Исследования эндокринного статуса показали, что животные, получавшие eCG, чаще имели аномальные профили ЛГ и прогестерона,15,23 , что было связано со снижением как процента овуляций, так и оплодотворяемости24 по сравнению с коровами, получавшими ФСГ.
Хотя для фолликулогенеза у млекопитающих требуются как ФСГ, так и ЛГ, содержание ФСГ и ЛГ в неочищенных препаратах гонадотропина сильно разнится.5 Анализы радиорецепторов и биотесты in vitro выявили вариабельность как активности ФСГ, так и ЛГ в eCG не только среди беременных кобыл, но и у одной и той же кобылы в разные периоды беременности.13 Было изучено влияние соотношения ФСГ / ЛГ в eCG на суперовуляторные реакции, и была обнаружена положительная корреляция между соотношением активности ФСГ / ЛГ и суперовуляторной реакцией. Более низкие уровни активности ФСГ / ЛГ снижали овуляторный ответ у неполовозрелых крыс, а добавление ЛГ к eCG уменьшало суперовуляторный ответ у коров.5,13
Сообщалось, что очищенные экстракты гипофиза с низким содержанием ЛГ улучшают суперовуляторную реакцию у крупного рогатого скота. Chupin и др.25 сверхстимулировали три группы молочных коров равным количеством очищенного свиного (p) ФСГ - 450 мкг и различными количествами ЛГ, и показали, что средний коэффициент овуляций, общее количество эмбрионов и количество трансферабельных эмбрионов увеличивались с уменьшением дозы ЛГ. Было высказано предположение, что высокие уровни ЛГ во время суперстимуляции вызывают преждевременную активацию ооцита.16 Ряд экспериментов с экстрактом гипофиза с пониженным содержанием ЛГ26 в нескольких различных дозах, в пределах от 100 до 900 мг NIH-FSH-PI, не выявили никаких доказательств пагубного влияния дозы на качество эмбриона.6,27 С другой стороны, удвоение дозы сырых экстрактов гипофиза, содержащих как ФСГ, так и ЛГ, привело к значительному снижению частоты оплодотворения и процента пригодных к пересадке эмбрионов.6 В совокупности данные подтверждают гипотезу о том, что пагубное воздействие высоких доз гонадотропинов гипофиза на качество яйцеклеток / эмбрионов связано с избытком ЛГ.
Хотя обычно считается, что для успешной суперовуляции требуется некоторое количество ЛГ, уровень эндогенного ЛГ может быть достаточным. Looney и др.28 сообщили, что рекомбинантно полученный бычий (b) ФСГ вызывал высокие суперовуляторные реакции без добавления экзогенного ЛГ. Эти данные предполагают, что ЛГ не нужен в суперстимулирующих препаратах и что качество эмбриона может быть лучше при использовании чистого ФСГ. Очень высокая частота оплодотворения и частота переносимых эмбрионов в отсутствие экзогенного ЛГ предполагают, что введение ЛГ в протоколах суперстимуляции в любой дозе может быть вредным для качества эмбриона. Кроме того, эти результаты и более свежие данные с рекомбинантным bFSH29 указывают на то, что будущий прогресс заключается в использовании рекомбинантно-полученных гонадотропинов.
Влияние ЛГ на суперовуляторную реакцию также было продемонстрировано в эксперименте с телками кросса Брахман (Bos indicus), суперстимулированных 400 мг NIH-FSH-PI, содержащим 100%, 16% или 2% ЛГ.30 Хотя более очищенные препараты в этом эксперименте вызвали более высокие суперовуляторные реакции, наблюдались очевидные сезонные закономерности; реакции с наиболее очищенными и промежуточными препаратами превосходили наименее очищенный препарат в летние месяцы, но только наиболее очищенный препарат был высокоэффективным в зимние месяцы. Эти результаты, по-видимому, противоречат выводам Page и др.31 , которые сообщили, что суперовуляторная реакция и качество эмбрионов у телок
голштинской породы не зависели от уровня ЛГ в прохладную погоду, но во время теплового стресса более очищенный препарат давал больше желтых тел и значительно больше оплодотворенных яйцеклеток и трансферабельных эмбрионов. Становится очевидным, что стресс - это общий фактор; породы Bos taurus, вероятно, испытывают в летнюю жару стресс, в то время как породы Bos indicus, скорее всего, испытывают стресс в зимних условиях. В любом случае более очищенные экстракты приводили к более выраженным суперовуляторным ответам в условиях стресса под влиянием окружающей среды.
Волновая динамика фолликулов и суперстимуляция
Сообщалось, что суперстимулирующий ответ выше, если лечение начато до отбора доминантного фолликула. В одном раннем исследовании рекомбинантный bФСГ, введенный телкам в 1-й день цикла (овуляция = день 0), до периода отбора доминантного фолликула волны 1, приводил к большему количеству овуляций, чем на 5-й день, после отбора.32 Последующее исследование было проведено, чтобы определить, оказывает ли экзогенный ФСГ, введенный в ожидаемое время всплеска эндогенного волнового ФСГ, положительный эффект на сверхстимулирующий ответ.33 Поскольку ожидалось, что эндогенный выброс ФСГ достигнет пика за 1 день до появления волны,34 обработку начинали за день до, непосредственно в день или через 1-2 дня после появления волны. Значительно больше фолликулов было рекрутировано (отобрано) , когда лечение было начато в день или за день до появления фолликулярной волны, и было обнаружено больше овуляций, когда лечение было начато в день появления волны, а не за день до или через 1-2 дня после ее появления. Последующее исследование показало, что суперовуляция вызывалась с равной эффективностью, когда лечение было начато как во время первой так и во время второй фолликулярной волны, и что суперстимулирующий ответ был лучше, когда лечение начиналось во время появления фолликулярной волны.35
Суперстимуляция: традиционный подход
На самых ранние этапах формирования эмбриотрансфера крупного рогатого скота обработка eCG была согласована с естественной регрессией желтого тела (то есть примерно на 16-й день цикла).12 С введением PGF2α в 1970-х годах стало возможным начинать лечение гонадотропинами в другое время на протяжении эстрального цикла, и большинство практикующих врачей начинали лечение с ФСГ в середине цикла (то есть через 8–12 дней после эструса).36,37 Хотя первоначально этот подход был основан на случайных свидетельствах, а затем на некоторых экспериментальных данных,38 теперь известно, что он включает время появления второй фолликулярной волны у коров, демонстрирующих двух- или трехволновые циклы.39,40
Многие практикующие врачи предпочитают сокращать график дозирования ФСГ и вводить PGF2α на третий день протокола, в то время как другие предпочитают вводить PGF2α на четвертый день, а многие вовсе не обрабатывают ФСГ на следующий день после введения PGF2α. Хотя не было обнаружено различий между 4- и 5-дневными протоколами лечения, недавние эксперименты показали, что число овуляций может быть улучшено у некоторых доноров, если лечение ФСГ продлено до 6 или 7 дней.41, 42
Тем не менее, большинство протоколов суперстимуляции в большинстве случаев успешно вызывают суперовуляцию.
Третьи включают в протокол прогестиновый инплант, который гарантирует, что у доноров не произойдет преждевременная охота, особенно если невозможно подтвердить наличие желтого тела до начала обработки ФСГ. Во всех случаях осеменение обычно проводится через 12 и 24 часа после начала течки.11,37
Хотя способ суперстимуляции, начиная с середины цикла служил индустрии эмбриотрансфера на протяжении многих лет, традиционные протоколы стимуляции имеют два недостатка: 1) требование наличия обученного персонала для выявления течки как до, так и после начала лечения; и 2) необходимость иметь всех доноров в эструсе одновременно, чтобы начать суперстимулирующую терапию в наиболее подходящее время для групп коров (т. е. в середине цикла). Чтобы избежать этих проблем, были разработаны протоколы, которые облегчают суперстимуляцию после плановой индукции появления фолликулярной волны.
Синхронизация появления фолликулярной волны для суперовуляции
Эстрадиол и прогестерон
Способность выборочно вызывать появление фолликулярной волны позволяет инициировать суперстимуляцию независимо от стадии эстрального цикла и устраняет необходимость обнаружения течки или ожидания 8–12 дней для начала лечения гонадотропинами.37 В 1990-х годах сообщалось об использовании прогестинов и эстрадиола для синхронного возникновения новой фолликулярной волны36 , и их использование в протоколах суперстимуляции было подробно рассмотрено.37,43 Лечение эстрадиолом вызывает подавление высвобождения ФСГ и атрезию фолликулов. Как только эстрадиол метаболизируется, скачки уровня ФСГ и новая фолликулярная волна возникает в среднем через 4 дня после лечения.36,44 Самый распространенный протокол включает введение 5 мг эстрадиола-17β или 2,5 мг эстрадиола бензоата плюс 100 или 50 мг прогестерона путем внутримышечной инъекции во время установки интравагинального прогестинового инпланта (день 0).37,43 Затем на 4-й день начинают внутримышечное введение ФСГ два раза в день. На 6-й день вводят PGF2α утром и вечером, а вечером удаляют прогестероновый инплант. Эструс обычно наступает на 8-й день (примерно через 48 часов после первой инъекции PGF2α), а осеменение проводится через 12 и 24 часа.
К сожалению, эстрадиол нельзя использовать во многих странах мира из-за опасений по поводу воздействия эстрогенных веществ на пищевую цепь.45 Это ограничение ставит многих практикующих специалистов по пересадке эмбрионов перед серьезной дилеммой и создает необходимость в разработке методов лечения, не связанных с использованием эстрадиола.
Абляция (удаление) фолликула
Альтернативой использованию эстрадиола в протоколах суперстимуляции является устранение подавляющего эффекта доминантного фолликула путем аспирации всех фолликулов размером 5 мм и более под контролем УЗИ.46 Появление фолликулярной волны происходит почти всегда через 24–36 часов, и в это время начинают обработку суперстимуляторами. Такой подход к синхронизации появления фолликулярной волны для суперстимуляции очень эффективен и приводит к ответным суперовуляторным реакциям, которые не отличаются от таковых при использовании эстрадиола.46
Кроме того, было обнаружено, что необходимо удалить только два самых крупных фолликула, чтобы эффективно синхронизировать появление волны.47 Протокол включает удаление двух самых крупных фолликулов на случайных стадиях эстрального цикла и введение прогестеронового импланта; обработка ФСГ начинается через 24–48 часов, а оставшаяся часть протокола такая же, как описано выше. Недостатком аспирации фолликулов под контролем УЗИ является то, что она требует ультразвукового оборудования и обученного персонала, что делает ее целесообразной только тогда, когда доноры содержатся на предприятии по производству эмбрионов; ее очень сложно применять в полевых условиях.
Гонадотропин-рилизинг-гормон
Другой альтернативой синхронизации фолликулярной волны является индукция овуляции доминантного фолликула с помощью гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ)48,49 , за которой через 1-2 дня возникает новая волна.50 Однако, появление новой фолликулярной волны синхронизируется только тогда, когда инъекция вызывает овуляцию, а при введении на случайных стадиях эстрального цикла ГнРГ приводит к овуляции менее чем у 60% животных.50,51 Неудивительно, что обработка гонадолиберином перед началом суперстимуляции на случайных стадиях эстрального цикла приводила к более низким суперовуляторным ответам, чем обработка после абляции (удаления) фолликулов или инъекции эстрадиола.52 Совсем недавно ретроспективный анализ данных, полученных при коммерческой пересадке эмбрионов не выявил различий в количестве полученных эмбрионов между донорами, подвергнутыми сверхстимуляции через 4 дня после лечения эстрадиолом, и теми, которые были сверхстимулированы через 2 дня после лечения гонадолиберином (Randall Hinshaw, личное сообщение).53,54 Примечательно, что в каждом из этих отчетов ГнРГ вводили через 2 дня после введения прогестеронового устройства. Более лучшие ответные реакции на стимуляцию могли быть следствием того, что прогестерон способствовал развитияю персистентного доминантного фолликула, который был более чувствителен к лечению ГнРГ.55 Очевидно, что для подтверждения этих многообещающих результатов необходимо провести контролируемые исследования с использованием ГнРГ.
Улучшение овуляторного ответа на гонадолиберин
Большинство протоколов искусственного осеменения (ИО) с фиксированным временем, использующих ГнРГ для синхронизации появления фолликулярной волны, включают этап пресинхронизации для улучшения овуляторной реакции на первую инъекцию ГнРГ.55,56 Другой альтернативой является синхронизация овуляции с последующей обработкой ФСГ во время появления первой фолликулярной волны.33 Чтобы избежать необходимости определять охоту и овуляцию у доноров Nelore (Bos indicus), Nasser и др.57 индуцировали синхронизацию овуляции с помощью протокола на основе эстрадиола, разработанного для осеменения по фиксированному времени. Затем коров обработали гонадотропинами в ожидаемое время овуляции (и появления первой фолликулярной волны). Суперовуляторный ответ не отличался от группы, одновременно подвергнутой суперстимуляции через 4 дня после лечения эстрадиолом. Однако, количество трансферабельных эмбрионов было снижено у коров, подвергнутых суперстимуляции во время первой фолликулярной волны, если это не сопровождалось использованием прогестеронового устройства. Аналогичные результаты были получены Rivera и соавторами.58 В их исследовании коровы голштинской породы, подвергнутые суперстимуляции во время первой фолликулярной волны, также дали большее количество жизнеспособных эмбрионов после добавления прогестинового устройства.
PGF2α в день D3 вечером
и в день D4 утром
PGF2α GnRH Сбор яйцеклеток
GnRH AI AI /эмбрионов
D-8 D-1 D0 D3 D4 D5 D5 D6 D12
вечер утро вечер вечер утро утро вечер утро утро
| FSH | |||
|---|---|---|---|
| Прогестероновый имплант | |||
Рис. 75.1 Протокол суперовуляции коров-доноров во время первой фолликулярной волны после овуляции, вызванной ГнРГ (GnRH). Доноры получают прогестиновое устройство вместе с PGF2α с последующим введением ГнРГ через 7 дней. В день (D)0 (36 часов после ГнРГ) начинается суперстимуляция ФСГ (два раза в день с уменьшением дозы в течение 4 дней). PGF2α вводят с двумя последними инъекциями ФСГ, а прогестиновый аппарат удаляют одновременно с последней инъекцией ФСГ. Овуляция индуцируется ГнРГ через 24 часа после удаления прогестина, доноров осеменяют в фиксированное время (AI) через 12 и 24 часа, а яйцеклетки / эмбрионы собирают через 7 дней. От Bó G, Carballo Guerrero D, Tríbulo A и др.Новые подходы к суперовуляции у коров.Reprod Fertil Dev 2010;22:106–112.
Bó и др.59 недавно сообщили о серии экспериментов с целью разработки протокола суперстимуляции после овуляции, синхронно индуцированной введением гонадолиберина. Этот подход был основан на предыдущем исследовании, в котором овуляторный ответ увеличивался за счет развития стойкого фолликула при введении PGF2α и введении прогестинового устройства за 7-10 дней до введения ГнРГ.55 В этом исследовании овуляция и появление фолликулярной волны происходили через 1-2 дня после введения ГнРГ, что указывает на то, что этот подход может быть использован в группах доноров с рандомным циклом.
Рекомендуемый протокол суперстимуляции схематически представлен на рисунке 75.1. Он включает инъекцию PGF2α во время введения прогестинового устройства. Семь дней спустя (когда устройство с прогестином все еще на месте) вводят гонадолиберин, чтобы вызвать овуляцию персистентного фолликула и появление фолликулярной волны; лечение ФСГ начинается через 36 часов после введения ГнРГ. Хотя этот протокол был разработан для 4-дневного лечения ФСГ, можно выполнить 5-дневный протокол суперстимуляции, просто отложив извлечение прогестинового устройства на 1 день. В целом в этой серии экспериментов более 95% животных овулировали к (или после?? овулировали в ответ на первое введение GnRH) первой инъекции ГнРГ, и суперовуляторная реакция, а также количество и качество яйцеклеток / эмбрионов были аналогичны тем, что были получены при использовании эстрадиола для синхронизации появления фолликулярной волны.59
Фиксированное по времени осеменение доноров
Barros и Nogueira60 разработали протокол суперстимуляции для крупного рогатого скота Bos indicus, который они назвали P-36 протокол. В этом протоколе прогестиновое устройство, которое вводится до начала суперстимулирующей терапии, остается на месте в течение 36 часов после инъекции PGF2α и овуляция индуцируется введением pLH (porcine luteinizing hormone - свиной лютеинизирующий гормон) через 12 часов после извлечения прогестинового устройства (то есть через 48 часов после введения PGF2α). Поскольку овуляция происходит между 24 и 36 часами после инъекции LH61 осеменение проводят в фиксированное время через 12 и 24 часа, что устраняет необходимость в выявлении охоты.
В серии экспериментов, в которых время овуляции контролировалось ультразвуком, Bó и др.11 разработали протокол для доноров Bos taurus с фиксированным временем ИО без необходимости выявления охоты и без ущерба для результатов. По сути, время удаления прогестинового устройства откладывалось, чтобы предотвратить раннюю овуляцию и позволить поздно развивающимся фолликулам «наверстать упущенное» с последующей индукцией овуляции с помощью ГнРГ или pLH. В этом протоколе появление фолликулярной волны было синхронизировано эстрадиолом и прогестиновым устройством в день 0, а лечение ФСГ было начато на 4 день. На 6 день вводили PGF2α утром и вечером, а прогестиновое устройство было удалено утром на 7 день (через 24 часа после первого введения PGF2α). Утром 8-го дня (через 24 часа после удаления прогестинового устройства) вводили GnRH или pLH, а через 12 и 24 часа проводили ИО в фиксированное время. Отсрочка извлечения прогестинового устройства до утра 7-го дня привела к сбору большего количества яйцеклеток / эмбрионов и оплодотворенных яйцеклеток, чем его удаление утром 6-го дня (P. Chesta, докторская диссертация, Национальный университет Кордовы, Аргентина, 2010). С практической точки зрения, ИО доноров в фиксированное время показало свою эффективность в том плане, что специалистам по пересадке эмбрионов не нужно выявлять охоту.62.
Исследования на высокопродуктивных коровах голштинской породы (Bos taurus) в Бразилии показали, что для них предпочтительно подождать еще 12 часов перед удалением прогестинового устройства (например, на 7-й день вечером; P36), а затем через 24 часа ввести ГнРГ или pLH (т.е. вечером на 8 день).63 Подтверждено также, что у пород Bos indicus Baruselli и др.64 предпочтительнее удалить прогестиновое устройство вечером 7-го дня (P36), а затем инъецировать ГнРГ через 12 часов (т. е. утром 8-го дня). Хотя доноров обычно осеменяют дважды, через 12 и 24 часа после введения pLH или ГнРГ11 , можно использовать однократное осеменение высококачественной спермой через 16 часов после pLH.64
Снижение потребности в нескольких инъекциях ФСГ
Поскольку период полувыведения гипофизарного ФСГ у коровы короткий,8 традиционные протоколы суперстимулирующей терапии состоят из внутримышечных инъекций ФСГ два раза в день в течение 4 или 5 дней.9 Это требует частого внимания со стороны персонала фермы и увеличивает вероятность неудач из-за несоблюдения протокола. Кроме того, инъекции два раза в день могут вызвать чрезмерный стресс у доноров с последующим снижением суперовуляторной реакции и / или изменением преовуляторного выброса ЛГ.65,66
