Воспроизводство крупного рогатого скота

1. Удалите надпочечники.

2. Удалите мочевыводящие пути, сделав несколько срезов почек. Идентифицируйте половые органы.

3. Поочередно разрежьте печень и селезенку.

4. Вскройте преджелудки и сычуг, осмотрите на предмет содержимого. Перейдите к кишечнику, делая несколько разрезов вдоль каждого основного раздела (двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, ободочной кишки). Изучите содержимое и слизистую оболочку.

5. Соберите органы (почки, печень, легкие, селезенку, тимус, надпочечники) в стерильные пакеты (плацента хранится в отдельной сумке), охладите.

6. Соберите в формалин для гистопатологии 5-ти миллиметровые срезы: легких, печени, почек, селезенки, сердца, надпочечников, скелетных мышц (три-четыре отдела, включая язык, диафрагму), щитовидной железы, подвздошной кишки, кожи (включая веко), тимуса и брыжеечного лимфатического узла.

7. Отделите голову от тела в области атланто-затылочного сустава. Соберите весь мозг, даже если он сильно автолизирован, и поместите весь в формалин. Если плод сильно аутолизирован, перед фиксацией возьмите мазок из ткани головного мозга. Череп является относительно мягким и может быть легко открыт с помощью пилы посредством двух разрезов вдоль внутренних сторон затылочных мыщелков, краниально (и несколько латерально по изгибу свода черепа) к внутренним сторонам орбитальных ободков (края глазницы) . Сделайте третий разрез поперек орбитального гребня, соединяя первые два разреза. Отделите вырезанный кусок черепа от головы. Поместите мозг в ладонь и с помощью скальпеля аккуратно разрежьте нервные отростки основания мозга, позволяя мозгу попасть в вашу руку.

8. Соберите глазную жидкость с помощью иглы / шприца для определения уровня нитратов / нитритов, если необходимо, заморозьте.

9. Откройте несколько суставов, ищите гнойный экссудат, фибрин и кровоизлияния.

10. Изучите плодные оболочки на наличие экссудата, поражения, аномалии.(см. следующий раздел для получения подробных инструкций). Удалите грязь / мусор с мембран до отбора проб.

11. Поместите два-три среза с котиледонами в стерильный пакет, охладите; произведите отбор мазков с любых пораженных участков.

12. Возьмите образцы плаценты для гистопатологии (не менее трехчетырех срезов, включая котиледоны и межкотиледонные области).

13. Возьмите образцы околоплодных вод, если они есть, охладите.

14. Возьмите образцы крови абортировавшей коровы в пробирку с красным верхом (также могут быть собраны образцы крови от других коров стада; рекомендуется 10 коров или 10% стада).

Исследование плодных оболочек

Соберите как можно больше мембран и тщательно осмотрите хориоаллантоис и амнион, так как поражения могут быть трудноразличимыми, очаговыми и их можно легко пропустить. Во многих случаях оболочек мало или их вообще невозможно исследовать. Важно попытаться проверить, все ли мембраны были удалены. Из-за прикрепления амниона к хориону, а также из-за короткой пуповины у плода, оболочки разрываются и плод выходит из амниона и хориоаллантоиса при родах. Обычно мембраны обнаруживаются с наружней стороны котиледонов.

Плодные оболочки можно разложить в длину, чтобы идентифицировать пупок и вместе с ним внутреннюю часть амниона. В это же время лучше всего проводить исследование амниотических оболочек и жидкостей. Пупок состоит из четырех мышечных тургидных (тургор - набухший, наполненный) сосудов (артерий и вен), свободно скользящих внутри оболочек.

Гравидный (беременный) рог легко идентифицировать как бо'льшую половину ткани с бо'льшими плацентомами. Аваскулярные (бессосудистые) кончики хориона следует находить и тщательно осматривать, так как истинные поражения плаценты могут присутствовать в гравидном роге рядом с кончиком.¹⁶ Пуповина непрерывна с пупочными артериями и венами, которые образуют продольную ось, по которой можно ориентироваться в плаценте. От нее можно исследовать внутреннюю часть аллантоисной полости, уделяя внимание природе присутствующих жидкостей, толщине и цвету мембран и специфическим запахам. Обычно во время такого исследования встречаются аллантоисные кальцинаты.

После размещения пупочных сосудов с одной стороны ткани можно сделать продольный разрез вдоль противоположной стороны плаценты, который позволит открыть плаценту и разложить ее на плоскости, при этом пупочные сосуды образуют центральную ось (Рисунок 54.14). Рога имеют неодинаковый размер, а гравидный рог намного больше. Таким образом, сосуды и ряды котиледонов (обычно четыре) могут быть тщательно исследованы. Свежие котиледоны имеют красную бархатистую текстуру со слегка неровной поверхностью. Следует отметить изменение размера, формы, цвета, консистенции и степени пятнистости котиледонов, а также степень аутолиза. Иногда могут быть видны небольшие лоскуты прикрепленной карункулярной ткани. Края котиледонов, как правило, четко очерчены, а межкотиледонные участки хориона белые, полупрозрачные и гладкие. Адвентициальная плацентация - это частая находка, которая проявляется в виде небольших котиледонов или ворсинчатых пучковидных образований, прилегающих к плацентомам, которые могут покрывать всю плаценту.

Сбор образцов

В каждом случае аборта следует собирать полный набор тканей.⁴⁴ Биологические образцы должны надлежащим образом отбираться, подготавливаться, храниться и транспортироваться, в противном случае будет нарушена точность диагностики. Важно поддерживать асептические условия, несмотря на очевидное загрязнение тканей; это необходимо для увеличения шансов на достоверную диагностику и последующую профилактику зоонозной инфекции. Микробиологические образцы должны храниться в охлажденном виде и их следует как можно скорее отправить в диагностическую лабораторию в пенополистирольном холодильнике с пакетами со льдом ночной курьерской доставкой. Если образцы свежей ткани не могут быть отправлены в течение 2–3 дней, то идеальным вариантом будет замораживание при –70°C и доставка на сухом льду.⁴⁴ При необходимости образцы можно временно поместить при –20 °C до получения сухого льда. Традиционно замороженные ткани (-20 °C) часто приемлемы для ПЦР-тестирования многих патогенов.

Образцы сычужной и грудной/перикардиальной жидкости следует отправлять в стерильных пробирках без добавок. Замороженная печень, легкие и почки плода (кусочки 2,5–5 см, –20 °C) должны храниться для тестирования на случай подозрения на пищевое или токсикологическое заболевание после первоначального исследования.³⁹

Охлажденные или замороженные ткани следует помещать в герметичные мешки (пакеты типа whirl-pak (стерильные полиэтиленовые лабораторные пакеты) часто протекают), предпочтительно поместив их в дополнительный пакет. При отправке жидкостей в стеклянных тубах, необходимо достаточно заполнить их и расположить в герметичных контейнерах. Абсорбирующие материалы также должны быть включены в упаковку, чтобы предотвратить вымачивание наружной поверхности, что усложняет и может задержать процесс доставки. Одноразовые подгузники являются эффективным вариантом.³⁹ Обратитесь в свою диагностическую лабораторию для уточнения надлежащих требований к упаковке и доставке абортивных образцов, поскольку они могут содержать инфекционные и/или зоонозные агенты.

Вирусы могут иметь очень специфические тканевые тропизмы (т.е. избирают в качестве среды обитания конкретные ткани) и, следовательно, для изоляции требуются определенные ткани. Образцы должны быть собраны как можно скорее, поскольку автолиз может быть крайне вредным для вирионов. Вирусологические образцы при абортах, как правило, объединяются, хотя в идеале нужно размещать ткани в отдельных пакетах. Плацентарные ткани следует упаковывать отдельно. Не объединяйте образцы от нескольких абортов. Ткани следует хранить в прохладном месте, но не замораживать до прибытия в диагностическую лабораторию. Если ткани не будут использоваться немедленно, то лучше заморозить их при –70 °C, чем при –20 ° C.³⁹ Если живые вирусы отправляются упакованными в сухой лед, обязательно поместите образцы в герметичные контейнеры, так как газообразной фазой сухого льда является углекислый газ, который может снизить рН образца и инактивировать некоторые вирусы. Некоторые лаборатории могут иметь разные предпочтения в отношении вирусологических образцов, особенно если есть веские подозрения на определенный патоген.

Бактериологические образцы тканей должны иметь размер 2,5–5 см с каждой стороны, чтобы поверхности могли быть подвергнуты термоизоляции для правильного культивирования. Наружные пробы и пробы из пищеварительного тракта не должны упаковываться внутренними органами. Если образцы загрязнены, может принести пользу отправка тампонажной культуры (Culturette) в дополнение к тканям. Для сильно разложившихся образцов асептически собранная ткань мозга может быть полезна для выделения соответствующих организмов.²² Грибковые пробы должны, по крайней мере, включать пораженные котиледоны; однако, лучше всего отправить всю плаценту. Данная инфекция плода противоречива, но в ее диагностике могут быть полезны легкие, кожа и содержимое сычуга.

Для гистопатологии лучше всего использовать срезы шириной около 5 мм в 10% нейтральном буферном формалине. Мозг, однако, должен быть погружен в формалин целиком, без рассечения.

Если мозг сжижен, фиксируйте отдельно. Для небольших поражений, должны быть представлены несколько очагов.

При крупных повреждениях следует отбирать несколько срезов, включая края с нормальными и ненормальными тканями. Четко идентифицируйте любые видимые повреждения, чтобы предупредить диагноста.

Для правильной фиксации необходимо не менее 10 объемов формалина на объем ткани. Ткани должны быть зафиксированы в течение не менее 24 часов, предпочтительно в течение 3-х дней. В частности, мозг требует достаточного количества фиксатора в течение 3-4 дней. В регионах с холодным климатом для предотвращения замерзания образцов можно добавить 1 часть этанола к 9 частям формалина (10% этанола, 90% формалина).⁴⁵ Если формалина нет в наличии, можно использовать 70% этанол. Ткани могут быть отправлены в формалине, в противном случае зафиксируйте ткани на 24 часа, слейте формалин и отправьте в пакетах с увлажненной формалином марлей. Убедитесь, что образцы упакованы в двойные пакеты, так как контейнеры могут порваться при транспортировке. Свяжитесь с вашей диагностической лабораторией для получения инструкций.

В идеале образцы крови должны быть отобраны у абортировавшей коровы и плода. Свежие мазки крови особенно пригодятся, если есть подозрение на анаплазмоз. Кровь в ЭДТА является предпочтительной для ПЦР-тестирования. Для образцов сыворотки, наберите 8–10 мл сыворотки в пробирки без добавок, оставьте на 1-2 часа, пока сгусток не начнет втягиваться, затем поместите в холодильник на ночь. Сыворотку центрифугируют при 1000×g в течение 10 Tmin и декантируют; в таблице 54.5 перечислены типичные условия хранения образца. Отправьте в отдельной стерильной пробирке. Можно заморозить сыворотку (не замораживать цельную кровь) до тех пор, пока она не понадобится.

Диагностика

Постановка точного диагноза зависит от совместных усилий лечащего ветеринарного врача и диагностов в лаборатории. Даже с предоставлением надлежащих образцов поставить точный диагноз достаточно трудно. Изгнание мертвого плода часто происходит от нескольких часов до нескольких дней после смерти; в результате аутолиз еще более затрудняет задачу идентификации поражений плода. Фетальные мембраны, которые могут иметь единственные существенные поражения, часто отсутствуют для исследования. Кроме того, во многих случаях исследуемые ткани сильно загрязнены, либо из-за неполного изгнания, либо из окружающей среды. Наконец, диагностические лаборатории проводят рутинные тесты для своевременного выявления хорошо известных причин абортов. Таким образом, исследование необычных или недостаточно изученных этиологий выходит за рамки их компетенции.

Имейте в виду, что большая часть потерь беременности происходит на более ранних стадиях развития, когда изгнанные ткани менее всего заметны. Заболевания на ранних сроках беременности часто выявляются через несколько недель после свершившегося факта, что делает исследование и диагностику практически невозможными.

Таблица 54.5 Свежие образцы, собранные для фетальной и неонатальной диагностики.

Большая часть тканей, обследованных врачами и диагностическими лабораториями, от крупных плодов, что может повлиять на интерпретацию проблемы в стаде, в котором потери происходят на разных стадиях беременности. Аборты на поздней стадии могут быть результатом травмы за много недель до изгнания; они могут не показывать важных или значительных изменений, которые могли бы присутствовать в плодах, абортированных на более раннем сроке, что мешает точной диагностике. Что еще хуже, в попытке найти причину могут ошибочно обвиняться другие совпадающие агенты, в зависимости от того, что найдено в представленном плоде.⁶ Важно понимать, что в стаде могут работать более одного заболевания или проблем в управлении, что усложняет решение эндемических проблем. Могут присутствовать несколько патогенов; некоторые из них могут быть неочевидными, в то время как те, которые очевидны, не способны непосредственно приводить к аборту. В этих случаях определение фактической причины аборта является сложной задачей.

Результаты серологии следует интерпретировать с осторожностью. Положительный анализ от коровы указывает на воздействие, которое может иметь или не иметь значение в свете статуса вакцинации. Увеличение титра в 2–4 раза в течение 2-х недель может быть значительным, особенно при сравнении с образцами других коров стада.⁶ Однако, вполне вероятно, что уровни антител в сыворотке абортировавшей коровы достигли своего пика к моменту аборта, поэтому не удивительно, если отсутствует повышение титра через 2–3 недели.²⁴ Серология может быть особенно полезна при диагностике BVDV, лептоспироза, анаплазмоза и абортов, при которых агент трудно выявить другими методами.¹⁷ Присутствие специфических антител в сыворотке крови плода не означает, что именно этот агент является причиной аборта; BVDV и Neospora caninum - два тому примера. Результаты серологии должны быть тщательно взвешены с данными микробиологии, гистопатологии и анамнеза стада. В таблице 54.6 перечислены основные диагностические тесты для конкретных патогенов.

Таблица 54.6 Обзор диагностических тестов для патогенных микроорганизмов.

ELISA - иммуноферментный анализ; FA -непрямой флуоресцентный тест; GMS - метенаминовое окрашивание серебром по методу Гомори; H & E - стандартные гистопатологические красители; IFA - непрямой флуоресцентный тест; IHC - иммуногистохимия (обычно ткани, фиксированные формалином); КОН - тест с гидроокисью калия; PАS - циклическое Шифф-кислотное окрашивание; PCR - полимеразная цепная реакция; RT-PCR - ПЦР с обратной транскрипцией; VI - выделение вируса. Источник:Njaa BL. «Диагностика абортов и гибели новорождённых животных» Киркбрайда (Kirkbride) , 4-е изд., 2012.