введение PGF2α в матку до проверки чашек на наличие эмбрионов лишает вас возможности при необходимости повторно промыть матку донора. Двукратного внутримышечного введения на 10-й день (через 3 дня после промывания) будет достаточно для предотвращения стельности, если можно положиться на то, что владелец не забудет сделать инъекции.
Полезные советы
Проба с покачиванием
Даже когда катетер проходит через шейку матки нормально, иногда он закупоривается. После введения первой порции жидкости и до начала массажа концов рогов матки можно с помощью простого теста убедиться, что просвет катетера проходим. Пока жидкость находится в матке, до открытия выпускного зажима и пальпации концов рогов осторожно сожмите область раздвоения два-три раза. При каждом сжатии вы должны увидеть, как пузырьки воздуха проходят из катетера обратно в прозрачную трубку: это свидетельствует о проходимости. Если жидкость или пузырьки не движутся в каудальном направлении, значит, есть проблема с оттоком. Если её не удаётся устранить массажем кончика катетера, изменением степени раздувания манжеты или перемещением манжеты в теле матки, сейчас самое подходящее и безопасное время, чтобы извлечь катетер и ввести новый. Если вы ещё не массировали концы рогов матки, потеря эмбрионов крайне маловероятна.
Метод вымывания слизи
Когда провести катетер через шейку матки трудно, его боковые отверстия возле кончика нередко забиваются шеечной слизью. Избыток слизи в чашке для промывочной жидкости — враг специалиста. Слизь можно легко удалить вымыванием до того, как жидкость попадёт в рога матки. Раздув манжету катетера в теле матки, обхватите большим и указательным пальцами оба рога непосредственно перед телом матки (рисунок 76.16). Быстро введите через катетер 15–20 mL среды и сразу откройте выпускную трубку, дав жидкости стечь на пол. Повторите это два-три раза, пока в жидкости, вытекающей из выпускной трубки, не перестанет быть слизи. Помните: оба рога нужно держать пережатыми, чтобы жидкость поступала только в тело матки и вытекала только из него. Отсоедините трубку от катетера и тщательно промойте её, прежде чем снова присоединять к катетеру и чашке для сбора промывочной жидкости.
Сбор эмбрионов на открытом воздухе в холодную погоду
Чтобы среда не остывала, мы используем два пластиковых выдвижных ящика, которые можно поставить друг на друга (из Wal-Mart). На дне каждого лежит небольшой электрический коврик с подогревом. В верхнем ящике на коврике лежит пакет со средой. В нижнем ящике чашка с фильтром стоит на переднем краю коврика; там сделано отверстие, через которое жидкость из фильтровальной чашки стекает на пол.
Чтобы защитить трубку, идущую от коровы к чашке, мы используем отрезок вспененной теплоизоляции для водопроводных труб длиной 120–cm, разрезанный вдоль по всей длине. Мы помещаем трубку внутрь этого отрезка, чтобы жидкость во время промывания оставалась относительно тёплой. При сильном холоде внутри изоляции можно также проложить электрический нагревательный кабель.
Заключительные замечания о сборе эмбрионов
Сбор эмбрионов — сложная и увлекательная процедура для специалистов. Постоянно появляются новые идеи относительно методик, инструментов и материалов, которые затем испытываются на практике. Надеюсь, вы выработаете надёжную методику, в которой будете уверены, научитесь успешно работать со всеми нормально устроенными матками и достаточно хорошо ориентироваться во всех случаях сбора эмбрионов при аномальном строении матки. Даже спустя 35 лет меня по-прежнему удивляет, что всё это действительно работает и что мы можем с таким удовольствием зарабатывать на жизнь, помогая своим клиентам содействовать генетическому прогрессу в скотоводстве.
Теперь вы готовы передать чашку для поиска эмбрионов под микроскопом, их оценки и подготовки к пересадке в свежем виде или замораживанию. Поскольку эти вопросы рассматриваются в других главах, перейдём к методике нехирургической пересадки свежих и замороженных эмбрионов.
Пересадка эмбриона
Нехирургическая пересадка эмбрионов прекрасно иллюстрирует старую поговорку: «Цепь не прочнее своего самого слабого звена». Успех зависит от многих факторов, на некоторые из которых вы как специалист повлиять не можете. Сейчас я гораздо лучше, чем раньше, понимаю, насколько многочисленные внешние воздействия влияют на моих
потенциальных реципиентов. Возможно, в этом обсуждении вы найдёте для себя пару полезных идей.
Дефицит минеральных веществ
В каждом регионе США существуют свои потребности в дополнительном введении минеральных веществ. Вам следует знать потребности своего региона.
Отбор животных в группу потенциальных реципиентов
Я часто говорю: «По внешнему виду коровы можно судить о состоянии её внутренних органов». Коровы с неудовлетворительной упитанностью, тусклой шерстью, которых содержат в грязных загонах, обычно не лучший выбор. Итак, при отборе мы обращаем внимание на следующее. ( Примечание редактора : Отбор реципиентов и управление стадом подробно рассматриваются в главе 78. Ниже дан обзор аспектов, которые автор считает решающими для общего успеха программы трансплантации эмбрионов.)
Размер
Трудные роды — наш враг. Мёртвые телята никого не впечатляют, особенно нашего банкира. При включении коров в группу реципиентов учитывайте ожидаемую массу телёнка при рождении в зависимости от породы эмбриона. Если используются тёлки, я в основном выбираю только помесей молочных пород или крупных тёлок мясных пород массой не менее 360 kg на момент начала синхронизации (вообще-то я предпочитаю тёлок массой 385–408 kg).
Молочная продуктивность
Здоровое вымя — наш союзник. Получить живого телёнка — лишь выиграть первую схватку. Реципиент должна давать достаточно молока, чтобы вырастить отличного телёнка. При пересадке эмбрионов молочных пород это неважно, поскольку телят будут выпаивать из бутылки.
Предшествующая история
По возможности очень полезно знать, что реципиент регулярно телилась и каждый год рано приходила в охоту. Однако часто такие сведения недоступны.
Темперамент
Неуправляемые реципиенты мне ни к чему. С каждой приходится часто работать, поэтому спокойный нрав — важное подспорье. Он также передаётся телёнку, который должен представлять гораздо большую ценность, чем его мать.
Минимальный стресс
Стрессовые факторы необходимо устранять. Нужны подходящие укрытия от зимнего холода и от жары в остальные месяцы. Загоны, раскисшие от грязи, — враги. Травянистые пастбища — друзья. Свежая вода — друг. Застоявшаяся вода в прудах или поилках — враг. Для успеха необходимо отличное качество кормовых трав.
Биобезопасность
Несколько заболеваний могут сорвать программу трансплантации эмбрионов; они подробно рассматриваются в главе 80. Проверяйте всех реципиентов и исключайте из стада животных с положительным результатом анализа на следующие заболевания.
Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота
Животные с персистентной инфекцией вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV) появляются, когда стельная корова подвергается воздействию BVDV между 30 и 150 днями стельности. Если такие животные рождаются живыми, они выделяют жизнеспособный BVDV с рождения до смерти. Большинство погибает к возрасту 1 года, но сообщения о животных, проживших до 7 лет, подчёркивают необходимость их выявления и удаления из стада. У всех животных моложе 6 месяцев берите образец ткани из ушной раковины, а у остальных исследуйте сыворотку методом ИФА или также берите образец ткани из ушной раковины.
Лактация
Лактирующие коровы в хорошей упитанности обычно становятся отличными реципиентами. Как правило, коров можно использовать через 45–50 дней после отёла если они находятся в хорошем состоянии. Сухостойные коровы — отличные реципиенты, если их намеренно оставили нестельными. Но если у них были проблемы с осеменением, они уже отлучили телёнка или их запустили, лучше их не использовать.
Оценка упитанности
Оптимальная для плодовитости оценка упитанности (BCS) составляет 4–6 по шкале из 1–9 баллов. Если у мясного крупного рогатого скота с BCS 3 заметно выступают рёбра и позвоночник, такие коровы, как правило, находятся на грани прекращения половой цикличности. Если цикл у них вообще сохраняется, жёлтые тела обычно меньше и плотнее. Результаты использования таких коров обычно разочаровывают. Чрезмерно упитанные коровы и тёлки приобрели дурную репутацию из-за представления о том, что «жирные коровы бесплодны». Однако мой опыт показывает, что если корова растолстела потому, что её намеренно оставили нестельной или перекармливали, её плодовитость всё же будет вполне приемлемой. Но если реципиент уже пересадили два эмбриона или провели несколько безуспешных попыток искусственного осеменения (не более трёх), её следует пустить к быку или выбраковать.
Neospora canis
Это заболевание, связанное с псовыми, вызывает аборты у заражённых коров и, как предполагается, встречается главным образом к западу от реки Миссисипи. За последние 8 лет мы обследовали более 8000 реципиентов мясных пород и помесей мясных и молочных пород в Теннесси, Кентукки и Алабаме и обнаружили заражение у 9% из них. Neospora -положительные коровы заражают 100% своих телят внутриутробно . Бычки заражаются, но не страдают от болезни и не могут её передавать. У самок возможен аборт; если же его не происходит, они заражают каждую рождённую ими тёлочку. Коровы заражаются Neospora при поедании сена, силоса или корма, загрязнённых фекалиями псовых, содержащими ооцисты Neospora (собак или койотов). Neospora -положительных доноров можно безопасно подвергать вымыванию эмбрионов, пересаживая полученные эмбрионы отрицательным реципиентам. Используйте доступные серологические анализы на Neospora .
Болезнь Йоне
Исследование сыворотки ненадёжно, но подходит для предварительного скрининга. Лучше всего бактериологическое исследование кала, однако оно требует много времени. Тестирование и удаление животных с положительным результатом должны поддерживать низкую распространённость инфекции в стаде. Заражённые коровы передают болезнь Йоне внутриутробно 26%
случаев. Большинство остальных случаев заражения происходит через рот, когда новорождённый телёнок сосёт соски коровы.
Лейкоз крупного рогатого скота
Некоторым молочным хозяйствам удалось получить стада, свободные от вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV), благодаря выбраковке животных, разделению стад и использованию молозива от коров, свободных от BLV. При нынешнем уровне заражённости в Соединённых Штатах сделать это очень трудно. Лучшая профилактическая мера — тестировать коров и выделять животных с положительным результатом в отдельное стадо либо, если возможно, продавать их. Вирус передаётся с кровью при использовании одних и тех же игл, одной и той же перчатки-рукава для ректального исследования всех коров, а также через крупных кровососущих насекомых. Для профилактики используют новую иглу для каждой коровы, меняют перчатку-рукав после каждого животного и дают молозиво от коров с отрицательными результатами анализов.
Вакцинация
Всех реципиентов следует вакцинировать против BVDV, вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR), вируса парагриппа 3, респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота и лептоспироза. По моему мнению, инактивированные вирусные вакцины безопаснее, но менее эффективны. Для нестельных животных лучше всего подходят вакцины на основе модифицированного живого вируса (MLV), обеспечивающие защиту плода от BVDV. Если используется вакцина MLV против IBR, плодовитость реципиентов в течение 30 дней будет снижена: вирус IBR поражает жёлтое тело, что приводит к снижению уровня прогестерона. Соблюдайте осторожность. К стандартной пятивалентной вакцине против лептоспироза необходимо добавить вакцину, содержащую Leptospira borgpetersonii (серовар Hardjo). Этот вариант вызывает не только аборты, но и бесплодие, а также раннюю гибель эмбрионов. Он стал серьёзной проблемой на большей части территории Соединённых Штатов. При необходимости применяйте и другие вакцины с учётом условий вашего региона.
Синхронизация реципиентов
Синхронизация охоты рассматривается в главе 33. Используйте способ, который лучше всего подходит для вашего хозяйства. Опыт и данные показали нам, что естественная охота не обеспечивает более высокую плодовитость, чем индуцированная. Сегодня многие специалисты применяют протоколы трансплантации эмбрионов в фиксированное время, при которых выявлять охоту не требуется. Этот метод предпочтителен для хозяйств со средним уровнем организации работы и неудовлетворительным выявлением охоты. Если хозяйство хорошо организовано и располагает отлично обученными сотрудниками, умеющими выявлять охоту, я предпочитаю ориентироваться на наблюдаемую охоту. При работе с очень ценными эмбрионами такой подход надёжнее.
Трансплантация эмбрионов в фиксированное время даёт немного меньшую долю стельных животных, но позволяет получить больше стельностей в группе реципиентов. Например, если в группе синхронизированы 100 реципиентов и охоту выявляют и регистрируют, примерно у 85 из них она будет замечена в допустимый период, или временное «окно». В среднем у 75 из этих 85 будут хорошие жёлтые тела, и им пересадят эмбрион. Если трансплантацию в фиксированное время применить к 100 реципиентам, примерно у 92 из них будут жёлтые тела, то есть будет пересажено 92 эмбрионов. При доле стельных животных 60% в группе с наблюдаемой охотой и 55% в группе с трансплантацией в фиксированное время общее число стельностей составит соответственно 45 и 50.6 (причём во втором случае труд на выявление охоты не затрачивается).
Допустимая степень синхронности реципиентов
Обычно мы используем реципиентов, у которых охота наступила в пределах от 24 часов до охоты у донора (охота на 8-й день) до 48 часов после неё (охота на 5-й день). Разумеется, реципиенты 7-го дня всегда предпочтительнее. Необходимо учитывать несколько обстоятельств.
-
Свежие эмбрионы переносят большую асинхронность, чем замороженные. Для замороженных эмбрионов я предпочитаю реципиентов от дня 7 (полная синхронность) до дня 5.5 (36 часов после донора), тогда как для свежих эмбрионов подходят реципиенты 5–8-го дня.
-
Если в определённый день получено больше эмбрионов, чем имеется реципиентов, эмбрионы класса 2 и класса 3 обычно пересаживают свежими, а эмбрионы класса 1 замораживают (см. оценку эмбрионов в главе 79).
-
Замороженные эмбрионы подверглись стрессу, поэтому нуждаются в более точной синхронизации. Я редко использую реципиента 8-го дня, но без колебаний использую реципиента 5.5-го дня для замороженных эмбрионов.
-
• Сегодня широко доступны эмбрионы, полученные методом IVF, как свежие, так и замороженные. Для эмбрионов IVF мы применяем те же критерии синхронности, что и для замороженных эмбрионов.
Подготовка реципиента
И вот наконец мы заводим первого реципиента в станок. К реципиентам применим тот же принцип кормления, что и к донорам: наполненный рубец — наш друг, пустой — враг. Никогда не лишайте животных корма: при наполненном животе проводить трансплантацию гораздо легче.
Когда реципиент входит в станок, я эпидурально ввожу 3–5 mL лидокаина и быстро провожу пальпацию, чтобы убедиться в наличии хорошего жёлтого тела. Если жёлтое тело хорошее, а состояние матки при пальпации приемлемо, я заряжаю соломинку с эмбрионом в инструмент IMV для трансплантации эмбрионов размером 52–cm с синим чехлом и сразу же пересаживаю эмбрион. Каждой реципиенту я обязательно устанавливаю идентификационную ушную бирку с указанием родительской пары и предполагаемой даты отёла.
Всегда возникает вопрос, допустимо ли перегонять или перевозить реципиентов к месту трансплантации и обратно. Единственное, что вызывает у меня сомнения, — очень жаркая или очень холодная погода. Перевозка на небольшое расстояние не должна влиять на долю стельных животных.
Место введения эмбриона
Эмбрионы следует вводить в рог матки со стороны жёлтого тела как можно глубже, но не травмируя ткани (рисунок 76.17). Простагландин — наш враг; он присутствует в клетках эндометрия. Если, продвигая инструмент для трансплантации эмбрионов по рогу матки, мы повреждаем ткани, из каждой повреждённой клетки «вытекает» PGF2α. Чтобы плавно направлять инструмент, не задевая и не «ударяя» стенку матки, нужно осторожно надавливать на него плоско расположенными пальцами. Для этого необходимы следующие условия.
Фиксация реципиента
Некоторые животные стоят спокойнее, когда их голова не зафиксирована в головном фиксаторе, тогда как других необходимо зафиксировать и зажать. Очень досадно, когда эмбрион уже почти доставлен к месту введения, а реципиентка внезапно начинает неистово вырываться или пугается
