повреждения, вызванного высокими концентрациями глицерина, которые в настоящее время используются для замораживания спермы крупного рогатого скота. Однако, существуют технические трудности в достижении такой равномерной скорости охлаждения соломинок независимо от их положения в морозильных аппаратах.¹³ В настоящее время доступны два варианта замораживания бычьей спермы: контролируемое замораживание с использованием автоматических программируемых морозильников и традиционное вейперное замораживание (непрограммируемое) путем удерживания соломинок со спермой над парами жидкого азота в определенное время и на определенном расстоянии. Коммерческие аппараты для замораживания спермы (рис. 71.3) позволяют точно контролировать температуру внутри охлаждающей камеры, а также программировать изменение температуры во времени. Однако, поскольку соломинки со спермой размещаются более чем в одном слое, это способствует значительному изменению скорости охлаждения в отдельных слоях в течение цикла замораживания, и изменение температуры внутри соломинок во времени может быть различным из-за генерации скрытой теплоты плавления.

Кроме того, программируемые морозильные камеры более дорогостоящие и не обязательно дают более удовлетворительные результаты, особенно для опытных техников и криобиологов. Традиционное замораживание паром или непрограммируемое замораживание может быть выполнено путем частичного заполнения невентилируемой коробки из пенополистирола жидким азотом и замораживания соломинок, расположенных на решетке, помещенной внутри коробки (рис. 71.4). Высота соломинок над жидким азотом определяет скорость теплообмена, при этом скорость снижения температуры составляет от 150 до 300 °C/мин. Кроме того, преимущество традиционных морозильных камер заключается в том, что все соломинки в любом заданном цикле замораживания подвергаются одинаковой скорости охлаждения, поскольку соломинки размещаются в один слой над уровнем жидкого азота. В непрограммируемых морозильных камерах кривая охлаждения (время охлаждения и замораживания) по умолчанию имеет форму, которая теоретически считается оптимальной для медленного замораживания.⁶⁰ Это приводит к относительно низким скоростям охлаждения сразу после начала образования льда и более высоким скоростям охлаждения позже. В непрограммируемых системах общую крутизну кривой замораживания можно регулировать, выбирая высоту расположения соломинок над жидким азотом, которая пропорциональна температуре пара вокруг соломинок.