Воспроизводство крупного рогатого скота

В отличие от обычного осеменения коров с овуляцией одной яйцеклетки, считается, что при множественной овуляции необходимо многократное осеменение, чтобы охватить весь овуляционный период.³¹ Поскольку количество разделенных по полу сперматозоидов на дозу осеменения ограничено из-за высокой стоимости спермы, было принято решение о многократном осеменении отсортированной спермой с низким содержанием спермиев в дозе (2 миллиона ).^29,30 В одном исследовании, когда доноры были оплодотворены сексированной спермой через 12 и 24 часа после выявления охоты, количество трансферабельных (пригодных к пересадке) эмбрионов увеличилось по сравнению с донорами, осемененными только одной дозой сексированной спермы²⁹ , что указывает на то, что двукратное осеменение более эффективно для получения эмбрионов с характеристиками аналогичными характеристикам по обычному семени, чем однократное. Однако, в другом исследовании утверждалось, что у суперстимулированных коров-доноров, осемененных четырехкратно, было меньше эмбрионов 1 класса и больше неоплодотворенных яйцеклеток при использовании сексированной спермы по сравнению с обычной спермой.³² Кроме того, когда разделенная по полу сперма вводилась в разное время после выявления охоты³⁰ , количество трансферабельных эмбрионов уменьшалось по сравнению с донорами, осемененными обычной спермой.

Для суперовулированных коров, как правило, требуется больше сперматозоидов. Успешное использование разделенных по полу сперматозоидов в схемах суперовуляции и переноса эмбрионов крупного рогатого скота (MOET) в решающей степени зависит от дозы семени. Доза отсортированной по полу спермы, которая используется для обычного (без суперовуляции) осеменения - 2 миллиона сперматозоидов, недостаточна.²⁹ Успех применения более высоких доз (10–20 миллионов сперматозоидов), по-видимому, зависит от быка-производителя или условий MOET. Кроме того, увеличение дозировки до 20 миллионов сперматозоидов, отсортированных по полу, снизило частоту оплодотворения по сравнению с контрольной группой.²⁹ Суперстимулированные телки, осемененные сексированным семенем с 5 миллионами сперматоцитов (X-сортировка; n = 5) и несексированным (n = 5) размороженным семенем от одного быка через 12 и 24 часа после выявления охоты, не показали существенной разницы в количестве трансферабельных эмбрионов эмбрионов (53,4% против 68,1%).³³ Кроме того, частота дегенеративных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток между сексированными и несексированными спермиями составляла 24,8% против 26,6% и 21,8% против 5,3% соответственно.³³ Получение большего количества пригодных к пересадке эмбрионов хорошего качества и улучшение показателей наступления беременности после пересадки имеет большой потенциал, сильно влияющий на эффективность использования сексированного семени.

Плановое скрещивание элитных производителей с самками по программе MOET, значительно увеличивают вероятность получения желаемого потомства даже без разделения спермы по полу. Предположим, что в результате процедуры MOET были получены три эмбриона, которые дали жизнеспособное потомство. При использовании обычного семени вероятность того, что хотя бы один из телят имеет желаемый пол, будет 0,879 (1 минус вероятность того, что все потомки другого пола). При чистоте 90% вероятность получения по крайней мере одного теленка желаемого пола будет 0,999. Для четырех жизнеспособных потомков вероятность будет 0,934 и 0,999 соответственно. Таким образом, следует отметить, что, хотя разделение по полу спермы увеличивает вероятность получения по крайней мере одного потомка желаемого пола в результате запланированного спаривания, это увеличение незначительно.

Целью большинства программ эмбриотрансфера является получение генетической выгоды как от матери, так и от отца. Использование сексированного семени должно дать генетический рост равный или больший, чем у обычного семени. Исследование показало, что генетическая тенденция во всей популяции улучшилась на 3,0%, когда семя, содержащее Х-хромосому, использовалось на всех полученных телках без использования MOET в основном стаде, и на 2,2%, когда MOET проводилось на всех быках и матках.³⁴

Когда сексированное семя использовали совместно с программой MOET на племенном ядре, эффект от использования разделенной по полу спермы был минимальным, за исключением случаев применения маркер-вспомогательной селекции (отбор по геному) .³⁵ Несмотря на небольшой генетический рост, в недавнем исследовании сообщалось о положительном влиянии на уровень инбридинга за счет использования сексированной спермы в схеме разведения.³⁶

Оплодотворение in vitro

ЭКО требует небольшого количества сперматозоидов для производства эмбрионов. Поэтому использование отсортированных по полу сперматозоидов при ЭКО представляется выгодным. Скорость расщепления была такой же, как при использовании несортированной спермы, но выход бластоцист от сексированного семени составил примерно 70% от контрольной выборки, полученной с несортированной спермой.³⁷ Кроме того, при осеменении ооцитов сексированной спермой по сравнению с несортированной спермой наблюдалась задержка эмбрионального развития на 0,5–1 день.³⁷ Аналогично, в других исследованиях показатели расщепления после ЭКО с использованием сексированных сперматозоидов были на 30% ниже, чем с использованием несортированной спермы из того же эякулята; образование бластоцист на 8-е сутки было на 30-40% ниже, чем в контроле, и количество клеточных циклов было снижено.^38,39 Было высказано предположение, что влияние сортировки на молекулярные аспекты функции сперматозоидов, включая капацитацию, акросомную реакцию, зону связывания и эмбриональное развитие, являются причинами снижения продукции бластоцист. Тем не менее, в последующих отчетах указывалось на отрицательное влияние сортировки на целостность сперматозоидов, но центрифугирование сперматозоидов в градиенте плотности Перколла ( метод отделения наиболее плотных и подвижных сперматозоидов из нативного эякулята) не влияло ни на расщепление, ни на количество бластоцист. Кроме того, на результаты ЭКО также влияет концентрация сперматозоидов, которая должна быть выше, чем при ЭКО с несортированной спермой, и гидродинамическое давление, используемое при сортировке.⁴¹ Также, наблюдалась положительная корреляция между процентом отсортированных сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением и развитием бластоцисты.⁴²

Что касается различий в экспрессии генов, необходимых для развития, у ЭКО-эмбрионов крупного рогатого скота, полученных от сексированного семени наблюдалось снижение относительной концентрации транспортера глюкозы 3 (Glut3) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) по сравнению с эмбрионами, полученными от традиционного семени, что может иметь негативные последствия для развития эмбрионов.⁴³ Кроме того, интересно отметить, что существуют значительные половые различия (X- и Y-несущие сперматозоиды) в бластоцистах на 7-й день для нескольких генов, а именно глутатион-S-трансферазы M3 (GSTM3), ДНК (цитозин-5) - метилтрансферазы 3A (DNMT3A) и мембранного компонента рецептора прогестерона 1 (PGRMC1), что, вероятно, способствует отсроченному началу первого расщепления.^38,44 Кроме того, у бластоцист, полученных из сперматозоидов, отсортированных по полу, наблюдаются незрелые митохондрии и грубый эндоплазматический ретикулум, а также сниженное процентное содержание интактных мембран ядерной оболочки, чем в несортированном контроле.⁴² Хотя процесс сортировки оказывает значительное влияние на жизнеспособность сперматозоидов, и очевидно влияние отдельных быков, повреждение ДНК не влияет на снижение фертильности, поскольку большинство нежизнеспособных сперматозоидов и сперматозоидов с фрагментированной ДНК отсеиваются во время сортировки. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы выявить этот феномен, поскольку существует связанное со временем повреждение ДНК сперматозоидов, разделенных по полу, по сравнению с неразделенными.

Обратная сортировка

Обратная сортировка - это разделение по полу сперматозоидов из ранее замороженных образцов и повторное замораживание этих образцов после разделения.

Этот метод выгодно применять для быков, которые находятся на большом расстоянии от места сортировки или умерли и, следовательно, не могут предоставить свежие эякуляты для разделения по полу. Метод «обратной сортировки» решает проблемы окрашивания⁴⁵ путем промывки замороженной спермы с помощью градиента плотности, что позволяет удалить мертвые сперматозоиды, глицерин и яичный желток, которые могут мешать окрашиванию или отрицательно влиять на оставшиеся жизнеспособные сперматозоиды.^46,47

Первое предварительно разделенное по полу потомство, полученное из обратно отсортированных сперматозоидов, было получено у овец после ЭКО и переноса эмбрионов⁴⁸ и несколькими годами позже с использованием ИО.⁴⁹ Обратно отсортированная сперма быков имеет более низкую подвижность и жизнеспособность in vitro по сравнению с замороженно-размороженными контрольными сперматозоидами.⁵⁰ Несмотря на то, что в результате искусственного осеменения бычьей спермой, прошедшей обратную сортировку, были рождены телята с предварительно определенным полом, фертильность этого семени очень низкая, с увеличенным количеством эмбриональных потерь.^51,52 Больших успехов достигло использование обратно сортированной бычьей спермы в ЭКО, где расщепление и образование бластоцист с отсортированной по полу замороженной спермой и несортированными замороженными контрольными сперматозоидами были сопоставимы.⁵³ Было очевидно, что у отдельных овец была разница в показателях после применения семени обратной сортировки. Хотя причина такого различия между видами является источником некоторых разногласий,⁵⁴ дальнейшие исследования, вероятно, улучшат фертильность отсортированной и обратно отсортированной спермы быков.

Влияние процедуры сортировки по полу на структурные и функциональные параметры

спермы

Во время процедуры сортировки сперма проходит несколько этапов обработки, включая: 1) высокое рабочее давление во время гидродинамической фокусировки и прохождения через инжекционное сопло; 2) окрашивание ДНК флуоресцентным красителем бисбензимидом (Hoechst 33342); 3) воздействие на сперму волн ультрафиолетового спектра; 4) многократное воздействие на ДНК сперматозоидов электрических токов и полей; и 5) последующее прохождение через поле электростатического отклонения, которое может вызвать стресс у сперматозоидов, разделенных по полу.^55,56 Дальнейшее влияние на качество спермы может оказывать хранение окрашенной спермы при низкой температуре до осеменения. Кроме того, на подвижность, жизнеспособность и функциональную целостность отсортированных сперматозоидов может влиять разбавление спермы после удаления семенной плазмы. Возможно, основной причиной снижения выживаемости отсортированных сперматозоидов является производство активных форм кислорода (АФК) на некоторых этапах процесса сортировки. Добавление пирувата натрия и каталазы в буферную среду и замораживающие разбавители оказало положительное влияние на подвижность, морфологию, акросомный статус и жизнеспособность размороженных сексированных сперматозоидов, подтверждая пагубное воздействие АФК в процессе сортировки.⁵⁷ Hoechst 33342 (бис-бензимид) подходит для мечения ДНК сперматозоидов, поскольку он предпочтительно связывается с малой бороздкой спирали ДНК (см. Обзор в ссылке 58). Однако, известно, что этот краситель мутагенен для клеток и может вызывать нарушения в развитии эмбриона. Более того, судьба этого красителя, транспортируемого сперматозоидом в ооцит и, таким образом, в эмбрион и потомство, является областью, требующей дальнейшего изучения.⁵⁹ Оценка фрагментации ДНК несортированных и отсортированных по полу образцов сперматозоидов во время 72-часовой инкубации при 37 ° C выявила снижение долговечности ДНК в отсортированных по полу замороженноразмороженных сперматозоидах, при этом повреждение ДНК сперматозоидов проявлялось в период между 24 и 48 часами.⁶⁰

Хотя исходный уровень фрагментации ДНК был выше в размороженных образцах традиционной спермы, чем в размороженных образцах спермы, отсортированной по полу,^60,61 примерно через 30 часов инкубации наблюдалась перекрестная тенденция к фрагментации ДНК как для традиционных, так и для отсортированных по полу образцов спермы, с более высокой фрагментацией ДНК у образцов, разделенных по полу.⁶⁰ Кроме того, был сделан вывод, что хроматин сперматозоидов более устойчив к внешним стрессорам, влияющим на сперматозоиды после сортировки.⁶⁰

Стоимость и прибыль

Для последующей оценки репродуктивных показателей и здоровья, продуктивности и оплодотворяемости по первому осеменению проводилось сравнение телок, осемененных сексированным или обычным семенем (в обеих группах все повторные осеменения проводились традиционным семенем) (подробные экономические результаты см. в ссылке 62). Вкратце, возраст телок при первом осеменении составлял 13,1 ± 0,1 в группе, осемененной сексированной спермой (далее ХХ-телки) и 13,8 ± 0,1 месяцев в группе, осемененной стандартной спермой (далее ХУ-телки) . Затраты на выращивание от первого искусственного осеменения до отела были выше для ХХ-телок, чем для обычных телок (775,3 ± 6,7 долларов по сравнению с 750,0 ± 5,9 долларов). Однако, доход от телят, полученных от сексированного семени, как правило, был выше (142,0 ± 7,2 долл. против 126,7 ± 6,4 долл.), а затраты на каждую полученную телку были меньше для группы ХХ-телок, чем для ХУ-телок (–809,4 ± 10,8 долл. против - 1249,7 ± 10,9). Не наблюдалось различий в трудности отела, доли нетелей, нуждающихся в родовспоможении, а также в частоте задержек плодных оболочек или метрита. Среди телок, ставших стельными от первого осеменения, те, которые были оплодотворены сексированной спермой, с большей вероятностью пали в течение 30 дней (3,3 против 1,6%) и, как правило, с большей вероятностью пали в течение 60 дней (5,5 против 3,4%) по сравнению с телками, осемененными обычной спермой, но общая стоимость ремонта не изменилась (136,8 ± 13,4 долл. США). Общий удой (9245,5 ± 84,7 кг) и стоимость кормодня (отличается от нашего "кормодня", дословно "прибыль после вычета расходов на корма", измеряется в долларах на дойную корову в день) (554,7 ± 5,1 долл. США) не различались. Общая экономическая отдача была выше для телок, осемененных сексированной спермой, чем для телок, покрытых обычной спермой (- 83,7 ± 36,7 долл. против - 175,3 ± 33,4 долл.). Использование отсортированной по полу спермы для первого осеменения телок снизило затраты на получение одного теленка женского пола и увеличило экономическую отдачу во время первой лактации. Соотношение полов между самцами и самками составляло 0,86: 0,14 и 0,48:0,52 для спермы с сортировкой по полу и стандартной спермы, соответственно. Телки, осемененные сексированной спермой, с большей вероятностью родили мертвого теленка (8,8 против 3,4%), и, таким образом, пропорционально разница в получении живых телочек была ниже, чем сообщалось (сексированное семя - 79,1%; стандартное - 47,2%).

Используя семя, отсортированное по полу в молочных стадах, можно устранить 70% коров, используемых в качестве ремонтных маток с третьим и более отелом, сохраняя при этом уровень рождаемости телок, эквивалентный показателям обычного семени.⁶³ Исключение более старых коров-маток снижает возраст ремонтных маток и увеличивает генетическую ценность маток примерно на 23 доллара. Это увеличение удваивает генетические изменения в каждом году на линии мать – дочь по сравнению с обычным семенем, в первую очередь из-за более коротких интервалов между поколениями.⁶³ Существует расчетная экономическая стоимость программ по использованию сексированного семени для молочных и мясных телок.^64,65

Мертворождаемость

У телок, осемененных обычным семенем или спермой, отсортированной по полу частота мертворождения была одинаковой.^20,66 Кроме того, не было различий между породами в частоте мертворождений среди голштинских, джерсейских и датских красных телок, осемененных спермой от одних и тех же быков с сортировкой по полу или традиционной.⁶⁷ В другом исследовании сообщалось о более высокой частоте мертворождений после оплодотворения спермой, отсортированной по полу.⁶² Через 3 года использования сексированной спермы общий процент мертворождений не зависел от того, сексированная сперма или обычная (10,4 против 11,8%).²⁰ Мертворождение телят от разделенной по полу спермы (9,2%) аналогично или немного ниже, чем от традиционного семени. Тем не менее, частота мертворожденных телят мужского пола от спермы, отсортированной по полу (19,9%) намного выше, чем от обычной спермы (12,9%). Несмотря на то, что у нетелей, родивших бычков, процент мертворождений был выше, только 10% рожденных телят были самцами. Однако, это может стать проблемой, если необходимо более высокое соотношение полов в сторону самцов. Было высказано предположение, что повышенная частота мертворождений от сперматозоидов, несущих Y-хромосому, происходит из-за того, что эти сперматозоиды ошибочно идентифицируются как несущие X-хромосомы во время процесса сортировки из-за наличия анеуплоидии (большее или меньшее число хромосом в ядре клетки, чем должно быть в норме) , приводящей к большему содержанию ДНК и увеличению риска возникновения пороков развития.²⁰ В этом случае следует отметить, что когда при сортировке происходит целенаправленный отбор Y-несущих сперматозоидов, имеющих меньшую ДНК, то Y-несущие сперматозоиды с анеуплоидизмом и с большей ДНК не будут смешиваться с этой Y-несущей популяцией сперматозоидов, поскольку они просто не будут распознаны и отобраны. Следовательно, когда происходит отбор мужской спермы, частота мертворождений будет аналогична обычному семени.

Заключение

Несмотря на ключевые технологические разработки за более чем три десятилетия, большинство коммерческих предприятий, в которых используется отсортированная сперма, - это молочные стада. Исследования по улучшению технологии определения пола сперматозоидов были в основном сосредоточены на повышении пропускной способности образцов за счет увеличения скорости, с которой сперматозоиды поступают в сортировщик, и на улучшении разрешающей способности измерения, что привело к увеличению доли сперматозоидов, которые можно достоверно измерить и отсортировать. Хотя скорость сортировки значительно увеличилась, все еще остается потребность в индивидуальной оценке и сортировке сперматоцитов. Как следствие, использование более низких доз сперматозоидов для ИО привело к снижению фертильности (по сравнению с обычным семенем) и в значительной степени способствовало ограниченному коммерческому использованию этого продукта. Кроме того, более половины спермы выбрасывается. Недавнее внедрение некоторых улучшений сделало сортировку более эффективной и менее вредной для спермы. Модификация технологии безвредным методом сортировки имеет большие перспективы для увеличения продолжительности жизни и оплодотворяющей способности отсортированных сперматозоидов. С дальнейшим улучшением скорости и точности сортировки стоимость этого процесса будет снижена, особенно для ценных образцов. В будущем акцент может сместиться на другие аспекты общего процесса, такие как улучшение качества спермы после сортировки, чтобы уменьшить различия между быками и увеличить поставки спермы от быков с высоким спросом. Кроме того, важно, чтобы по мере роста коммерциализации собиралось больше данных о фертильности, эмбриональных потерях, мертворождении и здоровье телок. Такая информация поможет правильно оценить технологию для практического использования.

Заключительное слово

В наше время коммерческое применение разделенной по полу спермы у крупного рогатого скота, оленей и овец стало реальностью и приближается к такому же масштабу у некоторых других видов, в частности свиней, лошадей и собак. Консервация сексированной спермы также стала обычным явлением для животных зоопарков и других диких животных, некоторые из которых находятся под угрозой исчезновения.⁶⁸

Но есть один аспект, который оставался неизменным до недавнего времени и, возможно, вызывает наибольшее беспокойство, - это фертильность. Считалось, что у крупного рогатого скота и, возможно, у других видов фертильность разделенного по полу семени снижается примерно на 10% из-за неизвестного механизма, который, по-видимому, не может быть компенсирован увеличением количества сперматозоидов в дозе осеменения.⁶⁹ Sexing Technologies вложила значительные средства в исследования и разработки в области модификации обрабатывающих сред, а также в биохимическое изменение всего процесса сортировки (Vish Vishwanath и Juan Moreno, личное сообщение). Недавно завершенные Select Sires испытания указывают на значительное увеличение фертильности, что сократило разрыв между обычной спермой и спермой, разделенной по полу, до 3-5%. Не исключено, что этот разрыв можно еще больше сократить, тем самым сделав сексированную сперму почти столь же фертильной, как и традиционная сперма. Некоторые отчеты действительно показывают, что у овец разделенная по полу сперма превосходит обычную сперму с точки зрения фертильности.⁵⁴ Причины этого разнообразны, но процесс сортировки действительно удаляет много мертвых и поврежденных сперматозоидов, и если условия правильные и время осеменения точно совпадает с овуляцией, то есть реальная возможность улучшить фертильность.

Ссылки

1. Foote R, Miller P. Что может означать регулирование соотношения полов в животном мире? В кн.: Kiddy CA, Hafs HD (ред.) Соотношение полов при рождении: перспективы регулирования . Шампейн, штат Иллинойс: Американское общество зоотехнии, 1971, с. 1–9.

2. Johnson L, Welch G. Предварительный выбор пола: высокоскоростная сортировка сперматозоидов с X- и Y-хромосомами методом проточной цитометрии для достижения максимальной эффективности. Theriogenology 1999;52:1134–1323.

3. Johnson L. Определение пола сперматозоидов млекопитающих для получения потомства: современное состояние технологии. Anim Reprod Sci 2000;60–61:93–107.

4. Moruzzi J. Выбор вида млекопитающих для определения сперматозоидов, несущих X- и Y-хромосомы. J Reprod Fertil 1979;57:319–323.

5. Garner D, Gledhill B, Pinkel D и др. Количественное определение сперматозоидов домашних животных, несущих X- и Y-хромосомы, методом проточной цитометрии. Biol Reprod 1983;28:312–321.

6. Garner D. Сортировка сперматозоидов млекопитающих по полу: от концепции до применения в животноводстве. J Androl 2001;22:519–526.

7. Garner D. Определение пола сперматозоидов млекопитающих методом проточной цитометрии. Theriogenology 2006;65:943–957.

8. Johnson L, Flook J, Look M. Проточная цитометрия сперматозоидов, несущих X- и Y-хромосомы, по содержанию ДНК с использованием усовершенствованного метода подготовки и окрашивания красителем Hoechst 33342. Gamete Res 1987;17:203–212.

9. Johnson L, Welch G, Rens W. Белтсвиллская технология сортировки сперматозоидов по полу: высокоскоростная сортировка повышает выход сперматозоидов для оплодотворения in vitro и искусственного осеменения. J Anim Sci 1999;77 (прил. 2):213–220.