Воспроизводство крупного рогатого скота

Δ¹⁶-андростеновые стероиды. Вместе с тем в настоящее время достоверно установлено, что тестостерон — наиболее сильнодействующий андроген, вырабатываемый клетками Лейдига в семенниках млекопитающих; он действует главным образом на клетки-мишени семенных канальцев, влияя тем самым на редукционное деление сперматогенных клеток.⁷⁸ Андрогены стимулируют выработку клетками Сертоли андрогенсвязывающего белка (ABP),⁷⁹ который служит внутриклеточным переносчиком тестостерона и DHT в клетках Сертоли. Тестостерон также является важнейшим фактором, определяющим скорость образования фруктозы в семенных пузырьках человека, быка и барана, а также лимонной кислоты в предстательной железе и семенных пузырьках быка, барана и человека.⁷⁸

Окситоцин — нейропептидный гормон, состоящий из девяти аминокислот. Обычно его связывают с гипоталамо-нейрогипофизарной системой и регуляцией родов и лактации у самок, однако показано, что он также играет эндокринную и паракринную роль в репродуктивной функции самцов.^{19, 80} В литературе имеются данные о том, что окситоцин вырабатывается и секретируется органами репродуктивной системы самцов, включая семенники.^{81, 82} Более того, в настоящее время имеются данные, свидетельствующие о местной выработке окситоцина в семеннике и его паракринной роли в регуляции стероидогенеза в семеннике и сократительной активности органов репродуктивной системы самцов.⁸³ Кроме того, показано, что в семеннике этот гормон вырабатывается клетками Лейдига, а окситоцин действует как паракринный гормон, влияющий на сократительную активность перитубулярных миоидных клеток.¹⁹ Предполагается, что сокращение миоидных клеток эпителия семенных канальцев способствует продвижению сперматозоидов через паренхиму семенника в сеть семенника и далее в систему придатка семенника. Показано, что в предстательной железе тестостерон под действием 5α-редуктазы превращается в DHT, который стимулирует рост этой железы. Николсон⁸³ выдвинул гипотезу, согласно которой окситоцин повышает активность 5α-редуктазы, что приводит к увеличению концентрации DHT и росту предстательной железы, тогда как андрогенная обратная связь снижает концентрацию окситоцина в предстательной железе и тем самым регулирует ее рост. Убедительные доказательства синтеза окситоцина в семеннике быка получены в исследованиях экспрессии гена окситоцина в семенных канальцах.^84,85

Релаксин и INSL-3

Инсулиноподобный пептид 3 (INSL3; ранее известный как релаксиноподобный фактор) — пептидный гормон, принадлежащий к семейству пептидных гормонов релаксина и инсулина.^{86, 87} Впервые он был обнаружен в семенниках свиней⁸⁸ и в настоящее время считается важным фактором регуляции нормального опускания семенников,⁸⁷ особенно на второй его стадии, когда он воздействует на направляющую связку семенника, что было продемонстрировано на мышах с выключенным геном. Этот пептидный гормон обнаружен в тканях самцов и самок других видов, в том числе человека, обыкновенной игрунки, овцы, козы, крупного рогатого скота, а также оленя, собаки и других видов.⁸⁹ Он вырабатывается в больших количествах клетками Лейдига семенников как плодов, так и взрослых особей; концентрации циркулирующего INSL3 измерены в крови взрослых самцов млекопитающих, включая крысу (5 нг/mL),⁹⁰ мышь (2 нг/mL)⁹⁰ и человека (0.8–2.5 нг/mL).^91,92 Хотя INSL3 был успешно выделен из семенника быка⁹³ и обнаружен

в амниотической жидкости плодов мужского пола человека,⁹⁴ лишь недавно Ананд-Айвелл и соавторы .⁹⁵ с помощью нового иммуноанализа с временным разрешением флуоресценции для непосредственного выявления INSL3 в крови и биологических жидкостях жвачных сообщили, что в середине стельности (день 153) концентрация INSL3 в крови коров, вынашивающих плод мужского пола, была значительно выше, чем у коров, вынашивающих плод женского пола. Авторы предполагают, что INSL3 представляет собой первый пример полоспецифического гормона плода, потенциально способного влиять на физиологию как плаценты, так и матери. В недавнем обзоре сообщается, что INSL3 является одним из основных продуктов секреции интерстициальных клеток Лейдига зрелых семенников у всех самцов млекопитающих.⁹⁶ Кроме того, имеющиеся данные указывают на его аутокринную, паракринную и эндокринную функции, опосредованные рецептором 2 семейства релаксиновых рецепторов, сопряженным с G-белком (RXFP2), хотя для подробного изучения этих функций необходимы дальнейшие исследования. В частности, недавние исследования выявили наличие в сперматозоидах свиней рецепторов RXFP1 и RXFP2,⁹⁷ что позволяет предположить важную роль релаксина в подвижности сперматозоидов.⁹⁸ Однако у крупного рогатого скота еще предстоит подтвердить наличие рецепторов релаксина, способность сперматозоидов связывать релаксин и повышение их подвижности под его действием; с появлением новых технологий это может стать возможным.⁹⁹

Семенные канальцы, клетки Сертоли, герминативная ткань

В участках паренхимы семенника расположены семенные канальцы, первоначально образующиеся из первичных половых тяжей. Семенные канальцы содержат клетки Сертоли, также известные как клетки-кормилицы развивающихся половых клеток, и сперматогонии — удлиненные клетки, находящиеся внутри канальцев. Клетки Сертоли были впервые описаны итальянским физиологом Энрико Сертоли в начале 1860-х годов. Эти клетки имеют большое структурное значение: они образуют гематотестикулярный барьер, отделяющий интерстициальное кровеносное пространство семенника от адлюминального пространства семенных канальцев. Помимо того что клетки Сертоли обеспечивают развитие и созревание половых клеток на различных стадиях сперматогенеза, они действуют как фагоциты, удаляя или поглощая остаточную цитоплазму и избыточный материал сперматозоидов. Клетки Сертоли также активно выполняют секреторную функцию: они вырабатывают антимюллеров гормон (AMH) — гликопротеин, который секретируется семенником на ранних стадиях внутриутробного развития и направляет формирование мужского репродуктивного тракта, вызывая регрессию мюллеровых протоков.^100,101 Мутации гена AMH приводят у мужчин к синдрому персистенции мюллеровых протоков;¹⁰² наблюдается ли то же явление у крупного рогатого скота, не сообщалось. Однако в недавних исследованиях профили AMH успешно использовали в качестве нового биомаркера для определения наличия функционального семенника при крипторхизме у телят японской черной породы.¹⁰³ Более подробный обзор цитологии клеток Сертоли содержится в работе де Кретсера и Керра.³³

Кроме того, клетки Сертоли секретируют два близкородственных белковых комплекса из надсемейства цитокинов — трансформирующих факторов роста (активин и ингибин), которые оказывают противоположное регулирующее действие на синтез и секрецию гипофизарного FSH. Активин усиливает, а ингибин

подавляет синтез и секрецию FSH.^104,105 Оба этих гормона секретируются после полового созревания и играют важную роль в размножении млекопитающих, которое координируется различными путями межклеточной коммуникации: нервными, нейроэндокринными, эндокринными и паракринными.¹⁰⁶ Предполагается также, что активин способствует синтезу андрогенов в семеннике, усиливая действие LH и тем самым стимулируя сперматогенез. Считается, что у самцов млекопитающих выработку ингибина стимулируют андрогены семенника и что ингибин может действовать местно, помогая регулировать сперматогенез. О механизме действия ингибина известно значительно меньше, однако предполагается, что он может конкурировать с активином за связывание с рецептором активина и/или связываться со специфическим рецептором ингибина.¹⁰⁵ Однако Филлипс¹⁰⁷ в обзоре литературы отмечает, что ингибин не только регулирует секрецию FSH у самцов по механизму обратной связи, но и может быть важным паракринным и аутокринным регулятором функции семенника. Молекулярные исследования показали, что семенник быка вырабатывает обе формы ингибина (A и B) и что по мере взросления быков доля зрелых форм ингибина A и ингибина B возрастает, тогда как общая выработка ингибина клетками Сертоли снижается.¹⁰⁸ В более позднем исследовании Канеко и соавторы .¹⁰⁹ сообщили, что в ходе постнатального развития быков содержание ингибинов A и B в семеннике увеличивалось и что иммунореактивный ингибин A обнаруживался в плазме этих быков. Другие исследователи пытались использовать концентрацию ингибина в крови и экспрессию его гена наряду с другими эндокринными и генетическими маркерами для прогнозирования фертильности быков породы брахман.¹¹⁰ К сожалению, в современной литературе, по-видимому, мало сведений о роли активина у самцов крупного рогатого скота. Предполагается, что он действует как паракринный регулятор в семеннике, но для домашних животных это окончательно не доказано, хотя исследования in vitro на клетках Лейдига свиней указывают на его возможную роль в синтезе андрогенов.¹⁰⁷ Вместе с тем считается, что у самок крупного рогатого скота он является важным внутрифолликулярным фактором, регулирующим отбор фолликулов.^111,112 Также выдвинута гипотеза об участии активина в воспалительных процессах.¹⁰⁷

К другим веществам, секретируемым клетками Сертоли, относятся ABP, эстрадиол (образующийся при превращении тестостерона под действием ферментного комплекса ароматазы), нейротрофический фактор глиальных клеток, трансферрин¹¹³ и недавно идентифицированный фактор транскрипции ERM. Трансферрин семенника и ABP — два гликопротеина, которые вырабатываются клетками Сертоли и секретируются ими в просвет канальца; они оказывают важное биологическое влияние на дифференцировку и созревание сперматозоидов.^114,115 ABP — гликопротеин, специфически связывающий тестостерон, DHT и 17β-эстрадиол. При связывании с ABP стероидные гормоны тестостерон и DHT становятся менее липофильными и накапливаются в более высокой концентрации в просвете семенных канальцев, способствуя тем самым сперматогенезу. Синтез ABP регулируется действием FSH на клетки Сертоли, которое может усиливаться инсулином и тестостероном. В частности, ABP может связываться с тестостероном, поддерживая высокую концентрацию андрогена в семенном канальце, что способствует развитию и созреванию сперматогенных клеток. Андроген переносится в клетки-мишени, а затем посредством механизма ядерного транспорта — в ядро, где связывается с андрогенными рецепторами, регулирующими трансляцию генов-мишеней. Способность ABP связываться с андрогеном свидетельствует о его участии в половой дифференцировке и созревании половых клеток.¹¹³

Продукты экспрессии генов клеток Сертоли включают факторы роста, метаболические ферменты, транспортные белки (напримерg, трансферрин и ABP), ингибин, протеазы, антипротеазы, энергетические метаболиты и структурные компоненты.¹¹⁶ Трансферрин — один из основных продуктов секреции дифференцированных клеток Сертоли; предполагается, что он переносит железо, изолированное гематотестикулярным барьером, к развивающимся половым клеткам. Fe³⁺ в крови переносится в клетки Сертоли, связывается с трансферрином, синтезируемым клетками Сертоли, а затем поступает к развивающимся сперматогенным клеткам, способствуя росту и созреванию половых клеток. Известно, что синтез и секреция трансферрина и ABP регулируются FSH и андрогенами. Гонадотропин FSH — важный эндокринный гормон, необходимый для регуляции функции клеток Сертоли.¹¹⁷ Показано, что FSH регулирует экспрессию большинства генов клеток Сертоли, в том числе генов рецептора FSH, ABP, трансферрина, активатора плазминогена и ароматазы.^118–121

Нейротрофический фактор глиального происхождения (GDNF) — небольшой белок, обычно связанный с поддержанием выживаемости нейронов.¹²² Его роль в функции семенников изучена не полностью, однако некоторые данные указывают на то, что он может способствовать сохранению недифференцированных сперматогониев, обеспечивая самообновление стволовых клеток в перинатальный период.¹²³ Кроме того, Джонстон и соавт. .¹²⁴ показали на взрослых крысах, что циклические изменения экспрессии GDNF клетками Сертоли определяют зависящие от стадии размножение и дифференцировку стволовых сперматогониев — клеток, лежащих в основе сперматогенеза. Согласно недавно опубликованным данным, GDNF не столько вызывает пролиферацию стволовых клеток сперматогониев, сколько усиливает их самообновление и повышает выживаемость сперматогониев крупного рогатого скота в культуре.¹²⁵ Интересное наблюдение описали Харикаэ и соавт. .¹²⁶ Это редкий случай рождения телёнка-фримартина, у которого наблюдалась трансдифференцировка соматических клеток яичника в соматические клетки семенника, в том числе клетки Сертоли, клетки Лейдига и перитубулярные миоидные клетки; при этом клетки Сертоли давали положительную реакцию при окрашивании на белок GDNF. Авторы предполагают, что эти наблюдения свидетельствуют о высоком потенциале половой пластичности яичников млекопитающих с набором хромосом XX. За более подробным обзором функций и регуляции клеток Сертоли читатель может обратиться к обстоятельной обзорной работе Расселла и Грисволда.¹²⁷

Сперматогенез и созревание сперматозоидов

Первые исследования процесса сперматогенеза и сперматогониев домашнего быка были опубликованы во второй половине XIX века,¹²⁸ но лишь в 1931 было определено число хромосом в сперматогониях и сперматоцитах и установлено, что диплоидное число составляет 60.¹²⁹ В последующих исследованиях, проведённых после Второй мировой войны, половые клетки и их цитоплазматические структуры были описаны более подробно.¹²⁸ В настоящее время установлено, что сперматогенез — сложный клеточный процесс, в ходе которого из диплоидных стволовых клеток-сперматогониев путём последовательных клеточных преобразований образуются сперматозоиды — гаплоидные мужские половые клетки, или гаметы. Эти сложные преобразования происходят в извитых семенных канальцах млекопитающих и могут занимать продолжительное время, зависящее от вида животного. С морфологической точки зрения сперматогенез описывают как последовательность чётко различимых клеточных

«стадий» или «фаз», сменяющих друг друга в ходе строго упорядоченных и точно синхронизированных циклов.³⁵ Во время внутриутробного развития первичные половые клетки мигрируют в эмбриональные семенники, где в результате митотического деления образуют гоноциты. Незадолго до полового созревания гоноциты дифференцируются, формируя исходный пул сперматогониев A0 — стволовых клеток, от которых происходят все последующие классы сперматогониев. Сперматогенез в извитых семенных канальцах семенника проходит три отдельные стадии. Первая стадия — сперматоцитогенез, пролиферативная фаза, в ходе которой сперматогонии претерпевают ряд митотических делений и образуют сперматоциты первого порядка. Вторая стадия — мейоз, в ходе которого сперматоциты первого порядка претерпевают редукционное деление с уменьшением числа хромосом: из сперматоцитов первого порядка (4 n ) образуются сперматоциты второго порядка, являющиеся диплоидными (2 n ), а в результате заключительного деления — округлые гаплоидные (1 n ) сперматиды. Заключительная стадия — дифференцировка гаплоидных сперматид, называемая спермиогенезом: округлые сперматиды претерпевают ряд преобразований, превращаясь в удлинённые сперматозоиды со жгутиками.^35,130

Сперматоцитогенез

Начальная пролиферация происходит в базальном компартменте извитых семенных канальцев, где находятся половые клетки. Сперматогонии происходят из базального слоя половых клеток; в ходе цикла дифференцировки они проходят ряд митотических делений, число которых может зависеть от вида животного, образуя сперматогонии от A1 до A4, а также сперматогонии I и B. Сперматогонии продвигаются от базальной пластинки извитых семенных канальцев группой клеток, соединённых межклеточными мостиками, которые обеспечивают связь между их цитоплазмами. Эти цитоплазматические мостики могут облегчать межклеточное взаимодействие и тем самым поддерживать синхронное развитие группы сперматогониев. У быка и барана во время сперматоцитогенеза происходят четыре митотических деления, в результате которых из каждого активного сперматогония образуется 16 сперматоцитов первого порядка.¹⁸ При этом сохраняется пул стволовых половых клеток (покоящихся сперматогониев A1 и A2), дающий начало новым поколениям сперматогониев (самообновление стволовых клеток). Это обеспечивает непрерывное образование сперматозоидов у взрослого самца, хотя точный механизм такой регенерации, или самообновления половых стволовых клеток, изучен не полностью.¹³¹ В ходе этого процесса часть клеток может погибать вследствие дегенерации. Эти клетки поглощаются клетками Сертоли путём фагоцитоза.

Мейоз

Митотическое деление обеспечивает постоянное пополнение сперматогониев, тогда как мейотическое деление представляет собой процесс, при котором сперматогонии B претерпевают редукционное деление с образованием гаплоидных сперматоцитов.³⁵ Этот мейотический процесс не только уменьшает вдвое число хромосом в сперматоцитах, но и обеспечивает генетическое разнообразие благодаря репликации ДНК и кроссинговеру — событиям, в результате которых образуются генетически уникальные сперматозоиды. Репликация и кроссинговер ДНК происходят во время первого мейотического деления, тогда как второе мейотическое деление приводит к образованию

гаплоидных сперматоцитов. Из-за продолжительности мейотического периода сперматогенеза, который у быка составляет от 18 до 21 дней, в семенном эпителии можно обнаружить сперматоциты на всех стадиях развития (рисунок 2.3a). По завершении мейоза у быков из каждого сперматогония B образуются четыре гаплоидные сперматиды, а из одного активного сперматогония (A3) — в общей сложности 64 сперматид.^132–134

Спермиогенез

Заключительная фаза — дифференцировка, или превращение, округлых сперматид в удлинённые зрелые сперматозоиды со жгутиками и сильно уплотнённым ядром, которые высвобождаются в просвет извитого семенного канальца.³⁵ У различных видов домашних животных этот процесс протекает удивительно сходным образом и включает сложную последовательность событий, в ходе которых сперматида преобразуется в высокоорганизованную подвижную клетку.³³ Дифференцировка включает четыре основные фазы, протекающие в адлюминальном компартменте между соседними клетками Сертоли: фазу Гольджи, фазу шапочки, акросомную фазу и фазу созревания. В фазе Гольджи небольшие пузырьки аппарата Гольджи в цитоплазме сперматиды сливаются, образуя более крупную сложную структуру — акросомный пузырёк, или акросому. Акросома представляет собой ограниченный мембраной пузырёк, или лизосому, содержащую ряд ферментов, в том числе кислую гидролазу, акрозин, эстеразы, гиалуронидазу и лизин блестящей оболочки. По мере дифференцировки акросома начинает перемещаться и образует шапочку над ядром клетки. При формировании шапочки акросомный пузырёк уплощается и покрывает примерно треть ядра.³⁵ Одновременно ядро и цитоплазма удлиняются, а ядро начинает занимать головную часть сперматиды. По мере удлинения головной части сперматиды формируются средняя часть и хвост, что знаменует начало фазы созревания. Митохондрии перемещаются в цитоплазме и спирально располагаются вокруг жгутика позади ядра, формируя среднюю часть сперматиды. Жгутик берёт начало от дистальной центриоли, из которой развивается аксонема, состоящая из девяти пар микротрубочек, радиально расположенных вокруг двух центральных филаментов.²¹ Аксонема соединяется с основанием ядра, проходит через среднюю часть и продолжается, образуя главную часть, или «хвост», сперматиды. Когда при формировании хвоста сперматида избавляется от части цитоплазмы, на шейке сперматозоида образуется цитоплазматическая капля. После завершения этих преобразований удлинённую сперматиду со жгутиком называют сперматозоидом (рисунок 2.3b). Все эти преобразования — важные этапы развития, обеспечивающие сперматозоидам не только подвижность, но и способность к оплодотворению и передаче ядерного материала при контакте с женской гаметой (ооцитом).

Спермиация

На заключительном этапе развития сперматозоиды высвобождаются в просвет извитых семенных канальцев в процессе, называемом спермиацией.³³ По мере завершения последних стадий