Воспроизводство крупного рогатого скота

(a)
Доминантный
12 “Отклонение” 1.3
10 1.2
8
6 1.0
4 0.9
2 0.8
0.7
–2.5 –2 –1.5 –1 –0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Дни от появления доминантного фолликула в 4 мм
(b)
Корреляция с ФСГ
Доминантный, r = 0.71
P = 0.01 Доминантный, r = –0.90
12 Субдоминантный 1, r = 0.73 Субдоминантный 1, r = –0.68 P < 0.01 1.5
Субдоминантный 2, r = 0.76 b Субдоминантный 2, r = –0.78
1.3
9
a 1.1
6 a
0.9
3
0.7
0 0.5
–54 –42 –30 –18 –6 0 6 18 30 42 54 66 78 90
Часы от пика ФСГ
()ФСГнг/мл
()Диаметр фолликула мм
()фСГнг/мл
()Диаметр фолликуламм

Рис. 24.11 Рост (среднее ± SEM - стандартная ошибка среднего ) доминантных и подчиненных фолликулов у крупного рогатого скота (n = 9) относительно (а) появления волн (определяется как день, когда доминантный фолликул был обнаружен при диаметре 1 или 4 мм; двойная ось х) и (b) пика концентрации ФСГ в плазме (среднее значение ± SEM). (a) Будущий доминантный фолликул имел преимущество в размере по сравнению со всеми остальными фолликулами волны с момента его самого раннего обнаружения при d=1 мм (что намного раньше, чем было прежде задокументировано). Последующее ( или последовательное?) замедление скорости роста третьего, второго и первого по величине фолликулов волны во время спада всплеска ФСГ говорит о том, что механизм отбора включает последовательное подавление постепенно увеличивающихся фолликулов в течение 72 часового периода (то есть иерархия выбора). «Отклонение» определяется как первый день, в который скорость роста самого большого и второго по величине фолликулов различалась (P ≤ 0,05). (b) Концентрации ФСГ в плазме положительно коррелировали (P = 0,01) с диаметром фолликула от момента обнаружения фолликула при d=1 мм до момента, когда концентрации ФСГ достигали максимума. Временные повышения концентрации ФСГ в плазме сопровождались увеличением скорости роста фолликулов 1–3 мм в течение 6 часов. Для ФСГ значения без общего верхнего индекса (надписи a, b) различны (P ≤ 0,05). Адаптировано из Jaiswal R, Singh J, Adams G. "Характер развития малых антральных фолликулов в яичнике коровы". Biol Reprod 2004;71:1244–1251.

• 1–3 мм фолликулы развиваются волнообразно в связи со скачками концентрации ФСГ в плазме;

• 1–3 мм фолликулы прекрасно реагируют на кратковременные подъемы ФСГ (т.е. в течение 6 часов);

• отбор доминантного фолликула проявляется намного раньше, чем было прежде задокументировано;

• доминирование фолликулов характеризуется иерархической последовательностью в течение периода, охватывающего весь всплеск ФСГ (5 дней) (рис. 24.11);

• дивергенция ( расхождение ) в темпах роста (называемая «отклонением»)⁸⁰ доминантных и самых больших подчиненных фолликулов становится очевидна, когда самый большой фолликул достигает диаметра 8–9 мм.

Хотя динамика развития фолликулов размером 1 мм и более в настоящее время хорошо охарактеризована, динамика более мелких фолликулов остается загадкой. Раннее исследование продемонстрировало связывание ФСГ с гранулезой фолликулов только с одним слоем клеток гранулезы⁹⁷ , но было доказано, что они могут не связываться с системой вторичного мессенджера аденилатциклазы на ранних стадиях фолликулогенеза и могут оставаться нефункциональными.⁹⁸ Однако, стимулирующее воздействие ФСГ на рост преантральных и мелких антральных фолликулов у крупного рогатого скота, воспроизведенное in vitro⁹⁹ и in vivo^{100, 101} , указывает на роль ФСГ в развитии ранних стадий преантральных и антральных фолликулов.

(a) (e)
CC
Z P
2 мм M v
(b) G
200 мкм
G V
(c)
V
20 мкм L
(d) M
GV
КК
10 мкм 2 µm

Рис. 24.12 Изображения кумулюс-ооцитарного комплекса коровы. (а) Ультразвуковая биомикроскопия с использованием датчика с частотой 40 МГц. (б) Гистологический срез (сечение 5 мкм), окрашенный трихромом по Массону. (c) Фазово-контрастная микроскопия оголенного ооцита (40 ×). (г) Полутонкий срез (сечение 1 мкм) кумулюс-ооцитного комплекса из доминантного фолликула в фазе роста, окрашенного толуидиновым синим ( краситель Ниссля ). (е) Просвечивающая электронная микроскопия (d). СС - кумулюсные клетки ( клетки лучистого венца) ; ZP — блестящая оболочка (zona pellucida) (г ликопротеиновая оболочка, окружающая ооцит ) ; V - везикулы ооцитов; L - липидные капли; М - закрытые и нормальные митохондрии; стрелками указаны проекции кумулюсных клеток; Mv - микроворсинки на поверхности ооплазмы ( цитоплазма яйцеклетки) ; G - Гольджи; GV - Зародышевый пузырек.

Эти наблюдения ставят под сомнение старую догму о том, что ранний рост фолликулов не зависит от гонадотропина. Если маленькие фолликулы реагируют на ФСГ, логично предположить, что динамика их развития имеет волнообразный характер в ответ на периодические эндогенные выбросы ФСГ. До недавнего времени отсылка к фолликулярной волне была ограничена фолликулами диаметром 4 мм или более, просто исходя из предела разрешения существующего ультразвукового оборудования.

На микроскопическом уровне нет морфологического различия между антральными фолликулами средней и поздней стадии менее 4 мм и 4 мм и более.^7,8 На клеточном уровне обе размерные категории фолликулов не только экспрессируют ( приобретают ) рецепторы ФСГ, но и имеют сходный уровень экспрессии на гранулезно-клеточной основе (обзор в 78).

Периодическое появление волн фолликулов размером 4 мм и более в ответ на периодические скачки ФСГ⁵¹ и постоянство количества фолликулов 2 мм или более¹⁰² , либо 3 мм или более⁵⁹ , набранных в последовательные волны, указывает на то, что фолликулы могут постепенно примыкать к волнам, начиная с самых ранних стадий развития.

Овуляция и созревание яйцеклетки

Овуляция включает в себя ряд событий, которые завершаются эвакуацией содержимого антрального фолликула, включая его зрелый кумулюс-ооцитный комплекс (рис. 24.12), и инициацией развития желтого тела. Ряд событий происходит последовательно и они тесно координируются на системном, клеточном и молекулярном уровнях. Процесс начинается с эндокринных изменений, вызванных лютеолизом. Снижение циркулирующих концентраций прогестерона во время лютеолиза устраняет негативные эффекты обратной связи на гипофиз и гипоталамус, что приводит к увеличению частоты и амплитуды импульса ЛГ. Наличие ЛГ приводит к окончательному созреванию доминантного фолликула с увеличением выработки эстрадиола и активацией рецепторов ЛГ на клетках гранулезы. Преовуляторное увеличение ЛГ приводит к обширному ремоделированию матрикса яичника (сосудистые изменения, распад базальной мембраны и разрыв стенки фолликула), реакциям гранулезы и тека-клеток (экспансия кумулюсных клеток, лютеинизация) и возобновлению мейоза яйцеклеткой. При эструсе высокая циркулирующая концентрация эстрадиола в отсутствие прогестерона вызывает резкий скачок ЛГ и эстральное поведение (повышенная локомоция, мычание, вспрыгивание на других коров и рефлекс неподвижности при садках) .

Хотя ЛГ-рецепторы присутствуют как на гранулезных, так и на тека-клетках,¹⁰³ но в клетках гранулезы их распределение ограничено клеточными стенками. Кроме того, рецепторы ЛГ наиболее выражены в тех слоях, которые расположены ближе к базальной мембране, чем к полости. Следовательно, ЛГ нуждается во вторичных мессенджерах, чтобы иметь возможность воздействовать на весь фолликул и ооцит. Действие вторичных мессенджеров облегчается тесной взаимосвязью между клетками гранулезы, кумулюсными клетками и ооцитом через щелевые контакты ( межклеточные контакты, обеспечивающие прямой перенос ионов и небольших молекул между соседними клетками) ( см. Рис. 24.4).¹⁰⁵ Двумя основными вторичными мессенджерами для ЛГ являются циклический АМФ ( аденозинмонофосфат )^106,107 и внутриклеточный кальций.¹⁰⁸ Связывание ЛГ с рецепторами G-белка на поверхности клетки г ранулезы приводит к активации аденилциклазы ( фермент, который ускоряет превращение АТФ в цАМФ ), увеличению циклического АМФ и стимуляции протеинкиназы А и С. Стимуляция протеинкиназы А и С вызывает фосфорилирование и активацию транскрипционных факторов (Egr-1, C/EBPβ, CREB, Fos, Jun, Fra2, JunD) в течение 4 часов после выброса ЛГ. Экспрессия некоторых из этих генов является временной, в то время как другие сохраняются до овуляции (обзор в 109). C/EBPβ контролирует экспрессию COX2 - ключевого гена на пути синтеза простагландина. Продукты гранулезных клеток под влиянием эпидермального фактора роста (ЭФР) (эпирегулин, амфирегулин и бетацеллюлин) повышаются через 1-3 часа после выброса ЛГ и участвуют в передаче овуляторного сигнала клеткам кумулюса. Всплеск ЛГ также косвенно индуцирует активацию путей синтеза прогестерона и простагландина¹¹¹ , которые модифицируют функцию фибробластов к образованию хемокинов, которые рекрутируют (привлекают) , воспалительные клетки и факторы роста, инициирующие ангиогенез (например, VEGF - фактор роста эндотелия сосудов).

Индуцированная ЛГ внеклеточная протеаза ADAMTS1 синтезируется в клетках гранулезы, но белок транслоцируется ( перемещается) во внеклеточный матрикс для индукции выработки версикана (хондроитинсульфат протеогликана 2 или внеклеточный матричный протеогликан из семейства аггреканов; рассмотрено в ссылке 112), и участвует в активации тканевых протеаз, таких, как металлопротеиназы, необходимых для разрыва фолликула.

Внеклеточный матрикс, который окружает и поддерживает клетки, является основным компонентом соединительной ткани (см. Рисунок 24.4). Он состоит в основном из структурных белков (эластин и коллагены), специализированных белков (фибриллин, фибронектин, ламинин) и протеогликанов. Он играет важную роль в функции яичников, участвуя в таких процессах, как миграция клеток, пролиферация, рост и гибель клеток во время развития фолликула, овуляции и образования желтого тела. Во время овуляции деградацию эпителия яичников регулируют два семейства ферментов: металлопротеиназы и активаторы плазминогена ( белки, превращающие профермент плазминоген в активную форму — плазмин, являющийся фибринолитическим ферментом ) . Экспрессия обоих этих семейств ферментов индуцируется выбросом ЛГ. Об изменениях в экспрессии генов и ингибиторов металлопротеиназ в течение эстрального цикла коров не сообщалось, но одним фактором, который может индуцировать экспрессию, является фактор некроза опухоли TNF-α, который секретируется преовуляторными фолликулами.¹¹³ Гепараназа (кодируется HPSE) расщепляет гликозаминогликаны гепарансульфат во время ремоделирования (перестройки ) матрикса и может также играть основную роль в разрыве фолликула во время овуляции у крупного рогатого скота.¹¹⁴ ЛГ-индуцированная овуляция также связана с увеличением экспрессии еще одной группы протеаз, называемых калликреинами.¹¹⁵ Похоже, что многие паракринные факторы, провоспалительные цитокины и семейства протеазных ферментов действуют совместно друг с другом, приводя к деградации внеклеточной соединительной ткани и, в конечном счете, к разрыву фолликула в среднем через 30 часов после всплеска ЛГ.¹¹⁶

Мейотическое деление яйцеклетки задерживается в профазе I (первый мейотический арест или остановка) во время развития зародышевых фолликулов у плода. Процесс возобновления мейоза, разъединение половины набора хромосом в виде полярного тела и перехода к метафазе II называют ядерным созреванием (рис. 24.13). Вскоре после всплеска ЛГ щелевые контакты между клетками кумулюса и ооцитом разрушаются.^117,118 Потеря связи между клетками устраняет ингибирующую передачу сигналов, и затем ооцит может возобновить мейоз. Тем не менее, мейоз снова останавливается в метафазе II (второй мейотический арест) до оплодотворения, когда мейоз, наконец, завершен. Ооциты млекопитающих имеют склонность к возобновлению мейоза, если они удалены из антрального фолликула, в котором они находятся,^119–121 или, если они находятся в преовуляторных фолликулах под влиянием выброса ЛГ^117,122 . У крупного рогатого скота основная доля ооцитов достигала метафазы II через 20 часов созревания in vitro¹¹⁷ или 20 часов после спонтанного или индуцированного всплеска ЛГ.^122–124 Циклические АМФ и ГМФ считаются основными ингибиторами возобновления мейоза в ооците.¹¹⁸ Считается, что циклический ГМФ ( гуанозинмонофосфат) , продуцируемый клетками гранулезы, входит в ооцит через щелевые контакты между клетками ооцита и кумулюса для поддержания низких уровней цАМФфосфодиэстеразы 3А (ФДЭ3A) в ооците.¹²⁵ Низкий уровень ФДЭ3A, как полагают, поддерживает высокий уровень цАМФ, вырабатываемый в ооците¹²⁶ , и, таким образом, поддерживает мейотическую остановку ( арест ). Воздействие ЛГ снижает выработку цГМФ клетками гранулезы с помощью пока неизвестных механизмов и разъединяет щелевые соединения (путем фосфорилирования коннексина-43) с помощью митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК).^125,127,128