Воспроизводство крупного рогатого скота

Вместо этого были разработаны тесты для определения наличия определенных, связанных с беременностью молекул, таких как повышенная концентрация прогестерона, связанные с беременностью гликопротеины (PAG), фактор ранней беременности (EPF) и гены, стимулируемые интерфероном (ISG).² Кроме того, по мере развития технологий и научных знаний о ранних сроках беременности, будет обнаружен ряд других молекул, которые могут однажды использоваться в качестве биомаркеров стельности у крупного рогатого скота.

Важное отличие, которое производители должны учитывать при выборе биохимических методов для определения статуса стельности, заключается в том, что анализы на прогестерон, PAG, EPF и ISG более точны при обнаружении небеременных самок, чем беременных. Следовательно, эндокринные тесты на беременность часто имеют отличную специфичность (> 90%), но чуть менее желательную чувствительность. Это имеет большое экономическое значение, поскольку самкам в режиме интенсивного производства, которых ошибочно идентифицируют как холостых, часто вводят простагландины в попытке начать новый цикл и сократить время до следующего осеменения. Эта инъекция простагландина, конечно, вызовет аборт у стельных коров, и, поскольку средняя стоимость потери стельности у молочной коровы в Соединенных Штатах оценивается в 555 долларов, существует серьезный стимул для минимизации случаев ятрогенной потери эмбриона и плода.⁷

Аналогичным образом, еще одним препятствующим фактором при попытке идентифицировать беременность вскоре после оплодотворения является естественная потеря беременности. Процент оплодотворяемости у крупного рогатого скота, как правило, высокий (> 90%), и поэтому основной причиной репродуктивных потерь является эмбриональная или внутриутробная смерть.^8,9 Ранняя эмбриональная смерть, наступившая до 17-го дня беременности, составляет 20,5–43,6% потерь в сочетании с количеством неудач при оплодотворении.¹⁰ Однако, поздняя эмбриональная смерть, которая представляет собой потерю плода приблизительно от 17 до 42 дней стельности, по оценкам, в среднем составляет 12,8% у молочных коров и примерно 6,5% у мясных.¹³ Было подсчитано, что потери стельности от оплодотворения до предотельного срока у высокопродуктивных молочных коров могут приближаться к 60%.¹³ Для проверки надежности эндокринных тестов, проводимых на ранних сроках беременности, обычно диагноз стельности подтверждают с помощью трансректальной пальпации или ультразвукового исследования через несколько дней или недель после первоначального теста. Это создает окно, в течение которого может произойти потеря эмбриона или плода, что приводит к искажению данных из-за неправильной маркировки некоторых результатов как ложно положительных, поскольку корова действительно была стельной при первом тестировании, но потеряла стельность до подтверждающего обследования.

Концентрация прогестерона

Уровни прогестерона в сыворотке и молоке неуклонно повышаются после овуляции по мере роста и развития функционального желтого тела (ЖТ). У небеременных самок прогестерон снижается, поскольку ЖТ регрессирует и корова возвращается к течке. Однако у беременных самок уровень прогестерона должен оставаться повышенным в течение периода следующего ожидаемого эструса, поскольку ЖТ продолжает вырабатывать прогестерон для поддержания беременности.

Тест на концентрацию прогестерона работает при условии, что концентрация прогестерона в сыворотке и/или молоке останется повышенной во время следующего ожидаемого эструса, если корова стельная. Если корова холостая, концентрация прогестерона снизится до исходного уровня по мере регрессии ЖТ и развития нового доминантного фолликула³ (см. Главы 23 и 24).

Расхождения в прогестероновых тестах могут быть в значительной степени вызваны естественными различиями между особями в плане продолжительности лютеиновой фазы и эстрального цикла, так как уровни прогестерона остаются высоким, пока ЖТ присутствует во время диэструса.¹⁴ Кроме того, эмбриональная смертность в период между тестированием и подтверждением стельности путем трансректальной пальпации или трансректального ультразвукового исследования может дополнительно способствовать восприятию ошибочности теста.

Потенциальным недостатком при использовании прогестеронового теста в производственных условиях является то, что дата случки или осеменения должна быть известна по порядку, чтобы получить надежные результаты для отдельного образца, и, следовательно, применимость тестирования на прогестерон несколько ограничена.^2,3 Как правило, образец молока или сыворотки берется через 21–24 дня после осеменения и анализируется с помощью радиоиммуноанализа (RIA), ELISA или, реже, методом латексной агглютинации (LA). Ряд тестов ELISA на прогестерон для сыворотки и молока доступен для производителей и продается как тесты для коров.

Тест на прогестерон очень надежен при выявлении небеременных самок, так как коровы с уровнем прогестерона в крови менее 1 нг/мл через 21 день после осеменения не могут быть стельными, но он несколько менее надежен при постановке положительного диагноза беременности из-за естественных различий в продолжительности эстрального цикла между отдельными животными.² Было зарегистрировано выявление 95–100% нестельных животных при диагностике отсутствия стельности. Беременность была правильно определена в 68–97% случаев, при этом схемы исследования варьировались в зависимости от срока беременности, когда проводился тест, стандарта, с которым сравнивались результаты, а также от типа используемого анализа (ELISA, RIA или LA).^15–20

Специфический протеин В беременности

Трофобласты жвачных животных высвобождают белки как индикаторы материнского признания жизнеспособного концепта. Эти белки, известные как PAG, являются аспарагиновыми пептидазами, и нет данных, что они являются протеолитически активными. Первым PAG, который был обнаружен, был специфический для беременности белок B (PSPB), ранее известный как связанный с беременностью гликопротеин 1. Этот белок продуцируется двуядерными клетками трофобласта в бычьей плаценте во время имплантации, хотя его точная роль в поддержании беременности еще не полностью понятна. Он может быть обнаружен в материнском кровообращении во время беременности с момента имплантации, часто сохраняясь в послеродовом периоде [21, 22].

Как следует из его названия, PSPB является специфичной для беременности молекулой и не обнаруживается в сыворотке неосемененных телок или холостых коров, что свидетельствует о том, что белок вырабатывается исключительно в ответ на функции концепта, а не в ответ на лютеиновую активность во время эстрального цикла.²³ В отличие от хорионического гонадотропина лошади (ХГЛ) и ХГЧ, PSPB не выявляется в моче, и он обнаруживается только в молоке в течение интервалов, когда PSPB находится в очень высокой концентрации в плазме, например, вскоре после родов.

RIA (радиоиммунный анализ), способный надежно выявлять PSPB в материнской сыворотке уже через 24 дня после зачатия, был разработан Sasser et al. в 1986 году.

Тогда уникальным преимуществом тестирования PSPB было то, что, в отличие от тестов на прогестерон, не нужны даты осеменения для подтверждения стельности, так как белок специфичен для беременности и присутствует только во время беременности, достигая пика во время родов.

Кроме теста RIA для выявления PSPB существует также коммерчески доступный ELISA (BioPRYN™; Biotracking, Москва, ID, США). Этот анализ продается как в Соединенных Штатах, так и за рубежом как удобный и недорогой тест на беременность для использования как производителями, так и ветеринарами, и, кроме того, он позиционируется как имеющий точность, аналогичную трансректальному ультразвуковому исследованию. Он может быть использован уже через 30 дней после осеменения у коров и через 28 дней после осеменения у телок и требует идентичных концентраций для определения беременности или небеременности как и RIA.^24,25 При одновременной проверке с трансректальным УЗИ ближе к концу эмбрионального периода, PSPB ELISA дал точность более 93%.^26,27

На полезность PSPB в диагностике беременности отрицательно влияет относительно длительный период полураспада PSPB. PSPB может быть обнаружен в материнской крови до 80–100 дней после отела; поэтому производители должны соблюдать осторожность при использовании анализов PSPB для выявления беременности у коров, осемененных в начале послеродового периода.^23,28 Кроме того, этот длительный период полувыведения может привести к ложноположительным результатам теста на беременность после аборта. Наконец, этот тест не имеет преимущества в диагностике отсутствия стельности до первого после осеменения эструса коровы

Ранний фактор беременности

EPF - это иммуносупрессивный гормон, который вначале можно обнаружить на детектируемых уровнях в материнской системе через 24– 48 часов после успешного оплодотворения, и он сохраняется в течение, по крайней мере, первой половины гестации.²⁹ EPF действует как иммуномодулятор, защищая антигенно чужеродный концепт от отторжения организмом матери.³⁰ Он вырабатывается материнскими тканями на предимплантационной стадии в ответ на присутствие концепта. Однако после имплантации эмбриональная ткань берет на себя ответственность за выработку EPF. Только жизнеспособный концепт, достигший стадии бластоцисты, способен производить EPF. Кроме того, EPF быстро рассеивается после смерти или удаления концепта. В отличие от некоторых PAG ( связанных с беременностью гормонов ), включая PSPB, EPF никогда не обнаруживался после родов.²⁹ Сочетание этих признаков делает EPF потенциально очень полезным для определения беременности и распознавания эмбриональной смерти плода.

До открытия EPF и разработки теста для определения его присутствия было невозможно обнаружить беременность до имплантации, за исключением случаев инвазивной хирургии. Хотя диагностика беременности так скоро после осеменения кажется привлекательной, высокий уровень ранней эмбриональной смертности делает этот тест менее полезным. Производители, решившие использовать EPF для диагностики беременности на ранних сроках, должны повторно протестировать всех положительных коров на более позднем сроке, чтобы подтвердить наличие жизнеспособного концепта.

Ориентированный на производителя анализ EPF был бы очень ценным инструментом для выявления оплодотворения и беременности у коров в течение первых 4 недель стельности, поскольку уникальные свойства EPF делают его особенно полезным в рамках интенсивного производства. Он обнаруживается спустя 48 часов после оплодотворения, в отличие от PSPB, быстро исчезает при потере эмбриона или плода и, следовательно, может быть точно определен даже у коров, осемененных в начале послеродового периода, у которых может быть остаточный PSPB в крови.

Кроме того, при анализе на EPF будет гораздо менее вероятно получить ложноположительный результат из-за преждевременной потери беременности, чем при анализе на PSPB.³¹ Самое главное, тест EPF может точно определить наличие стельности у коровы задолго до ее следующего ожидаемого эструса.²⁹

Первым и в настоящее время единственным надежным тестом на EPF является тест ингибирования розетки (RIT), в котором EPF в присутствии комплемента ( система сывороточных белков, постоянно присутствующих в крови в неактивном состоянии, активируется при попадании в организм антигенов) работает так, чтобы вызвать увеличение эффектов и титров антилимфоцитарной сыворотки при уменьшении образования розеток ( «розетки» образуются при фиксации эритроцитов на поверхности различных клеток) между лимфоцитами и гетерологичными эритроцитами.²⁹ RIT для EPF очень точен и чрезвычайно полезен для выявления небеременных самок. К сожалению, тест RIT отнимает много времени и сложен в применении, и потому не практичен для регулярного использования в большинстве коммерческих хозяйств.

Недавно был разработан ориентированный на производителя тест для выявления присутствия EPF (EDP Biotech Company, Knoxville, TN, USA). Этот тест, анализ латерального потока фактора раннего зачатия (ECF), продается в качестве теста для крс на отсутствие беременности и, как сообщается, может обнаружить EPF в молоке или сыворотке в период от 48 часов до 20 дней после оплодотворения.³² Были высказаны опасения относительно точности теста ECF, проведенного на ранних сроках беременности. Ambrose et al.³³ сообщили, что специфичность ECF на 7, 14 и 21 сутки после осеменения варьировала от 38 до 51%. Данные других исследований подтверждают эти выводы и делают вывод о том, что анализ латерального потока ECF не может правильно идентифицировать холостых коров со степенью точности, необходимой для большинства коммерческих молочных ферм.^34–3 . Однако, разработка более надежного анализа для EPF может произвести революцию в диагностике ранней стадии стельности, особенно в молочной промышленности.

Интерферон-стимулированные гены

У крупного рогатого скота молекула, в первую очередь ответственная за материнское распознавание беременности, - интерферон (ИФН)-тау. Он секретируется клетками трофэктодермы концепта и действует паракринно на эндометрий матки, ингибируя пульсирующую секрецию простагландина (PG)F2α, тем самым эффективно подавляя лютеолиз и успешно поддерживая беременность.³⁷ В отличие от молекул распознавания материнской беременности у некоторых других видов млекопитающих (т. е. ХГЧ у людей и ХГЛ у кобыл), ИФН-тау присутствует только в очень низких концентрациях на материнской периферии и поэтому в настоящее время не может быть напрямую выявлен в сыворотке или молоке. Таким образом, концентрация ИФН-тау в материнской крови не может быть использована для диагностики ранней беременности у крупного рогатого скота.³⁸

В дополнение к своей роли в прерывании пути передачи сигнала, который регулирует высвобождение PGF2α, ИФН-тау также индуцирует активацию множественных дифференциально экспрессируемых ISG на лейкоцитах матери. В число этих ISG входят ген 1 и 2 устойчивости к миксовирусу (Mx1 и Mx2) и интерферонстимулированный ген белка 15kDa (ISG15), гомолога убиквитина.^38–41 Экспрессия мРНК ISG15 на материнских лейкоцитах происходит по схеме, сходной с высвобождением ИФН-тау. Сначала она экспрессируется на 14-й день после зачатия, достигает пика между 17 и 18 днями и снижается с 21 по 26 дни.⁴² Однако, в отличие от ИФН-тау, ISG15 обнаруживается на периферии матери на ранних сроках беременности и потенциально может быть полезен в диагностике отсутствия беременности до следующей ожидаемой охоты.

Из-за различий в составе белых кровяных клеток отдельных самок и различий в концентрациях ИФН-тау между клетками концепта ISG15, как и большинство других молекул, используемых в биохимической диагностике беременности, более полезен для выявления холостых коров, чем стельных.

Хотя результаты, полученные в лабораториях при использовании ISG15 для идентификации небеременных самок, особенно телок, были многообещающими, до сих пор не был разработан ориентированный на потребителя тест на активацию мРНК ISG15, поэтому должна использоваться полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени для обнаружения мРНК ISG15 в материнской сыворотке.^38,43 Кроме того, для достижения максимальной точности (>99,9%) при использовании мРНК ISG15 для выявления нестельных коров и телок необходима серия анализов крови. В исследовании 2006 года, проведенном Han et al., точность в обнаружении нестельных коров по одному образцу крови (день 18) составила 89%.⁴³ Еще более усложняющим потенциальное применение ISG15 в качестве средства раннего определения стельности является активация ISG15 ( контролирует концентрацию интерферонов) в ответ на интерферон при вирусной инфекции. Если для выявления беременности полагаться исключительно на уровни экспрессии мРНК ISG, вирусинфицированные холостые коровы могут быть ложно диагностированы как стельные.⁴³ Хотя использование мРНК ISG15 при раннем определении беременности в настоящее время нецелесообразно в коммерческих хозяйствах, по мере дальнейших научных достижений и усовершенствования эта инновационно новая технология может однажды быть адаптирована для широкого использования в диагностике беременности и прогнозировании эмбриональной смертности.

Среди наиболее перспективных молекул для потенциального будущего использования при раннем определении стельности - циркулирующие нуклеиновые кислоты. Циркулирующие нуклеиновые кислоты (CNA) представляют собой внеклеточные молекулы ДНК/ РНК, циркулирующие в крови, и в течение ряда лет используются в качестве биомаркеров как у больных, так и у здоровых людей и животных. У людей CNA используются главным образом для диагностики некоторых опухолей и других заболеваний. Во время человеческой беременности CNA часто используются для скрининга генетических аномалий, таких как хромосомная анеуплоидия.⁴⁴ В отличие от человеческих плодов, трофобласты крупного рогатого скота не имеют прямого контакта с материнской кровью, и поэтому обмен генетическим материалом плода происходит реже, чем у людей. Тем не менее, было продемонстрировано, что «трансплацентарная утечка» бычьей эмбриональной ДНК в материнский кровоток может и часто происходит, несмотря на структуру эпителиохориальной плаценты, хотя механизмы, ответственные за этот обмен, еще не выяснены.^45,46 Другие исследования показали, что CNA могут быть использованы для точного (100% для самцов, 91% для самок) определения пола теленка после 30-го дня беременности.^46,47 Mayer и соавт.^44,48 недавно охарактеризовали различия в составе CNA между стельными и нестельными коровами на 20-й день беременности, обнаружив несколько последовательностей, присутствующих исключительно в сыворотке беременных самок. Хотя это специфическое применение технологии CNA все еще находится в зачаточном состоянии, эти результаты указывают на то, что когда-нибудь будет возможно использовать CNA для идентификации беременных коров и телок уже через 20 дней после осеменения.

Новые исследования

Помимо четырех ранее описанных молекул, ассоциированных с беременностью, которые были хорошо протестированы и рассмотрены в научной литературе, существует ряд других второстепенных показателей, которые могут однажды оказаться полезными для коммерческой диагностике стельности у крупного рогатого скота. По мере накопления наших знаний о ранней беременности и ранних материнских реакциях на зачатие, будет раскрыто больше биомолекул, потенциально применимых при определении беременности. Как и в случае с существующими биохимическими тестами на беременность, эти новые и будущие тесты будут направлены на обнаружение концепта до следующего ожидаемого эструса у коровы, чтобы ее можно было, при необходимости, осеменить как можно быстрее.

Заключение

Системы интенсивного репродуктивного менеджмента делают раннее и точное определение беременности необходимостью в животноводческой отрасли, особенно в коммерческих молочных комплексах. Хотя производители традиционно ограничивались трансректальной пальпацией и трансректальным УЗИ для диагностики стельности, быстро становятся доступны различные биохимические тесты на стельность. Сводка тестов, обсуждаемых в этой главе, и их характеристика представлена в таблице 35.1. Все эти тесты могут диагностировать беременность или небеременность раньше, чем традиционные методы (трансректальная пальпация и трансректальное ультразвуковое исследование), при этом сохраняя сходный уровень точности. Тем не менее, сами по себе, они не способны определить срок стельности и могут потребовать некоторой информации о случке или дате искусственного осеменения.

Таблица 35.1 Обзор биохимических показателей, в настоящее время используемых для диагностики стельности у крупного рогатого скота.