Все применяемые в настоящее время модели электроэякуляторов работают по сходному принципу, хотя различаются по способу управления и реакции быков на их применение. В одних моделях для ручного повышения напряжения используется реостат, в других напряжение повышается по заданной программе, а по меньшей мере одна модель позволяет выбрать любой из этих режимов. Поэтому выбор модели обычно определяется личными предпочтениями (рисунок 8.1).
С технической точки зрения за более чем 50 лет с момента выдачи первого патента (Marden, патент США № 2,808,834) способ подачи напряжения в электроэякуляторе мало изменился. Однако конструкция зондов постоянно совершенствовалась, в частности расположение электродов, размеры и форма ограничителя. Как правило, следует использовать зонд наибольшего диаметра, который можно без труда ввести в прямую кишку быка; более тяжёлые зонды, по-видимому, обеспечивают лучший контакт, чем лёгкие. Общий ориентир при выборе размера: для быков массой 544–907 kg используют зонд диаметром 7.5–cm, а для более крупных и взрослых быков — 9–cm.6 Более крупный зонд (9 cm), по-видимому, также лучше всего подходит для быков породы брахман (рисунок 8.2) и её помесей. Выпускаются и зонды меньшего размера (6–6.5 cm), которые часто необходимы для годовалых быков. Ограничитель зонда — это U-образный выступ на его задней стороне, который охватывает хвост, не даёт зонду смещаться из прямой кишки и поддерживает правильное положение электродов. Предпочтителен ограничитель, направленный вверх, поскольку для фиксации животного в станке часто используют заднюю перекладину. Если бык попытается лечь в станке, горизонтально расположенный ограничитель зацепится за заднюю перекладину и передний конец зонда сместится вниз. Хотя это редко приводит к серьёзному повреждению прямой кишки, такой ситуации следует избегать (рисунок 8.3).
Получить сперму быка методом электроэякуляции быстрее и легче помогают несколько приёмов, выполняемых во время физикального обследования. При пальпации внутренних половых органов быка через прямую кишку уделите ещё несколько минут массажу ампул семявыносящих протоков и надавливанию пальцами на уретральную мышцу и бульбоуретральную железу. Это способствует расслаблению полового члена; нередко у быка начинают выделяться капли предсеменной жидкости и спермы. Затем, прежде чем вводить зонд электроэякулятора, неплотно сожмите кисть в кулак и несколько раз подвигайте рукой вперёд-назад, чтобы вызвать утомление и расслабление прямой кишки быка. Это облегчает введение зонда. Описанные массаж и утомление
прямой кишки занимают всего несколько минут и, по-видимому, уменьшают реакцию быка на электростимуляцию и ускоряют получение спермы. Затем, по возможности одним плавным движением, введите зонд в прямую кишку, одновременно извлекая из неё руку.
После введения зонда в прямую кишку можно использовать либо заранее запрограммированный, либо управляемый вручную цикл стимуляции. Преимущество запрограммированного цикла в том, что оператор может заняться
другими задачами; кроме того, стимуляция подаётся с заданной циклической частотой, которая, как показывает опыт, эффективна для большинства быков. Ручное управление позволяет оператору уменьшить стимуляцию, если бык кажется чувствительным, или, наоборот, при необходимости ускорить циклы и повысить интенсивность стимуляции. Выбор модели электроэякулятора, опять же, во многом зависит от личных предпочтений. При ручном управлении первые два-три цикла стимуляции проводите медленно, внимательно наблюдая за быком. В зависимости от его реакции усиливайте стимуляцию при каждом следующем цикле: на пике воздействия сделайте паузу на счёт «тысяча один, тысяча два, тысяча три», затем снизьте интенсивность стимуляции для отдыха на один счёт и повторите цикл. Первые порции выделений не собирайте; дождитесь, когда семенная жидкость станет мутной. К этому времени половой член должен выдвинуться, и его удобно осмотреть на наличие дефектов. Его также можно захватить марлевой салфеткой: это улучшит обзор, поможет получить более чистый образец спермы и не даст половому члену втянуться обратно (рисунок 8.4).
Иногда эякуляция не происходит даже после полного цикла электростимуляции. В таком случае прекратите стимуляцию и дайте быку отдохнуть. Обычно в течение 2–3 мин отдыха сперма начинает самопроизвольно выделяться каплями из полового члена. Если после такого «отдыха» получить сперму не удалось, возобновите стимуляцию, проведя от двух до четырёх циклов с быстрым повышением интенсивности.
Как правило, сперму труднее получить у быков, которые находились с коровами и активно участвовали в случке в течение последних 24 часов. Нервные и агрессивные быки также часто вызывают затруднения. Если необходима седация, можно использовать ксилазин (20–50 mg внутривенно). Ацепромазин не следует применять, поскольку он затрудняет получение спермы и повышает вероятность её загрязнения мочой (уроспермии).
Сперму можно собирать в воронку, прикреплённую к ручке для сбора; при этом ёмкость можно поместить в тёплую водяную «баню» или иным образом теплоизолировать. Другой вариант — собирать сперму в стаканчик для кофе из пенополистирола. Такие стаканчики, по-видимому, достаточно хорошо защищают образец от умеренных температурных воздействий; поскольку они используются в сфере общественного питания, предполагается, что они чистые (стерильные?).
Макроскопическая оценка спермы
После получения сперму сначала следует оценить макроскопически. По степени её непрозрачности (или прозрачности) и цвету можно приблизительно судить о концентрации сперматозоидов. Очень концентрированные образцы выглядят как густые сливки, а сильно разбавленные — как разбавленное водой обезжиренное молоко. Желтоватый оттенок спермы может быть следствием загрязнения мочой; это можно подтвердить по запаху или с помощью тест-полоски для определения азота мочевины крови. Кроме того, при микроскопическом исследовании спермы, загрязнённой мочой, подвижность сперматозоидов быстро снижается или зачастую отсутствует с самого начала. С другой стороны, светло-жёлтый или золотистый цвет также бывает связан с очень высокой концентрацией сперматозоидов и присутствием рибофлавина,7 что часто наблюдается у многих быков джерсейской породы и некоторых быков породы ангус. Красный или коричневый цвет спермы обусловлен присутствием крови или её пигментов; источник такого загрязнения необходимо установить.
Оценка подвижности сперматозоидов
После быстрой общей оценки спермы небольшую «висячую» каплю помещают на предварительно подогретое предметное стекло и оценивают общую подвижность при малом увеличении микроскопа (40–200×). Густые, тёмные, быстро колеблющиеся завихрения свидетельствуют об отличной подвижности (то есть высокой скорости движения), высокой доле сперматозоидов с поступательным движением и высокой концентрации сперматозоидов в образце. Такой образец обычно оценивают как «очень хороший». Образец с более медленно движущимися завихрениями оценивают как «хороший». В образце с оценкой «удовлетворительно» завихрений нет, но наблюдается заметное движение отдельных сперматозоидов. В образце с оценкой «плохо» движение или колебания отсутствуют либо почти отсутствуют. Поскольку концентрация сперматозоидов влияет на оценку общей подвижности, при любых сомнениях в достоверности такой оценки, полученной при исследовании висячей капли на малом увеличении, следует оценить индивидуальную подвижность. Для этого используют микроскопию при увеличении 200–400× и, в зависимости от концентрации, накрывают покровным стеклом ранее исследованную каплю или каплю разбавленной спермы (для разбавления используют подогретый раствор цитрата натрия). Индивидуальную подвижность оценивают как «очень хорошую», если она превышает 70%, как «хорошую» — при 50–69%, как «удовлетворительную» — при 30–49% и как «плохую» — если она составляет менее 30%.8
Согласно действующим стандартам Общества териогенологии (SFT), подвижность сперматозоидов у быков должна оцениваться как минимум «удовлетворительно» по результатам оценки индивидуальной или общей подвижности.9Хотя такой порог может показаться низким, это лишь минимальное требование. Кроме того, положительная корреляция между подвижностью сперматозоидов и оплодотворяющей способностью, наблюдаемая при искусственном осеменении, по-видимому, отсутствует при естественной случке быков.10
Оценка морфологии сперматозоидов
Точная оценка морфологии сперматозоидов начинается с приготовления окрашенного препарата диагностического качества и использования светлопольного микроскопа как минимум с иммерсионным объективом 100× (увеличение 1000×) либо высококачественного фазово-контрастного микроскопа. Кроме того, необходимо тщательно исследовать не менее 100 сперматозоидов. Хотя, строго говоря, тот, кто
способен отличить нормальные сперматозоиды от аномальных, мог бы удовлетворительно выполнить эту процедуру, важно уметь определять различные часто встречающиеся аномалии сперматозоидов и понимать их значение.
Приготовление препарата
Оценка морфологии сперматозоидов зависит от качества мазка спермы. Для его приготовления берут чистое тёплое предметное стекло; следует учитывать, что даже некоторые «новые» стёкла могут быть загрязнены моющими средствами и другими веществами, мешающими окрашиванию. На протяжении многих лет для окрашивания препаратов спермы использовали тушь. Она не окрашивает сами сперматозоиды, а создаёт тёмный фон, на котором видны неокрашенные белые клетки. В настоящее время для применения в полевых условиях рекомендуют витальный краситель эозин-нигрозин благодаря простоте использования и стабильности окрашивания. Эозин проникает в мёртвые сперматозоиды и окрашивает их в розовый цвет («красный — значит мёртвый»), тогда как живые клетки остаются неокрашенными (белыми) на тёмном фоне, который создаёт нигрозин. Мазок, окрашенный по методу Diff Quik, позволяет лучше различать лейкоциты; этот метод также подходит для оценки морфологии сперматозоидов. Ещё один полезный метод — окрашивание по Фёльгену. Сначала готовят мазок и дают ему высохнуть в течение часа. Затем помещают предметное стекло в 5 N раствор HCl на 30 мин. Стекло промывают в течение 2 мин, направляя струю воды в угол ёмкости для окрашивания, в которой оно находится. Затем стекло помещают в реактив Шиффа на 30 мин. После этого его снова промывают, как описано выше, и высушивают на воздухе. Окрашивание по Фёльгену лучше всего подходит для выявления дефекта в виде ядерной вакуоли («кратера»); кроме того, поскольку в ходе процедуры удаляются жировые глобулы, этот метод отлично подходит для окрашивания мазков разбавленной спермы.
Чтобы окрасить образец спермы, сначала наносят на предметное стекло небольшую каплю красителя, затем добавляют каплю спермы и смешивают их. Если сначала нанести сперму, а затем краситель, раствор красителя может загрязниться при случайном соприкосновении кончика флакона или пипетки со спермой. После смешивания красителя со спермой смесь распределяют по стеклу с помощью второго предметного стекла так же, как при приготовлении мазка крови. Поскольку для оценки лучше всего подходит тонкий край мазка, можно при распределении смеси несколько раз останавливать и возобновлять движение, создавая несколько участков с постепенным изменением толщины. Часто имеет смысл одновременно приготовить второй препарат: сделать сразу два быстрее, чем позднее возвращаться к приготовлению ещё одного, если первый окажется непригодным для диагностики (рисунок 8.5).
После высыхания стекла мазок можно исследовать с помощью фазово-контрастной или светлопольной микроскопии при увеличении 1000× (то есть с иммерсионным объективом светлопольного микроскопа).
Классификация аномалий сперматозоидов
Для более точного количественного учёта аномалий сперматозоидов было разработано несколько систем классификации.6,11Обычно используют классификации «первичные/вторичные», «значительные/незначительные» и «компенсируемые/некомпенсируемые». Кроме того, можно отдельно подсчитывать сперматозоиды с каждым конкретным дефектом; так часто поступают, когда обследование быков на пригодность к воспроизводству (BBSE) проводят в диагностических целях. Такой подсчёт может быть трудоёмким, поскольку в настоящее время известно не менее 25 дефектов сперматозоидов.12
Система классификации аномалий сперматозоидов на первичные и вторичные, которой до сих пор пользуется SFT, относит аномалию к той или иной категории исходя из предполагаемого происхождения дефекта. Первичные аномалии возникают в семенниках или, точнее, в процессе сперматогенеза,13тогда как вторичные возникают в придатке семенника. Однако по мере развития знаний аномалии постоянно переклассифицируют; некоторые из них могут возникать на любом из этих двух этапов.6Кроме того, первичным аномалиям нередко придают большее значение, что может быть неоправданно в отношении отдельных дефектов (таблица 8.1).
Система классификации аномалий сперматозоидов на значительные и незначительные основана на их предполагаемом влиянии на оплодотворяющую способность.14Значительными называют дефекты, наличие которых в эякуляте снижает оплодотворяющую способность. Незначительные дефекты во время разработки этой классификации не считались особенно важными, но позднее было показано, что при достаточно большом количестве они также снижают оплодотворяющую способность. Примечательно, что появившиеся позднее категории первичных и вторичных аномалий, выделенные по предполагаемому происхождению дефектов, лишь незначительно отличаются от категорий значительных и незначительных аномалий, определённых Бломом.
Классификацию дефектов сперматозоидов, приводящих к снижению доли наступивших беременностей, на компенсируемые и некомпенсируемые предложили Сааккеи соавт. .15Проще говоря, компенсируемые дефекты в эякуляте или, точнее, в дозе спермы для осеменения — это дефекты, которые не снижают оплодотворяющую способность, если дополнительно присутствует достаточное количество нормальных сперматозоидов. Таким образом, влияние этих дефектов можно «компенсировать» как при естественной случке, так и при искусственном осеменении, если нормальные сперматозоиды присутствуют в достаточном количестве. К ним относятся, например, дефекты, нарушающие подвижность сперматозоидов или их способность преодолевать барьеры половых путей самки: из-за этого сперматозоиды либо не достигают яйцеклетки, либо достигают её, но не могут инициировать оплодотворение.16
Напротив, влияние некоторых аномалий нельзя компенсировать дополнительным количеством нормальных сперматозоидов, поэтому такие дефекты относят к некомпенсируемым. Сперматозоиды с этими дефектами способны достигнуть яйцеклетки и инициировать оплодотворение, но не способны обеспечить его дальнейшее развитие либо приводят к низкой жизнеспособности эмбриона.15,16Эти сперматозоиды с некомпенсируемыми дефектами
