Воспроизводство крупного рогатого скота

In vivo
Бахромка маточной трубы
Рог матки
Яйцевод
Яичник
День 1 День 2–4 День 5–7
(a) (b) (c) (d) (e) (f)
День –1 День 0 День 1–3 День 4–7
Созревание Оплодотворение Среда для культивирования эмбрионов 1 Среда для культивирования эмбрионов 2
Гормоны pH EDTA Незаменимые аминокислоты
EGF гепарин Таурин более высокая концентрация сахаров
цистеамин кофеин
In vitro

Рисунок 81.3 Сравнение развития эмбрионов in vivo и in vitro. В верхней части показано расположение эмбрионов на каждой стадии развития при их продвижении по половым путям. В нижней части выделены некоторые различия между средами, используемыми на разных этапах ЭКО. Микрофотографии: (a) зрелый ооцит с разросшимися клетками кумулюса (b) 2-клеточный эмбрион (c) 4-клеточный эмбрион (d) 16-клеточный эмбрион (e) ранняя бластоциста (f) бластоциста.

частота наступления стельности отмечалась, в порядке убывания, после переносаin vivo замороженных эмбрионов, свежих эмбрионов IVP дня -7, свежих эмбрионов IVP дня -8, замороженных эмбрионов IVP дня -7 и, наконец, замороженных эмбрионов IVP дня -8.²² Если рассматривать стадию развития независимо от возраста и категории качества, перенос большого числа эмбрионов, полученных in vivo, показал, что ранние бластоцисты (EB) и бластоцисты средней стадии развития (MB) обеспечивали более высокую частоту наступления стельности, чем морулы (M), экспандированные бластоцисты (XB) или вылупившиеся бластоцисты (HB).⁸⁶ Перенос эмбрионов класса 1 на день -7 на стадиях EB, MB или XB обеспечивает более высокую частоту наступления стельности, чем перенос соответствующих эмбрионов на день -8.

Синхронность состояния коров-реципиентов со стадией развития эмбриона — важный фактор наступления стельности. Для эмбрионов IVP днём 0 считается день оплодотворения, тогда как у реципиентов день 0 начинается с наступления стоячей охоты. При переносе эмбрионов нулевая синхронность означает перенос эмбриона реципиенту с соответствующим номером дня: например, эмбрион дня -7 переносят реципиенту, у которого охота наблюдалась 7 дней назад. Синхронность минус 1 день означает перенос эмбриона реципиенту, у которого охота наблюдалась на 1 день позже, чем соответствует возрасту эмбриона: например, эмбрион дня -7 переносят корове, у которой охота была 6 дней назад. Хотя такая система обозначений общепринята, она вводит в заблуждение: овуляция у реципиента происходит приблизительно через 12 часов после окончания охоты, которая длится в среднем 18 часов (день 0 начинается с наступлением стоячей охоты), тогда как оплодотворение in vitro происходит в течение нескольких часов. Следовательно, эмбрион IVP, обозначенный как эмбрион дня 7, фактически на 1 день старше эмбриона дня -7, полученного in vivo.^22,87 Эта асинхронность отражается на частоте наступления стельности. При переносе эмбрионов дня -7 реципиентам дня -6 она составляла 50.3% по сравнению с 55% у реципиентов дня -7 и 58% у реципиентов дня -8. Дополнительным подтверждением служат недавние данные Trans Ova Genetics, основанные более чем на 10 000 переносах: при использовании реципиентов дня -6, -7 и -8 для эмбрионов IVP дня -7 частота наступления стельности составляла соответственно 42, 50 и 49% (неопубликованные результаты Trans Ova Genetics). Чтобы избежать снижения частоты наступления стельности, по возможности не следует использовать реципиентов дня -6.

В настоящее время коммерческое получение эмбрионов крупного рогатого скота методом IVP успешно осуществляется в ряде лабораторий по всему миру. Компания BOVITEQ Inc. в Квебеке⁸⁸ и компания Trans Ova Genetics⁸⁹ и Em Tran, Inc.²² в США — компании, занимающиеся коммерческим переносом эмбрионов, которые успешно получали стельности после переноса эмбрионов, полученных методом OPU/IVP от бесплодных доноров. Кроме того, Trans Ova Genetics, Sexing Technologies и Ova Tech в США и BOVITEQ в Канаде в настоящее время получают большое количество эмбрионов IVP от здорового крупного рогатого скота. По оценкам, по состоянию на 2012 год эмбрионы OPU/IVP составляли приблизительно 10% от общего числа переносов эмбрионов в США (данные предоставлены Американской ассоциацией переноса эмбрионов).

Динамика числа переносов эмбрионов, полученных in vitro и in vivo, в мире по годам в период с 2000 по 2011 год показана на рисунке 81.4. Очевидно, что число переносов in vivo эмбрионов, полученных путём суперовуляции и извлечённых промыванием, оставалось относительно стабильным, тогда как число эмбрионов IVP ежегодно росло. В настоящее время в Бразилии получают больше эмбрионов IVP, чем в любой другой стране. Одна компания, In Vitro Brazil, сообщила, что в 2012 году перенесла более 200 000 эмбрионов IVP. По оценкам, на долю суперовуляции с последующим извлечением эмбрионов промыванием в настоящее время приходится лишь 9% переносов эмбрионов

Всего переносов эмбрионов in vitro Всего переносов эмбрионов in vivo
800 000
700 000
600 000
500 000
400 000
300 000
200 000
100 000
0
Год
2000 2002 2004 2006 2008 2010
Число переносов

Рисунок 81.4 Сравнение ежегодного числа переносов эмбрионов, полученных in vivo, и эмбрионов IVP в мире начиная с 2000 года. Предоставлено Международным обществом переноса эмбрионов.

Таблица 81.3 Аномальные признаки, связанные с синдромом крупного плода при стельности после переноса эмбрионов IVP и у родившихся телят.

работы в Бразилии, где OPU/IVP теперь обеспечивает получение 91% эмбрионов (данные предоставлены компанией In Vitro Brazil).

В Нидерландах эмбрионы методом IVP получают из ооцитов, извлеченных методом OPU у молодых доноров без нарушений репродуктивной функции, и переносят непосредственно в хозяйствах по всей стране.⁹⁰ В Японии производство эмбрионов методом IVF из яичников с боен поставлено на коммерческую основу; в некоторых случаях получено очень большое количество эмбрионов. Куваяма и соавт.⁹¹ описали получение более 150 000 замороженных эмбрионов IVP за 1-летний период из более чем 21 000 яичников крупного рогатого скота японской черной породы.

Стельность и потомство

Ряд авторов описал проблемы при стельности, наступившей после переноса эмбрионов крупного рогатого скота, полученных методом IVP.^{16,32,59,90,92} Одна из наиболее очевидных проблем — рождение телят крупнее нормы; это явление называют синдромом крупного потомства. Некоторые связанные с ним проблемы приведены в таблице 81.3.

Согласно ряду публикаций, средняя масса при рождении телят, полученных методом IVF, больше, чем у телят, полученных в результате искусственного осеменения (AI).^90,93,94 Кроме того, Фарин и соавт.⁹² показали, что плоды 7-месячного возраста, развившиеся из эмбрионов после IVC, были тяжелее плодов, развившихся из эмбрионов, полученных in vivo. Другие исследования показывают, что сыворотка, совместное культивирование, IVM/IVF и среда матки способны влиять на развитие плода

у овец. Эти исследования проводились преимущественно на овцах, поскольку из-за высоких затрат на содержание и более продолжительной стельности крупный рогатый скот служит более дорогой моделью для изучения влияния процедур in vitro на потомство. Тем не менее обнаружение того, что ягнята, развившиеся из эмбрионов, культивированных in vitro с добавлением сыворотки, могут быть на 20% тяжелее ягнят контрольной группы, может иметь важные последствия для скотоводства.⁹⁵ Отмечалась также более продолжительная стельность, однако ее связь с массой потомства не была установлена.^95–97

Поскольку сыворотку считают одной из причин повышенной массы при рождении ягнят, полученных in vitro (обзор см. в источнике 30), ее применению в системах IVC для крупного рогатого скота уделялось большое внимание. Исключение сыворотки в первые 4 дней совместного культивирования не снизило частоту проблем при стельности после переноса эмбрионов IVP и у полученных телят,³¹ тогда как Агджа и соавт.⁹⁸ показали, что масса при рождении и продолжительность стельности были нормальными у относительно небольшого числа телят, развившихся из эмбрионов, культивированных в среде CR1aa без сыворотки.⁹⁹ Другое исследование, в котором сравнивали стельности после переноса эмбрионов, полученных при совместном культивировании, и эмбрионов, полученных в среде SOF с добавлением BSA, показало, что применение SOF приводило к меньшей массе телят при рождении и более легким отелам.⁵⁹ К сожалению, подробные данные о поздних сроках стельности, частоте трудных родов и нормальном развитии телят отсутствуют для крупных коммерческих программ in vitro, действующих в настоящее время.

Повышенная частота абортов — от 8 до 47% — в первые два триместра стельности отмечалась при вынашивании плодов крупного рогатого скота, полученных in vitro.^22,100–102 Напротив, при стельности после переноса эмбрионов частота абортов составляла 5.3% в период от 2 до 7 месяцев,¹⁰³ 4.7% в период от 2 до 6 месяцев⁸⁶ и 4% в период от 40 до 250 дней¹⁰⁴ при переносе эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo.

Сообщалось также, что перинатальные и неонатальные потери у реципиентов, вынашивающих плоды, полученные in vitro, выше, чем после искусственного осеменения или при стельности после переноса эмбрионов, полученных in vivo.^{22,90,105,106} Частота гибели телят при рождении не различалась между телятами, полученными в системах совместного культивирования TCM-199 и B2 в компании Em Tran. Однако общая доля телят IVF, погибших при рождении, составила 14.9% (205 из 1376), что выше 9%, зарегистрированных после переноса эмбрионов, полученных in vivo.¹⁰³

У стельных реципиентов голштинской породы, вынашивавших плоды, полученные методом IVP, чаще диагностировали гидроаллантоис (1%).^22,90 Частота 1% значительно превышает приводимую для стельностей без применения IVP частоту — 1 случаев на 7500 отелов.¹⁰⁷

Наконец, хотя количественные данные не приводились, сообщалось, что у голштинских телок, служивших реципиентами эмбрионов IVP, признаки начала родов часто были слабо выражены.¹⁶ Поэтому начало родов у этих реципиентов часто оставалось незамеченным, отелы нередко проходили без помощи, что приводило к увеличению перинатальных потерь. Однако при плановом кесаревом сечении выживаемость телят приближалась к 98%.

Ряд публикаций показывает, что в первые 7–8 дней культивирования в рамках IVP эмбрионы крупного рогатого скота мужского пола развиваются быстрее эмбрионов женского пола.^108–111 Эмбрионы крупного рогатого скота, полученные методом IVP, обычно переносят на 7-й или 8-й день; при этом, как правило, отбирают наиболее развитые эмбрионы, поскольку они обычно более жизнеспособны.²²Сообщалось, что доля бычков, родившихся после пересадки эмбрионов, полученных in vitro (IVP), составляла 60%,¹⁰⁰ 62%,¹⁰²а также 53.4%.¹⁶Показатель 53.4% был рассчитан по данным о более чем 2000 телятах и плодах, полученных методом IVP, и достоверно отличался (P < 0.001) от 50% и

также от доли самцов 51.1% среди 1751 телят, полученных после пересадкиin vivo полученных эмбрионов,¹⁰³ а также от доли самцов 50.5% среди 24 000 телят голштинской породы, полученных методом искусственного осеменения.¹¹²

Заключение

Со времени 1959, когда было получено первое млекопитающее в результате оплодотворения in vitro (IVF), этот метод прошёл долгий путь и сегодня занимает всё более важное место в отрасли пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. Состав сред для культивирования продолжают совершенствовать, чтобы точнее воспроизводить условияin vivo, что позволяет получать эмбрионы более высокого качества. В сочетании с использованием спермы, разделённой по полу, в процессе IVP это повышает ценность эмбрионов, полученных методом IVP, особенно в молочном скотоводстве. Кроме того, по мере совершенствования методов криоконсервации таких эмбрионов становится возможной их транспортировка на большие расстояния и более широкое применение в скотоводстве.

Литература

1. Chang M. Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro. J Anim Sci 1968;27:15–22.

2. Whittingham D. Оплодотворение яйцеклеток мышей in vitro. Nature 1968;220:592–593.

3. Iritani A, Niwa K. Капацитация сперматозоидов быка и оплодотворение in vitro фолликулярных ооцитов крупного рогатого скота, созревших в культуре. J Reprod Fertil 1977;50:119–121.

4. Brackett B, Bousquet D, Boice M, Donawick W, Evans J, Dressel M. Нормальное развитие после оплодотворения in vitro у коров. Biol Reprod 1982;27:147–158.

5. Fukuda Y, Ichikawa M, Naito K, Toyoda Y. Рождение нормальных телят из ооцитов крупного рогатого скота, созревших и оплодотворённых in vitro и культивировавшихся вместе с клетками кумулюса до стадии бластоцисты. Biol Reprod 1990;42:114–119.

6. Bederian K, Shea B, Baker R. Оплодотворение фолликулярных ооцитов крупного рогатого скота в яйцеводах коров и свиней. Can J Anim Sci 1975; 55:251–256.

7. Lambert R, Sirard M, Bernard C и др. Оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота, созревших in vitro и полученных при лапароскопии. Theriogenology 1986;25:117–133.

8. Griffen P, Ginther O. Применение ультразвуковой визуализации в исследованиях биологии размножения. J Anim Sci 1992;70:953–972.

9. Callesen H, Greve T, Christensen F. Аспирация фолликулярных ооцитов крупного рогатого скота под контролем УЗИ. Theriogenology 1987;27:217 (аннотация).

10. Pieterse M, Kappen K, Kruip T, Taverne M. Аспирация ооцитов крупного рогатого скота при трансвагинальном ультразвуковом исследовании яичников. Theriogenology 1988;30:751–762.

11. Hasler J. Пересадка эмбрионов иin vitro оплодотворение. В кн.: Schatten H, Constantinescu GM (ред.) Сравнительная биология размножения. Эймс, штат Айова: Blackwell Publishing, 2007, с. 171–211.

12. Bols P, Van Soom A, Ysebaert M, Vandenheede J, de Kruif A. Влияние разрежения при аспирации и диаметра иглы на морфологию ооцит-кумулюсных комплексов и способность ооцитов крупного рогатого скота к развитию. Theriogenology 1996;45:1001–1014.

13. Bols P, Ysebaert M, Van Soom A, de Kruif A. Влияние формы среза кончика иглы и процедуры аспирации на морфологию и способность к развитию ооцит-кумулюсных комплексов крупного рогатого скота с плотным кумулюсом. Theriogenology 1997;47:1221–1236.

14. Gibbons J, Beal W, Krisher R, Faber E, Pearson R, Gwazdauskas F. Влияние трансвагинальной аспирации фолликулов один или два раза в неделю на выход ооцитов крупного рогатого скота и развитие эмбрионов. Theriogenology 1994;42:405–419.

15. Broadbent P, Dolman D, Watt R, Smith A, Franklin M. Влияние частоты аспирации фолликулов на выход ооцитов и последующий ответ на стимуляцию суперовуляции у крупного рогатого скота. Theriogenology 1997;47:1027–1040.