остатки часто можно смыть с блестящей оболочки при промывании эмбрионов по процедуре, одобренной IETS.19 В некоторых случаях может потребоваться промывание в растворе трипсина 0.25%. Промывание эмбрионов с неповреждённой блестящей оболочкой в соответствии с рекомендациями IETS должно удалять прилипшие остатки, а также многие патогены.
Наличие остатков, прилипших к наружной поверхности блестящей оболочки, не обязательно влияет на присвоение эмбриону категории качества. Однако любой эмбрион с прилипшим материалом не допускается к коммерческой торговле ни внутри страны, ни на международном рынке.
Трудности точной оценки качества и классификации эмбрионов
Одна из самых сложных задач для специалистов, обучающихся оценивать качество и классифицировать эмбрионы, — правильно отличать компактную морулу от неоплодотворённой яйцеклетки (UFO): эти два объекта могут быть очень похожи по размеру, форме и цвету. На рисунке 79.21 рядом показаны компактные морулы и неоплодотворённые яйцеклетки, и нетрудно представить, как неопытный специалист может по ошибке описать все эти объекты либо как компактные морулы, либо как неоплодотворённые яйцеклетки. Особенно вероятна такая ошибка при изучении образцов с меньшим увеличением или с помощью стереомикроскопа с низким качеством оптики. Компактная морула отличного качества и UFO при большем увеличении показаны на рисунках 79.22 и 79.23. Эти изображения хорошо показывают, насколько трудно иногда различить такие две стадии развития. Как отмечалось ранее, исключительно важно уметь отличать компактную морулу от UFO, чтобы не допустить переноса (или криоконсервации) неоплодотворённой яйцеклетки и/или выбраковки компактной морулы. По мере накопления опыта оценки эмбрионов различать эти две стадии становится легче.
Другая распространённая ошибка классификации возникает, когда часть неоплодотворённой яйцеклетки дегенерирует и светлеет, становясь похожей на полость бластоцеля у эмбриона на стадии бластоцисты (рисунок 79.24). Опытные специалисты могут различить эти объекты по слою трофобласта, который «окружает» полость бластоцеля у эмбриона на стадии бластоцисты, а также по клеткам внутренней клеточной массы (ICM), которые присутствуют только в бластоцисте.
(a)
(b)
Рисунок 79.22 Неоплодотворённая яйцеклетка (a) и эмбрион на стадии компактной морулы отличного качества (b).
Совет по оценке эмбрионов
Хотя неопытные специалисты могут допускать серьёзные ошибки при оценке качества и классификации эмбрионов, опытные эмбриологи редко ошибаются настолько сильно. Чаще всего опытные специалисты расходятся во мнениях при разграничении эмбрионов отличного или хорошего и удовлетворительного качества, а также при разграничении
(a)
(b)
(a)
(b)
Рисунок 79.24 Дегенерирующая неоплодотворённая яйцеклетка с полупрозрачным участком (a) и эмбрион отличного качества на стадии ранней бластоцисты (b), у которого различимы слой трофобласта, полость бластоцеля и клетки внутренней клеточной массы.
эмбрионов удовлетворительного и низкого качества. Это связано с субъективным характером процедуры оценки эмбрионов.
Чтобы избежать ошибок при классификации эмбрионов и оценке их качества, крайне важно поворачивать эмбрионы в чашке Петри. Это позволяет специалисту тщательно осмотреть всю поверхность блестящей оболочки, а также клетки, составляющие эмбрион, со всех сторон. Это особенно важно, когда от донорских животных получают большое количество яйцеклеток и эмбрионов на разных стадиях развития и различного качества (рисунок 79.25). Тщательный визуальный осмотр снижает вероятность ошибок при оценке качества и классификации эмбрионов.
Каждый эмбрион следует осматривать отдельно, меняя фокусировку, и помнить при этом, что эмбрион — трёхмерный объект и одного двумерного
изображения недостаточно для правильной оценки. Затем эмбрион следует повернуть (с помощью пипетки для манипуляций с эмбрионами или осторожно вращая среду в чашке), чтобы рассмотреть его под другим углом. Рисунок 79.26 состоит из трёх частей (1, 2 и 3), на которых одна и та же группа из восьми эмбрионов показана под тремя разными углами. Обратите внимание, насколько по-разному выглядят одни и те же эмбрионы на этих изображениях. Эти три части рисунка наглядно показывают, почему для правильного выявления всех особенностей каждого эмбриона важно поворачивать его в чашке Петри. Поворот эмбриона и его осмотр под разными углами — ключ к правильной оценке качества и классификации.
Эффективность морфологической оценки эмбрионов
Морфологическая оценка эмбрионов остаётся одним из наиболее субъективных этапов всего процесса трансплантации эмбрионов. Фотографии, представленные в этой главе, изучили несколько эмбриологов. В большинстве случаев они согласились с определёнными для каждого эмбриона стадией развития и категорией качества. Однако по поводу категории качества некоторых эмбрионов возникли небольшие разногласия, чаще всего — между категориями 1 и 2. На двух фотографиях один из специалистов назвал эмбрион на стадии бластоцисты с категорией качества 1 неопознанным объектом. Вероятнее всего, эти расхождения возникли потому, что специалист не мог рассмотреть эмбрионы через стереомикроскоп и повернуть их, чтобы увидеть под разными углами.
Фотографии могут быть прекрасным учебным пособием, но они не заменяют наблюдения за эмбрионами под стереомикроскопом
и возможности поворачивать их. Одно исследование23 показало, что мнения шести опытных специалистов, оценивавших эмбрионы по видеозаписям, чаще совпадали в отношении стадии развития (89.2%), чем в отношении категории качества эмбрионов (68.5%). Невозможность поворачивать эмбрионы в чашке Петри и рассматривать их под разными углами, несомненно, способствовала этим расхождениям. Разногласия в определении стадии развития могут объясняться тем, что некоторые эмбрионы находились на переходе между двумя стадиями. При оценке качества расхождений было больше, когда требовалось различить эмбрионы хорошего и удовлетворительного качества. Вероятно, это отражает различия в подходах отдельных специалистов к оценке эмбрионов. При оценке эмбрионов отличного качества и дегенерировавших эмбрионов расхождений было меньше. Более частое совпадение мнений при оценке эмбрионов отличного качества, у которых мало «дефектов» или их нет вовсе, а также дегенерировавших эмбрионов, пожалуй, неудивительно.
Успешной оценке эмбрионов способствуют три ключевых условия: надлежащая подготовка, достаточный опыт и подходящее оборудование. Подготовка включает изучение нормальной морфологии эмбрионов в разные сроки после течки и значения любых отклонений от неё. Необходимо также научиться перемещать эмбрионы в чашке Петри, чтобы тщательно их осматривать. Достаточный опыт приобретается при изучении множества эмбрионов на всех стадиях развития и разных категорий качества. В идеале под руководством высококвалифицированного специалиста следует оценить сотни эмбрионов. При наличии подходящего стереомикроскопа опытные специалисты могут правильно оценить более 95% яйцеклеток и эмбрионов. Надлежащее оборудование включает стереомикроскоп с хорошей оптической
