Воспроизводство крупного рогатого скота

Наиболее часто используемые разбавители содержат трис-яичный желток / молоко-глицерин в качестве буферов и криозащитных агентов, хотя в настоящее время на рынке доступны несколько разбавителей, которые не содержат продукты животного происхождения, а вместо этого содержат фосфолипиды. Они были произведены с учетом текущей потребности в контроле болезней и, следовательно, не содержат биологически полученных веществ. Разбавители обычно доступны в виде смеси буферов и антибиотиков, к которым яичный желток добавляется во время разбавления семенной жидкости. Точно так же, в зависимости от процесса (одноэтапый или двухэтапный метод), глицериновая фракция разбавителя добавляется до или после рефрижерации и охлаждения разбавленной спермы. Используемый чаще двухэтапный протокол дает конечную концентрацию 20% яичного желтка, 7% глицерина, 50 мкг тилозина, 250 мкг гентамицина, 150 мкг линкомицина и 300 мкг спектиномицина в каждом миллилитре разбавленной замороженной спермы. Одноэтапный протокол дает концентрацию антибиотика в два раза больше, чем при двухэтапной процедуре. Степень разведения спермы крупного рогатого скота может варьироваться в зависимости от концентрации сперматозоидов в эякуляте. В целом, высокой степени разбавления (обычно 1: 5 сперма / разбавитель) как правило достаточно, поскольку дозы осеменения, используемые для оплодотворения крупного рогатого скота, на удивление низкие (обычно 10-15 миллионов) по сравнению с дозами, необходимыми для других видов, таких как лошади и свиньи. Однако, следует быть внимательным, чтобы соблюсти соответствующие объем и концентрацию разбавителя, поскольку чрезмерное разбавление может фактически привести к потере подвижности и усилению прижизненного окрашивания (метод окрашивания организмов или живых препаратов их тканей для повышения контраста при наблюдении под микроскопом) .⁵⁵ Это явление известно как «эффект разбавления» и представляет собой потерю жизнеспособности клеток, вероятно, из-за вымывания структурных компонентов клеточной мембраны.⁵⁶ Количественная разница в соотношении спермы к разбавителю между видами является важным фактором, определяющим фертильность криоконсервированной спермы.⁴ У видов, у которых для зачатия требуется большое количество сперматозоидов, степени разбавления соответственно низкие, что означает, что сперматозоиды более плотно расфасованы, что приводит к снижению устойчивости к процессу криоконсервации и к низкой выживаемости.

Разбавленную таким образом сперму затем медленно охлаждают до 4 ° C в течение 2-х часов. Это помогает значительно снизить скорость метаболизма сперматозоидов и минимизировать повреждения от холодового шока, возникающие, когда сперма охлаждается ниже 15°C.⁵⁴ Считается, что скорость метаболизма удваивается с повышением температуры на каждые 10 °C; следовательно, охлаждение спермы с температуры тела (около 39 °C) до температуры холодильника (4 °C) снижает скорость метаболизма примерно до одной десятой по сравнению со скоростью метаболизма при температуре тела. Хотя сперматозоиды быков чувствительны к охлаждению до низких температур, фосфолипидные компоненты, присутствующие в яичном желтке и сывороточные белки в обезжиренном молоке, играют важную роль в уменьшении повреждений, а также обеспечивают более быстрое охлаждение. Как только частично разбавленная сперма достигает температуры выдержки - 4 °C, ее разбавляют до конечной желаемой концентрации путем добавления фракции глицерина, если соблюдается двухэтапный протокол криоконсервации. (Обратите внимание, что в одноэтапном протоколе сперма доводится до желаемой концентрации и включает добавление глицерина перед процессом охлаждения.) Этап, связанный с добавлением глицерина, иногда ошибочно называют периодом уравновешивания глицерина (равномерное его распределение) . Поскольку глицерин обладает способностью довольно быстро проникать через клеточную мембрану при 5 °C, его можно добавить в любое время в течение периода охлаждения.^21,57 Считается, что период уравновешивания включает процесс стабилизации мембраны.

Таким образом, сперма, доведенная до соответствующей концентрации, содержит около 7% глицерина, и ее дополнительно выдерживают при 4 °C в течение нескольких часов. В течение этого периода выдержки сперма может быть расфасована, упакована и запечатана в поливиниловые соломинки 0,25 или 0,5 мл (стандартный размер, используемый в США) для дальнейшей обработки (рис. 71.1). Все процедуры, связанные с обращением с охлажденной спермой, выполняются в холодильном шкафу, чтобы поддерживать температуру уравновешивания спермы (рис. 71.2).

Скорость охлаждения и замораживания

В процессе замораживания и оттаивания сперматозоиды подвергаются повреждениям, вызванным быстрыми и резкими изменениями физикохимических условий, происходящих во время охлаждения и образования льда. Степень повреждения, вызванного этими резкими изменениями, сильно зависит от скорости охлаждения и состава криозащитной среды. Скорость охлаждения при криоконсервации спермы была определена для разных домашних животных и людей, иногда вместе с концентрацией криопротектора. Оптимальная скорость в идеале должна быть ни слишком быстрой, ни слишком медленной. В процессе охлаждения и замораживания первое изменение, с которым должны справиться сперматозоиды, - это снижение температуры до точки, близкой к точке замерзания воды.^1,6 Во время медленного охлаждения спермы (0,5–1 °C / мин) снижение температуры вызывает напряжение на мембранах, вероятно, связанное с фазовыми изменениями в липидных бислоях и изменением функционального состояния мембран.⁶

Считается, что это нарушает функцию мембранных белков, которые необходимы для структурной целостности (цитоскелет) или ионного метаболизма (ионные насосы).⁶ Основные изменения в сперматозоидах быков во время этой фазы происходят при температуре около 15–5 °C, но не происходят при температуре ниже 0 °C.⁶ Второе важное изменение в окружающей среде совпадает с образованием кристаллов льда после охлаждения раствора до температуры от –5 до –15 ° C. Высвобождение «скрытой теплоты плавления» (тепло, выделяемое при переходе из жидкой фазы в твердую или поглощаемое при переходе в обратном направлении) затем вызывает резкое нагревание образца до тех пор, пока не будет достигнута температура замерзания/таяния раствора (оставшейся незамерзшей фракции).⁶ Это приводит к самопроизвольному зарождению (нуклеации) льда, поскольку раствор переохлажден и кристаллы льда затем быстро растут во всех направлениях. Образование льда будет зависеть от скорости дальнейшего охлаждения среды, и остается так называемая незамерзшая фракция, в которой находятся все растворенные вещества. Осмоляльность этой фракции увеличивается из-за повышенной концентрации глицерина, сахаров и солей и вызывает быстрый отток воды из клеток или клеточную дегидратацию. Фактически, быстрое охлаждение на такой стадии может привести к очень внезапным изменениям размера, формы и ультраструктуры клеток, а также к структурной деформации. Сперматозоиды могут оказаться ограниченными очень узкими каналами незамерзшего раствора, зажатыми между растущими массами льда, что также может привести к механическому стрессу в клетках. По мере дальнейшего охлаждения эти процессы продолжаются до тех пор, пока вязкость незамороженной фракции не станет слишком высокой для дальнейшей кристаллизации. Двухфакторная теория объясняет влияние скорости охлаждения на сперматозоиды.^58,59 Медленные скорости охлаждения подвергают сперматозоиды влиянию "эффекта «растворения», при котором происходит увеличение концентрации соли, увеличение осмоляльности и изменение pH, тогда как высокие скорости могут не позволить внутриклеточной воде выйти, что приведет к нуклеации внутриклеточного льда. Оптимальная скорость охлаждения спермы перед замораживанием у домашних животных обычно находится в диапазоне 10–100 ° C/мин⁵⁴ и способствует хорошей выживаемости после оттаивания. У быков скорость охлаждения может составлять от 50 до 60 °C/мин, хотя Woelders и др.¹³ предложили скорость охлаждения до 100 °C/мин с оптимальными результатами. Одним из преимуществ таких высоких скоростей охлаждения может быть снижение концентрации глицерина в среде, поскольку считается, что глицерин защищает от повреждающих эффектов при медленном охлаждении. Это также поможет избежать осмотического повреждения, вызванного высокими концентрациями глицерина, которые в настоящее время используются для замораживания спермы крупного рогатого скота. Однако, существуют технические трудности в достижении такой равномерной скорости охлаждения соломинок независимо от их положения в морозильных аппаратах.¹³ В настоящее время доступны два варианта замораживания бычьей спермы: контролируемое замораживание с использованием автоматических программируемых морозильников и традиционное вейперное замораживание (непрограммируемое) путем удерживания соломинок со спермой над парами жидкого азота в определенное время и на определенном расстоянии. Коммерческие аппараты для замораживания спермы (рис. 71.3) позволяют точно контролировать температуру внутри охлаждающей камеры, а также программировать изменение температуры во времени. Однако, поскольку соломинки со спермой размещаются более чем в одном слое, это способствует значительному изменению скорости охлаждения в отдельных слоях в течение цикла замораживания, и изменение температуры внутри соломинок во времени может быть различным из-за генерации скрытой теплоты плавления.

Кроме того, программируемые морозильные камеры более дорогостоящие и не обязательно дают более удовлетворительные результаты, особенно для опытных техников и криобиологов. Традиционное замораживание паром или непрограммируемое замораживание может быть выполнено путем частичного заполнения невентилируемой коробки из пенополистирола жидким азотом и замораживания соломинок, расположенных на решетке, помещенной внутри коробки (рис. 71.4). Высота соломинок над жидким азотом определяет скорость теплообмена, при этом скорость снижения температуры составляет от 150 до 300 °C/мин. Кроме того, преимущество традиционных морозильных камер заключается в том, что все соломинки в любом заданном цикле замораживания подвергаются одинаковой скорости охлаждения, поскольку соломинки размещаются в один слой над уровнем жидкого азота. В непрограммируемых морозильных камерах кривая охлаждения (время охлаждения и замораживания) по умолчанию имеет форму, которая теоретически считается оптимальной для медленного замораживания.⁶⁰ Это приводит к относительно низким скоростям охлаждения сразу после начала образования льда и более высоким скоростям охлаждения позже. В непрограммируемых системах общую крутизну кривой замораживания можно регулировать, выбирая высоту расположения соломинок над жидким азотом, которая пропорциональна температуре пара вокруг соломинок.

Оттаивание и хранение спермы

Замороженные сперматозоиды могут быть повреждены в процессе оттаивания, так как процессы в клетках имевшие место во время замораживания происходят с точностью наоборот. Во время медленного оттаивания может происходить рекристаллизация ультрамикроскопических кристаллов льда с образованием сравнительно крупных кристаллов льда^6,13 , когда сперматозоиды проходят через критическую температурную зону от –5 до –15 °C⁶¹ , и они могут повредить сперматозоиды. Более быстрая скорость оттаивания (оптимально: 37 °C в течение как минимум 45 с) ограничивает время перекристаллизации и, таким образом, увеличивает выживаемость сперматозоидов. Однако, когда продолжительность оттаивания недостаточна для оттока избытка криопротектора из клетки, она испытывает осмотический стресс, и сперматозоиды набухают и лизируются, поскольку среда резко разбавляется за счет таяния внеклеточного льда.⁶² На скорость оттаивания могут влиять такие факторы, как температура и характер окружающей среды (воздух или вода в термостате), а также теплопроводность упаковки в зависимости от диаметра просвета упаковки (соломинки) . Более быстрая скорость оттаивания может быть достигнута за счет использования более высоких температур в течение более коротких периодов времени (например, 65 ° C в течение 5 с); но необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать перегрева спермы.

Правильное хранение соломинок со спермой и обращение с ними - решающий фактор, который может оказывать сильное влияние на успех любой программы искусственного осеменения. Сперма обычно фасуется в соломинки объемом 0,5 мл, хотя некоторые организации (особенно в Европе) предпочитают упаковку в соломинки объемом 0,25 мл. Независимо от размера процедура обработки одинакова, и соломинки обычно помещают в стаканчики, которые, в свою очередь, прикрепляют к металлической трости. Трости соответственно идентифицируются по кличке быка или идентификационному номеру и хранятся в канистрах специально разработанных резервуаров (сосудов) с жидким азотом. Хотя подробное описание конструкции резервуара с жидким азотом выходит за рамки данной главы, необходимость надлежащего ухода за ним при хранении и обращении невозможно переоценить. Хотя резервуары для спермы сконструированы прочными, они более хрупкие, чем кажутся, и требуют регулярной проверки и внимания, чтобы продлить их срок службы. Невыполнение этого требования может привести к потере или снижению оплодотворяемости из-за ухудшения качества спермы. Сосуды следует хранить в сухом, хорошо освещенном и хорошо проветриваемом помещении, вдали от прямых солнечных лучей. Их следует держать на возвышении над бетонным полом или другими влажными и плохо вентилируемыми поверхностями, поскольку коррозия внешней оболочки сокращает срок службы резервуара и может привести к выходу его из строя. Одним из основных внешних признаков неисправности резервуара является нарастание инея (особенно вокруг горловины), указывающее на потерю вакуума. Уровень жидкого азота в резервуарах необходимо регулярно контролировать и при необходимости доливать. При извлечении соломинок из сосуда канистры должны удерживаться как можно ниже, чтобы поддерживать температуру соломинок на постоянном уровне –196 °C. Если соломинку невозможно извлечь или обнаружить в канистрах менее чем за 10 с, канистру следует опустить обратно в резервуар и выдержать не менее 20 с для повторного охлаждения перед повторной попыткой.

Пошаговая процедура двухэтапного протокола

криоконсервации спермы крупного рогатого скота

Обратите внимание: если инструкции для шприца-катетера, поставляемого производителем, отличаются, рекомендуется следовать им.

1. Подготовьте фракцию A (содержащую буферы с добавлением 200 г яичного желтка) разбавителя и поместите в инкубатор перед сбором спермы. Поместите фракцию B (содержащую глицерин) разбавителя в холодильник.

2. После исследования и оценки качества и концентрации спермы медленно разбавьте сперму небольшим объемом подогретого разбавителя фракции А в 50-мл колбе. В зависимости от рассчитанного количества обрабатываемых соломинок эякулят может быть увеличен фракцией А до 50% расчетного конечного объема.

3. Разбавленную сперму можно охладить до 4 ° C, сначала выдерживая при комнатной температуре, а затем поместив в холодильник или холодное помещение. Образец следует выдержать при температуре 4 °C не менее 2-х часов. Разбавленная сперма также может быть помещена в водяную баню с той же температурой, а затем помещена для охлаждения до 4 °C. Это помогает со скоростью охлаждения.

4. Фракцию B, которая предварительно была охлаждена до 4 °C, теперь можно добавлять в разбавленную охлажденную сперму в соотношении 1:1 постепенно в течение 20 минут.

5. Сперма, достигшая конечной концентрации, должна быть снова помещена в холодное помещение или шкаф для уравновешивания (равномерного распределения разбавителя) на 4 часа. В это время маркируют соломинки, указывая соответствующую информацию (например, порода, регистрационный номер, кличка, дата). Их заполняют, запечатывают и кладут на стеллажи для замораживания и подсчета. Соломинки следует встряхнуть так, чтобы после заполнения и перед замораживанием пузырек воздуха находился в центре. Все процедуры следует проводить при температуре 4 °C в холодном помещении или холодильнике.

6. Соломинки замораживают, помещая их на решетку на расстоянии 5 см над уровнем жидкого азота в герметичном контейнере из пенополистирола. Таким образом, они выдерживаются над парами жидкого азота в течение примерно 15 минут, а затем погружаются в жидкий азот (рис. 71.5).

7. Затем соломинки загружают в трости (с информацией о быке) и переносят в канистры с жидким азотом. Следует разморозить одну соломинку, чтобы оценить ее подвижность и концентрацию. В идеале концентрация в каждой соломинке должна быть равна одной дозе осеменения (10–15 миллионов сперматозоидов). Она может быть скорректирована с учетом данных о фертильности быка, если таковые имеются.