(a) (b)
10 5 10 5
10 4 10 4
10 3 10 3
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
(c) (d)
10 5 Сперматозоиды 10 5 Сперматозоиды
10 4 10 4
10 3 10 3
Прочие частицы
Прочие частицы
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
(e) (f)
10 5 10 5
10 4 10 4
10 3 10 3
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
SSC-A SSC-A
Hoechst-A Hoechst-A
SSC-A SSC-A
Рис. 74.2 Сравнение (а) хорошего и (б) плохого отделения сперматозоидов от несперматических частиц в размороженных эякулятах. Мечение клеток с помощью Hoechst 33342 (синие клетки в c, d) позволяет исключить окрашивание сперматозоидов и различать клеточный дебрис (мусор) и несперматические частицы из яичного желтка. Распознанную популяцию сперматозоидов можно использовать для дальнейшего многопараметрического анализа (e, f). SSC - график бокового рассеяния; FSC - график прямого рассеяния.
На первый взгляд, 22,6% расхождений между объективной и субъективной оценкой могут показаться высокими. Однако, при CASA / проточной цитометрии было бы отбраковано 268 партий (таблица 74.2), при этом было принято 392 партии по сравнению с исходными принятыми 385 и 275 отклоненными SPC. Это различие составляет 1% от всей поступившей на оценку спермы (7 партий из 660) и может рассматриваться как «производственное влияние» CASA / проточной цитометрии по сравнению со стандартным контролем качества. Это исследование показывает, что производственное влияние будет незначительным, но влияние точности будет весьма значительным.
Чтобы оценить влияние этого многопараметрического подхода на фертильность спермы в полевых условиях, мы применили этот анализ к партиям спермы с известной фертильностью, которые были реализованы (т.е. осеменены животные) в полевых условиях после использования стандартного контроля качества. CASA и проточная цитометрия были выполнены на 192 партиях с не менее 250 первых осеменений. Фертильность, связанная с каждой партией, была получена из Канадской молочной сети и выражена как FERTSOL, что представляет 56-дневный невозвратный коэффициент, скорректированный с учетом нескольких параметров, включая сезон осеменения, осеменатора, кратность осеменения и т. д.
Таблица 74.1 Предельные значения CASA / проточной цитометрии, используемые для определения показателей прохождения/непрохождения во время контроля качества размороженной спермы сразу после оттаивания и после 2 часов воздействия терморезистентного стресса. Партии спермы, соответствующие этим пороговым значениям или превышающие их, прошли оценку.
| Параметр | После оттаивания | После 2-х часовой выдержки |
|---|---|---|
| Общая подвижность (%) | 40 | 35 |
| Прогрессивная подвижность (%) | 15 | 10 |
| Неповрежденная акросома (%) | 66 | 61 |
| Клетки с неповрежденной мембраной (%) | 40 | 40 |
| Митохондриальная активность (%) | 40 | 45 |
Таблица 74.2 Количество (%) отбракованных образцов (всего 660), по крайней мере, по одному параметру контроля качества на основании только CASA, только проточной цитометрии или CASA плюс проточная цитометрия.
| После оттаивания Параметр (0 часов) | После 2-х выдержки | часовой 0 часов+ 2 часаa |
|---|---|---|
| Только CASA | ||
| Общая подвижность (%) 76 (12) | 157 (24) | 163 (25) |
| Прогрессив. подвижность (%) 70 (11) | 137 (21) | 151 (23) |
| Всего CASA 94 (14) | 178 (27) | 188 (28) |
| Только проточная цитометрия | ||
| Неповрежденная акросома (%) 104 (16) | 97 (15) | 117(18) |
| Клетки с неповрежденной мембраной (%) 132 (20) | 144 (22) | 159 (24) |
| Митохондриальная активность (%) 133 (20) | 208 (32) | 212 (32) |
| Всего проточная цитометрия 156 (24) | 214 (32) | 224 (34) |
| Всего CASA+проточная цитометр. 176 (27) | 260 (39) | 268 (41) |
| a Уникальные партии, отклоненные спустя 0 часов уникальные партии, отклоненные после 2-х часовой стресса). При использовании нашего многопараметрического | (т.е. сразу после инкубации | оттаивания) + (терморезистентного подхода 9,4% |
| (18 из 192) партий спермы были бы реализации. Эти партии соответствовали фертильностью (< –1 FERTSOL), | утилизированы 5,3% 3,6% спермы | до их спермы с низкой средней |
| фертильности (от -1 до +1 FERTSOL) и | 0,5% спермы | с высокой |
| фертильностью (> +1 FERTSOL). | Опять | же, этот |
| многопараметрический подход увеличил спермы, поступившей на реализацию. | бы общую | фертильность |
Конкретные применения многопараметрического подхода к оценке спермы
Многофакторный аспект фертильности может привести к неправильной оценке качества спермы при оценке лишь нескольких параметров. Даже сперма, прошедшая строгие этапы контроля качества, может иметь низкую фертильность после полевых испытаний.
Отклонено стандартом.
Отклонено CASA / FC
29.8%
Принят стандартом.
Отклонено CASA /
FC 10,8%
Отклонено
стандартом.
Принято CASA / FC
11,8%
Принят стандартом.
Принято CASA / FC 47,6%
Рис. 74.3 Сравнительный анализ процентного соотношения допущенных/не допущенных к реализации образцов спермы между стандартной QC и CASA / проточной цитометрией во время контроля качества 660 размороженных партий спермы.
Такие партии прошли бы все наши пороговые значения CASA/ проточной цитометрии, но все же дали бы меньше телят, несмотря на большое число осеменений. Необходим более подробный анализ этой спермы, чтобы понять причину ее низкой фертильности. Однако, более глубокий анализ образцов спермы требует много времени и средств, поэтому он проводится только для высококачественной спермы. Здесь мы сообщаем о двух случаях, когда проточная цитометрия помогла нам выявить предполагаемую причину низкой фертильности семени. В первом случае был молодой бык (бык А), одна из партий спермы которого произвела очень мало эмбрионов после экстракорпорального оплодотворения по сравнению со среднестатистическим показателем. Эту партию спермы сравнивали (в трех экземплярах) с партией среднего быка (бык С), используемой в качестве внутреннего контроля для большинства наших экспериментов. Параметры подвижности и жизнеспособности, оцененные с помощью CASA/проточной цитометрии, показали среднее качество сперматозоидов от обоих быков (в среднем 36% общей подвижности и 15% прогрессивной подвижности). Оценка уровня внутриклеточного кальция и целостности акросомной мембраны проводилась сразу после оттаивания и через 5 часов инкубации после оттаивания с гепарином при 38,5 °C. В обоих случаях аликвоту (часть образца, пробу) сперматозоидов инкубировали с ацетоксиметилом Indo-1 и агглютинином арахиса FITC, а затем обрабатывали тапсигаргином, чтобы вызвать внутриклеточный каскад, участвующий в процессе капацитации. Процент живых сперматозоидов с высоким внутриклеточным уровнем кальция и прореагировавших акросом определяли методом проточной цитометрии. Анализ сразу после оттаивания перед инкубацией с гепарином и введением тапсигаргина показал аналогичный процент клеток с прореагировавшими акросомами, и клеток с высоким внутриклеточным кальцием между быком A и быком C. После стимуляции тапсигаргином аналогичный процент сперматозоидов из каждой акросомы быка прореагировал, но сперма от быка A показала увеличение клеток с высоким содержанием кальция по сравнению с быком C (23,3 ± 6,3% против 13,3 ± 2,5%, соответственно; P = 0,14) (таблица 74.3).
Таблица 74.3 Сравнение целостности акросом и уровня кальция в живых сперматозоидах быков А и С до и после контрольной обработки тапсигаргином, как после оттаивания, так и после 5-часовой инкубации с гепарином.
| Непосредственно после оттаивания | Через 5 часов инкубации с гепарином | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| – Thaps | +Thaps | – Thaps | + Thaps | |||||
| Бык | AR | Высокое содержание Ca | AR | Высокое содержание Ca | AR | Высокое содержание Ca | AR | Высокое содержание Ca |
| A | 1.8 ± 0.7 | 3.1 ± 1.2 | 16.3 ± 3.8 | 23.3 ± 6.3 | 10.5 ± 2.3a | 5.3 ± 0.5 | 10.5 ± 2.0a | 25.3 ± 2.3 |
| C | 1.5 ± 0.2 | 1.1 ± 0.2 | 17.8 ± 4.0 | 13.3 ± 2.5 | 24.1 ± 0.9b | 5.7 ± 0.1 | 23.1 ± 0.5b | 36.6 ± 8.8 |
Значения представляют собой средние проценты от трех протестированных проб ± SEM. Различные буквы (a, b) в одном столбце представляют достоверные различия, P <0,01 - парный t-критерий Стьюдента. AR - акросома прореагировала; High Ca - % клеток с повышенным уровнем кальция; Thaps - тапсигаргин.
Таблица 74.4 Сравнение функций сперматозоидов быков B и C сразу после оттаивания на основе анализа CASA и проточной цитометрии.
| Бык | Партия | Общая подвижность | Прогрессивная (%) подвижность (%) | Акросомная реакция (%) | Мертвые (%) | Митохондриальная активность (%) | Индекс фрагментации ДНК (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| B | 1 | 57.5 ± 4.5 | 32.5 ± 2.5 | 19.1 ± 0.2 | 43.5 ± 0.1* | 55.3 ± 0.2* | 7.05 ± 0.09** |
| B | 2 | 44.5 ± 3.5 | 24.5 ± 3.5 | 19.0 ± 0.2 | 51.7 ± 1.2** | 46.7 ± 1.1** | 5.76 ± 0.12** |
| B | 3 | 63.5 ± 1.5 | 34.5 ± 2.5 | 17.9 ± 0.1 | 39.8 ± 0.7 | 60.0 ± 0.6 | 4.24 ± 0.01** |
| B | 4 | 56.0 ± 0.0 | 32.5 ± 0.5 | 16.1 ± 0.5 | 38.7 ± 1.3 | 60.3 ± 2.1 | 4.83 ± 0.11** |
| B | 5 | 61.0 ± 5.0 | 34.5 ± 1.5 | 14.0 ± 0.3* | 35.0 ± 0.3 | 64.6 ± 0.4 | 3.85 ± 0.03** |
| C | 1 | 60.5 ± 0.5 | 29.5 ± 0.5 | 17.6 ± 1.0 | 38.6 ± 0.9 | 62.7 ± 0.2 | 1.61 ± 0.16 |
Значения представляют собой средние проценты по двум тестам ± SEM. Достоверные отличия от контроля представлены *, P <0,05 - **, P <0,001 - тестом множественного сравнения Даннета (каждая проба сравнивается с контролем) .
В семени быка A после добавления тапсигаргина по-прежнему было меньше клеток с акросомной реакцией, по сравнению с быком C (10,5 ± 2,0% против 23,1 ± 0,5%; P <0,01), но также было пропорционально меньшее увеличение процента клеток с высоким содержанием кальция. Эти наблюдения предполагают, что у сперматозоидов быка А капацитация не могла происходить в среде, содержащей гепарин, о чем свидетельствует меньшее количество клеток с акросомной реакцией и высокое содержание внутриклеточного кальция в сперматозоидах. В целом, этот анализ предполагает, что эта конкретная партия спермы быка А была недостаточно зрелой, чтобы полностью завершить процесс капацитации и реализовать свой потенциал фертильности. Saacke и др.61 описали некоторые компенсируемые и некомпенсированные нарушения функции семени, связанные с субфертильностью (недостаточной фертильностью) . Компенсируемые факторы включают функциональные или молекулярные показатели, отраженные в этом тематическом исследовании низким процентом клеток, с прореагировавшими акросомами или повышенным содержанием кальция. В этом случае может быть полезно увеличить количество сперматозоидов на соломинку у быка А, чтобы компенсировать его субфертильность. Вторым исследованным случаем был взрослый бык (бык B), который показал чрезвычайно низкую фертильность в полевых условиях (FERTSOL <–2) по нескольким различным партиям спермы, выпущенным из ЦПС после стандартных QC-тестов (проверки качества) . Сначала мы провели базовые тесты CASA/проточной цитометрии для пяти разных партий и сравнили результаты со средним быком (бык C). Все изученные партии прошли бы наши ограничения по контролю качества. Удивительно, но процентные доли общей и прогрессивной подвижности у быка B существенно не различались по сравнению с быком C (таблица 74.4). С другой стороны, акросомная реакция, гибель клеток и митохондриальная активность значительно отличались в некоторых проанализированных партиях по сравнению с быком C (таблица 74.4).
Поскольку эти результаты не могли объяснить очень низкую фертильность быка B, мы провели анализ структуры хроматина сперматозоидов, как обсуждалось ранее для тех же партий, и сравнили с результатами, полученными по быку C. Процентный индекс фрагментации ДНК был примерно в два-четыре раза выше у быка B, чем у быка C (P <0,001; Таблица 74.4). Высокий процент индекса фрагментации ДНК коррелировал с пониженной фертильностью главным образом у людей.53,62 Следовательно, очень низкая фертильность, наблюдаемая у быка B, может быть объяснена высоким уровнем денатурации ДНК, измеренным с помощью анализа структуры хроматина сперматозоидов. В отличие от первого исследования, аберрация хроматина - это не компенсируемый фактор, связанный с субфертильностью.61 Увеличение количества сперматозоидов на соломинку в этом случае не может компенсировать чрезвычайно низкую плодовитость быка B, наблюдаемую в полевых условиях.
Выводы
Многопараметрический анализ спермы, проводимый ЦПС с помощью CASA и проточной цитометрии, демонстрирует очень высокий прогностический потенциал в плане оценки качества спермы и фертильности. Поскольку фертильность зависит от множества факторов, должны проводиться общирные исследования и разработка новых маркеров для определения спермы с высокой фертильностью. Включение новых маркеров в многопараметрический подход приведет к лучшей оценке качества спермы и фертильности. Кроме того, внедрение этих инструментов в ЦПС поможет стандартизировать процедуры контроля качества, устранив субъективный аспект оценки спермы. Это позволит стандартизировать сперму, производимую в рамках одного ЦПС и нескольких ЦПС для компаний, занимающихся ИО, которые производят сперму в нескольких лабораториях.
