Воспроизводство крупного рогатого скота

Оттаивание и хранение спермы

Замороженные сперматозоиды могут быть повреждены в процессе оттаивания, так как процессы в клетках имевшие место во время замораживания происходят с точностью наоборот. Во время медленного оттаивания может происходить рекристаллизация ультрамикроскопических кристаллов льда с образованием сравнительно крупных кристаллов льда^6,13 , когда сперматозоиды проходят через критическую температурную зону от –5 до –15 °C⁶¹ , и они могут повредить сперматозоиды. Более быстрая скорость оттаивания (оптимально: 37 °C в течение как минимум 45 с) ограничивает время перекристаллизации и, таким образом, увеличивает выживаемость сперматозоидов. Однако, когда продолжительность оттаивания недостаточна для оттока избытка криопротектора из клетки, она испытывает осмотический стресс, и сперматозоиды набухают и лизируются, поскольку среда резко разбавляется за счет таяния внеклеточного льда.⁶² На скорость оттаивания могут влиять такие факторы, как температура и характер окружающей среды (воздух или вода в термостате), а также теплопроводность упаковки в зависимости от диаметра просвета упаковки (соломинки) . Более быстрая скорость оттаивания может быть достигнута за счет использования более высоких температур в течение более коротких периодов времени (например, 65 ° C в течение 5 с); но необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать перегрева спермы.

Правильное хранение соломинок со спермой и обращение с ними - решающий фактор, который может оказывать сильное влияние на успех любой программы искусственного осеменения. Сперма обычно фасуется в соломинки объемом 0,5 мл, хотя некоторые организации (особенно в Европе) предпочитают упаковку в соломинки объемом 0,25 мл. Независимо от размера процедура обработки одинакова, и соломинки обычно помещают в стаканчики, которые, в свою очередь, прикрепляют к металлической трости. Трости соответственно идентифицируются по кличке быка или идентификационному номеру и хранятся в канистрах специально разработанных резервуаров (сосудов) с жидким азотом. Хотя подробное описание конструкции резервуара с жидким азотом выходит за рамки данной главы, необходимость надлежащего ухода за ним при хранении и обращении невозможно переоценить. Хотя резервуары для спермы сконструированы прочными, они более хрупкие, чем кажутся, и требуют регулярной проверки и внимания, чтобы продлить их срок службы. Невыполнение этого требования может привести к потере или снижению оплодотворяемости из-за ухудшения качества спермы. Сосуды следует хранить в сухом, хорошо освещенном и хорошо проветриваемом помещении, вдали от прямых солнечных лучей. Их следует держать на возвышении над бетонным полом или другими влажными и плохо вентилируемыми поверхностями, поскольку коррозия внешней оболочки сокращает срок службы резервуара и может привести к выходу его из строя. Одним из основных внешних признаков неисправности резервуара является нарастание инея (особенно вокруг горловины), указывающее на потерю вакуума. Уровень жидкого азота в резервуарах необходимо регулярно контролировать и при необходимости доливать. При извлечении соломинок из сосуда канистры должны удерживаться как можно ниже, чтобы поддерживать температуру соломинок на постоянном уровне –196 °C. Если соломинку невозможно извлечь или обнаружить в канистрах менее чем за 10 с, канистру следует опустить обратно в резервуар и выдержать не менее 20 с для повторного охлаждения перед повторной попыткой.

Пошаговая процедура двухэтапного протокола

криоконсервации спермы крупного рогатого скота

Обратите внимание: если инструкции для шприца-катетера, поставляемого производителем, отличаются, рекомендуется следовать им.

1. Подготовьте фракцию A (содержащую буферы с добавлением 200 г яичного желтка) разбавителя и поместите в инкубатор перед сбором спермы. Поместите фракцию B (содержащую глицерин) разбавителя в холодильник.

2. После исследования и оценки качества и концентрации спермы медленно разбавьте сперму небольшим объемом подогретого разбавителя фракции А в 50-мл колбе. В зависимости от рассчитанного количества обрабатываемых соломинок эякулят может быть увеличен фракцией А до 50% расчетного конечного объема.

3. Разбавленную сперму можно охладить до 4 ° C, сначала выдерживая при комнатной температуре, а затем поместив в холодильник или холодное помещение. Образец следует выдержать при температуре 4 °C не менее 2-х часов. Разбавленная сперма также может быть помещена в водяную баню с той же температурой, а затем помещена для охлаждения до 4 °C. Это помогает со скоростью охлаждения.

4. Фракцию B, которая предварительно была охлаждена до 4 °C, теперь можно добавлять в разбавленную охлажденную сперму в соотношении 1:1 постепенно в течение 20 минут.

5. Сперма, достигшая конечной концентрации, должна быть снова помещена в холодное помещение или шкаф для уравновешивания (равномерного распределения разбавителя) на 4 часа. В это время маркируют соломинки, указывая соответствующую информацию (например, порода, регистрационный номер, кличка, дата). Их заполняют, запечатывают и кладут на стеллажи для замораживания и подсчета. Соломинки следует встряхнуть так, чтобы после заполнения и перед замораживанием пузырек воздуха находился в центре. Все процедуры следует проводить при температуре 4 °C в холодном помещении или холодильнике.

6. Соломинки замораживают, помещая их на решетку на расстоянии 5 см над уровнем жидкого азота в герметичном контейнере из пенополистирола. Таким образом, они выдерживаются над парами жидкого азота в течение примерно 15 минут, а затем погружаются в жидкий азот (рис. 71.5).

7. Затем соломинки загружают в трости (с информацией о быке) и переносят в канистры с жидким азотом. Следует разморозить одну соломинку, чтобы оценить ее подвижность и концентрацию. В идеале концентрация в каждой соломинке должна быть равна одной дозе осеменения (10–15 миллионов сперматозоидов). Она может быть скорректирована с учетом данных о фертильности быка, если таковые имеются.

Современные достижения в технологии

криоконсервации семени крс

За прошедшие годы появилось несколько достижений в области криобиологии, которые принесли огромную пользу индустрии ИО крупного рогатого скота. Они привели к разработке превосходных разбавителей спермы, стандартизированных оптимальных протоколов замораживания, прогнозированию оплодотворяющей способности сперматозоидов с помощью различных тестов на их жизнеспособность и лучшему пониманию патофизиологии повреждения сперматозоидов, связанного с криоконсервацией.

Современная потребность в борьбе с болезнями и отказе от применения биологических веществ животного происхождения в криозащитных средах привели к разработке разбавителей спермы на основе кокосового молока и соевого лецитина, которые, как было показано, обладают сходными с яичным желтком и обезжиренным молоком защитными свойствами. Было показано, что такие вещества, как синтетические липосомы⁶³ и нагруженные холестерином циклодекстрины⁶⁴ , обеспечивают лучшую защиту сперматозоидов во время криоконсервации и повышают выживаемость после размораживания. Также было исследовано добавление таких веществ, как антиоксиданты, к разбавителям спермы для ее защиты от активных форм кислорода и, в конечном итоге, от повреждений, связанных с перекисным окислением липидов. Куркумин (обладает антиоксидантными св-ми) , эритритол (сахарозаменитель)⁶⁵ и n-3 жирные кислоты в сочетании с α- токоферолом⁶⁶ показали многообещающие результаты касательно лучшей криовыживаемости сперматозоидов за счет изменения липидного состава мембран. Было показано, что добавление антиоксидантов, таких как метионин, карнитин и инозитол до начала процесса криоконсервации, предохраняет структуру ДНК от криоповреждений.⁶⁷

Недавние достижения в технологиях сублимационной сушки ( лиофилизации) сперматозоидов лошадей и последующее рождение живых жеребят от такого семени⁶⁸ открыли совершенно новую перспективу криоконсервации спермы. Хотя живых телят пока не поступало, лиофилизация бычьей спермы может предложить привлекательную альтернативу хранению спермы в жидком азоте. Поскольку лиофилизированная сперма может оплодотворять ооцит только с помощью таких процедур, как внутрицитоплазматическая инъекция спермы, и требует меньшего количества спермиев на дозу, количество доз, полученных на один эякулят, может буквально исчисляться сотнями тысяч. Лиофилизация спермы также может помочь преодолеть несколько недостатков, связанных с традиционным способом криоконсервации, таких как высокие затраты на техническое обслуживание, проблемы, связанные с транспортировкой замороженной спермы, а также случайные потери из-за неправильного контроля температуры.

Ссылки

1. Medeiros C, Forell F, Oliveira A, Rodrigues J. Современное состояние криоконсервации спермы: почему результаты не лучше? Theriogenology 2002;57:327–344.

2. Stewart D. Хранение сперматозоидов быка при низких температурах. Vet Rec 1951;63:65–66.

3. Bratton R, Foote R, Cruthers J. Предварительные результаты оценки оплодотворяющей способности замороженных сперматозоидов крупного рогатого скота. J Dairy Sci 1955;38:40–46.

4. Holt W. Основные аспекты хранения замороженной спермы. Anim Reprod Sci 2000;62:3–22.

5. Batellier F, Vidament M, Fauquant J и др. Достижения в технологии охлаждения спермы. Anim Reprod Sci 2001;68:181–190.

6. Watson P. Причины снижения оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы. Anim Reprod Sci 2000;60:481–492.

7. Mullen S, Critser J. Научные основы криобиологии. Cancer Treat Res 2007;138:83–109.

8. Salamon S, Maxwell W. Хранение спермы баранов. Anim Reprod Sci 2000;62:77–111.

9. Hammerstedt R, Andrews J. Поддержание метаболизма при нормотермии. В кн.: Karow A, Critser JK (ред.) Банкирование репродуктивных тканей . Сан-Диего, Калифорния: Academic Press, 1997, с. 136–166.

10. Gao D, Mazur P, Critser J. Основы криобиологии сперматозоидов млекопитающих. В кн.: Karow A, Critser JK (ред.) Банкирование репродуктивных тканей . Сан-Диего, Калифорния: Academic Press, 1997, с. 263–327.

11. Isachenko E. Витрификация сперматозоидов млекопитающих без криопротекторов: от прежних практических трудностей к нынешним успехам. Reprod BioMed Online 2003;6:191–200.

12. White I. Липиды и поглощение кальция сперматозоидами в связи с холодовым шоком и сохранением спермы: обзор. Reprod Fertil Dev 1993;5:639–658.

13. Woelders H, Mathiijs A, Engel B. Влияние трегалозы, сахарозы, осмоляльности среды для замораживания и скорости охлаждения на жизнеспособность и целостность сперматозоидов быка после замораживания и оттаивания. Cryobiology 1997;35:93–105.

14. De Leeuw F, Colenbrander B, Verkleij A. Роль повреждения мембран при холодовом шоке и повреждении вследствие замораживания. Reprod Domest Anim 1991;1:95–104.

15. Bailey J, Buhr M. Криоконсервация изменяет поток Ca2⁺ через мембрану сперматозоидов быка. Can J Anim Sci 1994;74:45–52.

16. Concannon P, Battista M. Замораживание спермы собак и искусственное осеменение. В кн.: Kirk RW, Bonagura JD (ред.) Современная ветеринарная терапия X . Филадельфия: WB Saunders, 1989, с. 1247–1258.

17. Phillips P. Сохранение спермы быков. J Biol Chem 1939;130:415.

18. Dunn H, Bratton R, Collins W. Оплодотворяющая способность и подвижность сперматозоидов быка в разбавителях на основе цельного яйца с буферными добавками. J Dairy Sci 1950;33:434–437.

19. Shannon P, Curson B. Влияние содержания яичного желтка на оплодотворяющую способность разбавленной спермы быков при хранении при температуре окружающей среды. NZ J Agric Res 1983;26:187–189.

20. Barak Y, Amit A, Lessing J, Paz G, Hommonai Z, Yogev L. Повышение частоты оплодотворения в программе экстракорпорального оплодотворения при использовании сперматозоидов, обработанных яичным желтком. Fertil Steril 1992;58:197–198.

21. De Leeuw F, De Leeuw A, Den Daas J, Colenbrander B, Verkleij A. Влияние различных криопротекторов и мембраностабилизирующих соединений на целостность мембран сперматозоидов быка после охлаждения и замораживания. Cryobiology 1993;30:32–44.

22. Pickett B, Berndtson W. Принципы и методы замораживания сперматозоидов. В кн.: Salisbury GW, VanDemark NL, Lodge JR (ред.) Физиология размножения и искусственное осеменение крупного рогатого скота , 2-е изд. Сан-Франциско: WH Freeman, 1978, с. 494–554.

23. Smith R, Berndston W, Unal M, Picket B. Влияние процентного содержания яичного желтка при охлаждении и замораживании на выживаемость сперматозоидов быка. J Dairy Sci 1979;62:1297–1303.

24. Moussa M, Martinet V, Trimeche A, Tainturier D, Anton M. Липопротеины низкой плотности, выделенные из желтка куриных яиц простым методом: криопротекторное действие при замораживании и оттаивании спермы быков. Theriogenology 2002;57:1695–1706.

25. Amirat L, Tainturier D, Jeanneau L и др. Оплодотворяющая способность спермы быков in vitro после криоконсервации с использованием липопротеинов низкой плотности яичного желтка. Сравнение с коммерческим разбавителем на основе яичного желтка Optidyl. Theriogenology 2004;61:895–907.

26. Almquist J, Flipse R, Thacker D. Разбавители спермы быков. IV. Оплодотворяющая способность сперматозоидов быка в нагретом гомогенизированном и обезжиренном молоке. J Dairy Sci 1954;37:1303–1307.

27. Chen Y, Foote RH, Tobback C, Zhang L, Hough S. Выживаемость сперматозоидов быка при замораживании с разными скоростями и предварительном внесении центров кристаллизации в разбавителях на основе яичного желтка и триса и цельного молока. J Dairy Sci 1993;76:1028–1034.

28. Foote R. Оплодотворяющая способность спермы быков при высокой степени разбавления в разбавителях с трис-буфером. J Dairy Sci 1970;53:1475–1477.

29. Quinn P, Chow P, White I. Доказательства того, что фосфолипид защищает сперматозоиды барана от холодового шока, действуя на плазматическую мембрану. J Reprod Fertil 1980;60:403–407.

30. Foulkes J. Выделение липопротеинов из яичного желтка и их влияние на подвижность и целостность сперматозоидов быка. J Reprod Fertil 1977;49:277–284.

1. Graham J, Foote R. Влияние различных липидов, длины ацильной цепи жирных кислот и степени ненасыщенности на подвижность сперматозоидов быка после холодового шока и замораживания. Cryobiology 1987;24:42–52.

2. Vishwanath R, Shannon P, Curson B. Катионные экстракты яичного желтка и их влияние на подвижность, выживаемость и оплодотворяющую способность сперматозоидов быка. Anim Reprod Sci 1992;29:185–194.

3. Manjunath P, Nauc V, Bergeron A, Ménard M. Основные белки семенной плазмы быков связываются с фракцией липопротеинов низкой плотности желтка куриных яиц. Biol Reprod 2002;67:1250–1258.

4. Manjunath P. Новые представления о механизме защиты сперматозоидов компонентами разбавителей. Anim Reprod Sci 2012;9:809–815.

5. Singh V, Singh A, Kumar R, Atreja S. Разработка разбавителя на основе соевого молока для криоконсервации спермы крупного рогатого скота помеси каран-фриз. Cryo Letters 2013;34:52–61.

6. Ford W. Гликолиз и подвижность сперматозоидов: помогает ли ложка сахара жгутику двигаться? Hum Reprod Update 2006;12:269–274.

7. Nicolajsen H, Hvidt A. Фазовое поведение системы трегалоза–NaCl–вода. Cryobiology 1994;31:199–205.

8. Shin S, Lein D, Patten V, Ruhnke H. Новая комбинация антибиотиков для замороженной спермы быков: 1. Борьба с микоплазмами, уреаплазмами, Campylobacter fetus подвида venerealis и Haemophilus somnus . Theriogenology 1988;29:577–591.

9. Lorton S, Sullivan J, Bean B, Kaproth M, Kellgren H, Marshall C. Новая комбинация антибиотиков для замороженной спермы быков: 2. Оценка качества спермы . Theriogenology 1988;29:593–607.

10. González-Marín C, Roy R, López-Fernández C и др. Бактерии в сперме быков могут повышать степень фрагментации ДНК сперматозоидов: экспериментальное исследование динамики процесса. Anim Reprod Sci 2011;123:139–148.

11. Gonzalez-Marín C, Kjelland M, Roy R и др. Применение хинолонов в разбавителях спермы быков для уменьшения повреждения ДНК сперматозоидов. Am J Anim Vet Sci 2012;7:180–185.

12. Polge C, Smith A, Parkes A. Восстановление жизнеспособности сперматозоидов после витрификации и обезвоживания при низких температурах. Nature 1949;164:666.

13. Watson P. Изучение взаимодействия яичного желтка и сперматозоидов барана с помощью флуоресцентного зонда. J Reprod Fertil 1975;42:105–111.

14. Purdy P. Обзор криоконсервации спермы козлов. Small Ruminant Res 2006;63:215–225.

15. Amann R. Криоконсервация сперматозоидов. В кн.: Knobil E, Neill JD (ред.) Энциклопедия репродукции . Сан-Диего, Калифорния: Academic Press, 1999, с. 773–783.

16. Kundu C, Chakraborty J, Dutta P, Bhattacharyya D, Ghosh A, Majumder G. Влияние декстранов на криоконсервацию сперматозоидов из хвоста придатка семенника козлов с использованием среды с определённым химическим составом. Reproduction 2002;123:907–913.

17. Jayendran R, Graham E. Оценка криозащитных соединений при криоконсервации сперматозоидов быков. Cryobiology 1980;17:458–464.

18. Forero-Gonzalez R, Celeghini E, Raphael C, Andrade A, Bressan F, Arruda R. Влияние различных методов замораживания и криозащитных веществ при криоконсервации спермы быков на плазматическую, акросомную и митохондриальную мембраны. Andrologia 2012;44:154–159.

19. Amann R, Pickett B. Принципы криоконсервации и обзор криоконсервации сперматозоидов жеребцов. J Equine Vet Sci 1987;7:145–173.

20. Watson P, Duncan A. Влияние концентрации солей и доли незамёрзшей воды на жизнеспособность сперматозоидов баранов при медленном замораживании. Cryobiology 1988;25:131–142.

21. Barbas J, Mascarenhas R. Криоконсервация сперматозоидов домашних животных. Cell and Tissue Banking 2009;10:49–62.

22. Hammerstedt R, Graham J, Nolan P. Криоконсервация сперматозоидов млекопитающих: что им приходится выдерживать. J Androl 1990;11:73–88.

23. Parkinson T, Whitfield C. Оптимизация условий замораживания сперматозоидов быков Theriogenology 1987;27:781–797.

24. Curry M. Криоконсервация сперматозоидов млекопитающих. В кн.: Day JG, Stacey G (ред.) Протоколы криоконсервации и сублимационной сушки , 2-е изд. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press, 2007, с. 303–311.

25. Mann T. Биохимия спермы и мужского репродуктивного тракта , 2-е изд. Лондон: Methuen, 1964.

26. Parkinson T. Искусственное осеменение. В кн.: Noakes DE, Parkinson TJ, England GCW (ред.) Ветеринарная репродукция и акушерство , 9-е изд. Филадельфия: Saunders Elsevier, 2009, с. 765–806.

27. Martin I. Влияние охлаждения до 58 °C, хранения при 58 °C, концентрации глицерина, хлорида натрия, фруктозы и глицина на восстановление жизнеспособности сперматозоидов после глубокого замораживания. J Agric Sci 1965;64:425–432.

28. Mazur P. Кинетика потери воды клетками при температурах ниже нуля и вероятность внутриклеточного замерзания. J Gen Physiol 1963;47:347–369.

29. Mazur P, Leibo S, Chu E. Двухфакторная гипотеза повреждения при замораживании. Exp Cell Res 1972;71:345–355.

30. Woelders H, Chaveiro A. Теоретическое прогнозирование «оптимальных» программ замораживания. Cryobiology 2004;49:258–271.

31. Kumar S, Millar J, Watson P. Влияние скорости охлаждения на выживаемость сперматозоидов быка, барана и хряка при криоконсервации: сравнение двух аппаратов с регулируемой скоростью охлаждения. Cryobiology 2003;46:246–253.

32. Pegg D. История и принципы криоконсервации. Semin Reprod Med 2002;20:5–13.

33. Röpke T, Oldenhof H, Leiding C, Sieme H, Bollwein H, Wolkers W. Липосомы для криоконсервации спермы быков. Theriogenology 2011;76:1465–1472.

34. Purdy P, Graham J. Влияние циклодекстрина, насыщенного холестерином, на выживаемость сперматозоидов быка после криоконсервации. Cryobiology 2004;48:36–45.

35. Bucak MN, Başpınar N, Tuncer PB и др. Влияние куркумина и дитиоэритритола на сперму быков после замораживания и оттаивания. Andrologia 2012;44:102–109.

36. Nasiri AH, Towhidi A, Zeinoaldini S. Совместное влияние добавления DHA и α-токоферола при криоконсервации спермы быков на характеристики сперматозоидов и жирнокислотный состав. Andrologia 2012;44:550–555.

37. Bucak MN, Tuncer PB, Sarıözkan S и др. Влияние антиоксидантов на сперматозоиды быков после оттаивания и показатели окислительного стресса: антиоксиданты защищают целостность ДНК от повреждения при криоконсервации. Cryobiology 2010;61:248–253.

38. Choi Y, Varner D, Love C, Hartman D, Hinrichs K. Получение живых жеребят путём интрацитоплазматической инъекции лиофилизированных сперматозоидов и экстракта сперматозоидов у лошадей. Reproduction 2011;142:529–538.