другими задачами; кроме того, стимуляция подаётся с заданной циклической частотой, которая, как показывает опыт, эффективна для большинства быков. Ручное управление позволяет оператору уменьшить стимуляцию, если бык кажется чувствительным, или, наоборот, при необходимости ускорить циклы и повысить интенсивность стимуляции. Выбор модели электроэякулятора, опять же, во многом зависит от личных предпочтений. При ручном управлении первые два-три цикла стимуляции проводите медленно, внимательно наблюдая за быком. В зависимости от его реакции усиливайте стимуляцию при каждом следующем цикле: на пике воздействия сделайте паузу на счёт «тысяча один, тысяча два, тысяча три», затем снизьте интенсивность стимуляции для отдыха на один счёт и повторите цикл. Первые порции выделений не собирайте; дождитесь, когда семенная жидкость станет мутной. К этому времени половой член должен выдвинуться, и его удобно осмотреть на наличие дефектов. Его также можно захватить марлевой салфеткой: это улучшит обзор, поможет получить более чистый образец спермы и не даст половому члену втянуться обратно (рисунок 8.4).
Иногда эякуляция не происходит даже после полного цикла электростимуляции. В таком случае прекратите стимуляцию и дайте быку отдохнуть. Обычно в течение 2–3 мин отдыха сперма начинает самопроизвольно выделяться каплями из полового члена. Если после такого «отдыха» получить сперму не удалось, возобновите стимуляцию, проведя от двух до четырёх циклов с быстрым повышением интенсивности.
Как правило, сперму труднее получить у быков, которые находились с коровами и активно участвовали в случке в течение последних 24 часов. Нервные и агрессивные быки также часто вызывают затруднения. Если необходима седация, можно использовать ксилазин (20–50 mg внутривенно). Ацепромазин не следует применять, поскольку он затрудняет получение спермы и повышает вероятность её загрязнения мочой (уроспермии).
Сперму можно собирать в воронку, прикреплённую к ручке для сбора; при этом ёмкость можно поместить в тёплую водяную «баню» или иным образом теплоизолировать. Другой вариант — собирать сперму в стаканчик для кофе из пенополистирола. Такие стаканчики, по-видимому, достаточно хорошо защищают образец от умеренных температурных воздействий; поскольку они используются в сфере общественного питания, предполагается, что они чистые (стерильные?).
Макроскопическая оценка спермы
После получения сперму сначала следует оценить макроскопически. По степени её непрозрачности (или прозрачности) и цвету можно приблизительно судить о концентрации сперматозоидов. Очень концентрированные образцы выглядят как густые сливки, а сильно разбавленные — как разбавленное водой обезжиренное молоко. Желтоватый оттенок спермы может быть следствием загрязнения мочой; это можно подтвердить по запаху или с помощью тест-полоски для определения азота мочевины крови. Кроме того, при микроскопическом исследовании спермы, загрязнённой мочой, подвижность сперматозоидов быстро снижается или зачастую отсутствует с самого начала. С другой стороны, светло-жёлтый или золотистый цвет также бывает связан с очень высокой концентрацией сперматозоидов и присутствием рибофлавина,7 что часто наблюдается у многих быков джерсейской породы и некоторых быков породы ангус. Красный или коричневый цвет спермы обусловлен присутствием крови или её пигментов; источник такого загрязнения необходимо установить.
Оценка подвижности сперматозоидов
После быстрой общей оценки спермы небольшую «висячую» каплю помещают на предварительно подогретое предметное стекло и оценивают общую подвижность при малом увеличении микроскопа (40–200×). Густые, тёмные, быстро колеблющиеся завихрения свидетельствуют об отличной подвижности (то есть высокой скорости движения), высокой доле сперматозоидов с поступательным движением и высокой концентрации сперматозоидов в образце. Такой образец обычно оценивают как «очень хороший». Образец с более медленно движущимися завихрениями оценивают как «хороший». В образце с оценкой «удовлетворительно» завихрений нет, но наблюдается заметное движение отдельных сперматозоидов. В образце с оценкой «плохо» движение или колебания отсутствуют либо почти отсутствуют. Поскольку концентрация сперматозоидов влияет на оценку общей подвижности, при любых сомнениях в достоверности такой оценки, полученной при исследовании висячей капли на малом увеличении, следует оценить индивидуальную подвижность. Для этого используют микроскопию при увеличении 200–400× и, в зависимости от концентрации, накрывают покровным стеклом ранее исследованную каплю или каплю разбавленной спермы (для разбавления используют подогретый раствор цитрата натрия). Индивидуальную подвижность оценивают как «очень хорошую», если она превышает 70%, как «хорошую» — при 50–69%, как «удовлетворительную» — при 30–49% и как «плохую» — если она составляет менее 30%.8
Согласно действующим стандартам Общества териогенологии (SFT), подвижность сперматозоидов у быков должна оцениваться как минимум «удовлетворительно» по результатам оценки индивидуальной или общей подвижности.9Хотя такой порог может показаться низким, это лишь минимальное требование. Кроме того, положительная корреляция между подвижностью сперматозоидов и оплодотворяющей способностью, наблюдаемая при искусственном осеменении, по-видимому, отсутствует при естественной случке быков.10
Оценка морфологии сперматозоидов
Точная оценка морфологии сперматозоидов начинается с приготовления окрашенного препарата диагностического качества и использования светлопольного микроскопа как минимум с иммерсионным объективом 100× (увеличение 1000×) либо высококачественного фазово-контрастного микроскопа. Кроме того, необходимо тщательно исследовать не менее 100 сперматозоидов. Хотя, строго говоря, тот, кто
способен отличить нормальные сперматозоиды от аномальных, мог бы удовлетворительно выполнить эту процедуру, важно уметь определять различные часто встречающиеся аномалии сперматозоидов и понимать их значение.
Приготовление препарата
Оценка морфологии сперматозоидов зависит от качества мазка спермы. Для его приготовления берут чистое тёплое предметное стекло; следует учитывать, что даже некоторые «новые» стёкла могут быть загрязнены моющими средствами и другими веществами, мешающими окрашиванию. На протяжении многих лет для окрашивания препаратов спермы использовали тушь. Она не окрашивает сами сперматозоиды, а создаёт тёмный фон, на котором видны неокрашенные белые клетки. В настоящее время для применения в полевых условиях рекомендуют витальный краситель эозин-нигрозин благодаря простоте использования и стабильности окрашивания. Эозин проникает в мёртвые сперматозоиды и окрашивает их в розовый цвет («красный — значит мёртвый»), тогда как живые клетки остаются неокрашенными (белыми) на тёмном фоне, который создаёт нигрозин. Мазок, окрашенный по методу Diff Quik, позволяет лучше различать лейкоциты; этот метод также подходит для оценки морфологии сперматозоидов. Ещё один полезный метод — окрашивание по Фёльгену. Сначала готовят мазок и дают ему высохнуть в течение часа. Затем помещают предметное стекло в 5 N раствор HCl на 30 мин. Стекло промывают в течение 2 мин, направляя струю воды в угол ёмкости для окрашивания, в которой оно находится. Затем стекло помещают в реактив Шиффа на 30 мин. После этого его снова промывают, как описано выше, и высушивают на воздухе. Окрашивание по Фёльгену лучше всего подходит для выявления дефекта в виде ядерной вакуоли («кратера»); кроме того, поскольку в ходе процедуры удаляются жировые глобулы, этот метод отлично подходит для окрашивания мазков разбавленной спермы.
Чтобы окрасить образец спермы, сначала наносят на предметное стекло небольшую каплю красителя, затем добавляют каплю спермы и смешивают их. Если сначала нанести сперму, а затем краситель, раствор красителя может загрязниться при случайном соприкосновении кончика флакона или пипетки со спермой. После смешивания красителя со спермой смесь распределяют по стеклу с помощью второго предметного стекла так же, как при приготовлении мазка крови. Поскольку для оценки лучше всего подходит тонкий край мазка, можно при распределении смеси несколько раз останавливать и возобновлять движение, создавая несколько участков с постепенным изменением толщины. Часто имеет смысл одновременно приготовить второй препарат: сделать сразу два быстрее, чем позднее возвращаться к приготовлению ещё одного, если первый окажется непригодным для диагностики (рисунок 8.5).
После высыхания стекла мазок можно исследовать с помощью фазово-контрастной или светлопольной микроскопии при увеличении 1000× (то есть с иммерсионным объективом светлопольного микроскопа).
Классификация аномалий сперматозоидов
Для более точного количественного учёта аномалий сперматозоидов было разработано несколько систем классификации.6,11Обычно используют классификации «первичные/вторичные», «значительные/незначительные» и «компенсируемые/некомпенсируемые». Кроме того, можно отдельно подсчитывать сперматозоиды с каждым конкретным дефектом; так часто поступают, когда обследование быков на пригодность к воспроизводству (BBSE) проводят в диагностических целях. Такой подсчёт может быть трудоёмким, поскольку в настоящее время известно не менее 25 дефектов сперматозоидов.12
Система классификации аномалий сперматозоидов на первичные и вторичные, которой до сих пор пользуется SFT, относит аномалию к той или иной категории исходя из предполагаемого происхождения дефекта. Первичные аномалии возникают в семенниках или, точнее, в процессе сперматогенеза,13тогда как вторичные возникают в придатке семенника. Однако по мере развития знаний аномалии постоянно переклассифицируют; некоторые из них могут возникать на любом из этих двух этапов.6Кроме того, первичным аномалиям нередко придают большее значение, что может быть неоправданно в отношении отдельных дефектов (таблица 8.1).
Система классификации аномалий сперматозоидов на значительные и незначительные основана на их предполагаемом влиянии на оплодотворяющую способность.14Значительными называют дефекты, наличие которых в эякуляте снижает оплодотворяющую способность. Незначительные дефекты во время разработки этой классификации не считались особенно важными, но позднее было показано, что при достаточно большом количестве они также снижают оплодотворяющую способность. Примечательно, что появившиеся позднее категории первичных и вторичных аномалий, выделенные по предполагаемому происхождению дефектов, лишь незначительно отличаются от категорий значительных и незначительных аномалий, определённых Бломом.
Классификацию дефектов сперматозоидов, приводящих к снижению доли наступивших беременностей, на компенсируемые и некомпенсируемые предложили Сааккеи соавт. .15Проще говоря, компенсируемые дефекты в эякуляте или, точнее, в дозе спермы для осеменения — это дефекты, которые не снижают оплодотворяющую способность, если дополнительно присутствует достаточное количество нормальных сперматозоидов. Таким образом, влияние этих дефектов можно «компенсировать» как при естественной случке, так и при искусственном осеменении, если нормальные сперматозоиды присутствуют в достаточном количестве. К ним относятся, например, дефекты, нарушающие подвижность сперматозоидов или их способность преодолевать барьеры половых путей самки: из-за этого сперматозоиды либо не достигают яйцеклетки, либо достигают её, но не могут инициировать оплодотворение.16
Напротив, влияние некоторых аномалий нельзя компенсировать дополнительным количеством нормальных сперматозоидов, поэтому такие дефекты относят к некомпенсируемым. Сперматозоиды с этими дефектами способны достигнуть яйцеклетки и инициировать оплодотворение, но не способны обеспечить его дальнейшее развитие либо приводят к низкой жизнеспособности эмбриона.15,16Эти сперматозоиды с некомпенсируемыми дефектами
Таблица 8.1Аномалии сперматозоидов по классификации Общества териогенологии.
| Первичные аномалии | |
|---|---|
| Недоразвитые формы | |
| Удвоенные формы | |
| Дефект акросомы (узелковая акросома) | |
| Узкая головка | |
| Дефект типа «кратер»/«диадема» | B D |
| Грушевидная головка | |
| Неправильный контур | |
| Малая аномальная головка | C |
| Отделившаяся аномальная головка | |
| Проксимальная капля | A |
| Резко изогнутый или закрученный хвост (дефект Дага) | |
| Добавочный хвост | |
| Вторичные аномалии | |
| Малые нормальные головки | |
| Гигантские и короткие широкие головки | |
| Отделившиеся нормальные головки | Рисунок 8.6 (a) Нормальный сперматозоид; (b) дистальная капля |
| Отделившиеся, складчатые, неплотно прилегающие мембраны акросомы | дефект; (d) дефект Дага. |
| Эксцентрическое прикрепление хвоста | |
| Дистальная капля Простой изгиб хвоста Закрученный конец хвоста | Обратите внимание на часто встречающиеся или преобладающие сперматозоиды наличие определённых дефектов делает «нормально выглядящие», но дефектные сперматозоиды Быки с более чем 70% нормальных, но с |
конкурируют с нормальными сперматозоидами и часто лишают их возможности оплодотворить яйцеклетку. Таким образом, некомпенсируемый дефект теоретически снижает оплодотворяющую способность пропорционально доле сперматозоидов с этим дефектом в эякуляте или дозе спермы для осеменения.
Отнесение дефектов сперматозоидов к компенсируемым или некомпенсируемым осложняется тем, что, как и в случае других классификаций, новые научные данные, вероятно, приведут к пересмотру категорий некоторых дефектов; дополнительную сложность представляет мужское бесплодие в целом. Тем не менее такой подход к оценке аномалий чрезвычайно полезен: он помогает ветеринарному врачу определить прогностическое значение дефекта, часто встречающегося в эякуляте.
Оценку морфологии сперматозоидов дополнительно осложняет тот факт, что в одном эякуляте могут присутствовать морфологически нормальные сперматозоиды с повреждённым хроматином. Такие сперматозоиды относятся к категории некомпенсируемых дефектов: они способны оплодотворить яйцеклетку, но образующийся эмбрион часто бывает низкого качества. Однако о вероятном наличии сперматозоидов с повреждённым хроматином, но нормальным внешним видом можно судить по преобладанию в эякуляте морфологически аномальных клеток. Это подтверждено исследованиями с теплоизоляцией мошонки, которые показали, что возникающие дефекты зависят от стадии сперматогенеза в момент повреждающего воздействия17и что количество и виды наблюдаемых дефектов указывают на наличие ещё большего числа дефектных, но внешне нормальных сперматозоидов.15
Поэтому оптимальный подход состоит в понимании того, что аномальные сперматозоиды в эякуляте указывают либо на состояние семенников, влияющее на сперматогенез, либо на генетическую причину. Следует тщательно исследовать не менее 100 сперматозоидов при увеличении 1000× и признавать пригодными только тех быков, у которых доля нормальных сперматозоидов составляет не менее 70%.
другие некомпенсируемые дефекты следует тщательно изучать. Поэтому при оценке быка с пограничными показателями спермограммы разумно учитывать виды дефектов и их распространённость и, возможно, проявлять повышенную осторожность.
Нормальные сперматозоиды
Поскольку у ветеринарных врачей, проводящих базовое обследование племенного быка (BBSE), могут возникать разногласия при отнесении аномальных сперматозоидов к определённым категориям, способность точно установить процент нормальных сперматозоидов может быть важнейшим аспектом оценки спермограммы. Некоторые ветеринарные андрологи даже предлагали отказаться или допускали возможность отказа от классификации аномальных сперматозоидов в рамках стандартного BBSE (6).
Большинство наших клиентов и практически все студенты-ветеринары, рассматривая под увеличением окрашенную популяцию сперматозоидов, способны интуитивно распознать нормальный сперматозоид. Однако новичок или наблюдатель без специальной подготовки легко пропустит малозаметные аномалии и даже те, которые мы, ветеринарные врачи, не сочли бы столь уж малозаметными, например дефект в виде ядерной вакуоли. Поэтому необходимо подробно описать нормальный сперматозоид.
Для целей описания, а также для более точного определения локализации дефектов нормальный сперматозоид (рисунок 8.6) можно разделить на головку и хвост. Головка длиной 8–10 мкм, шириной 4–4.5 мкм и толщиной 1–1.5 мкм7 состоит из ядерного материала и акросомы. Хвост длиной приблизительно 40–45 мкм, в свою очередь, можно разделить на шейку, среднюю, главную и концевую части.
Как отмечалось ранее, при окрашивании витальным красителем, например эозином-нигрозином, мёртвые клетки поглощают краситель и выглядят розовыми, причём акросома окрашивается значительно слабее,
