Образцы сычужной и грудной/перикардиальной жидкости следует отправлять в стерильных пробирках без добавок. Замороженная печень, легкие и почки плода (кусочки 2,5–5 см, –20 °C) должны храниться для тестирования на случай подозрения на пищевое или токсикологическое заболевание после первоначального исследования.39
Охлажденные или замороженные ткани следует помещать в герметичные мешки (пакеты типа whirl-pak (стерильные полиэтиленовые лабораторные пакеты) часто протекают), предпочтительно поместив их в дополнительный пакет. При отправке жидкостей в стеклянных тубах, необходимо достаточно заполнить их и расположить в герметичных контейнерах. Абсорбирующие материалы также должны быть включены в упаковку, чтобы предотвратить вымачивание наружной поверхности, что усложняет и может задержать процесс доставки. Одноразовые подгузники являются эффективным вариантом.39 Обратитесь в свою диагностическую лабораторию для уточнения надлежащих требований к упаковке и доставке абортивных образцов, поскольку они могут содержать инфекционные и/или зоонозные агенты.
Вирусы могут иметь очень специфические тканевые тропизмы (т.е. избирают в качестве среды обитания конкретные ткани) и, следовательно, для изоляции требуются определенные ткани. Образцы должны быть собраны как можно скорее, поскольку автолиз может быть крайне вредным для вирионов. Вирусологические образцы при абортах, как правило, объединяются, хотя в идеале нужно размещать ткани в отдельных пакетах. Плацентарные ткани следует упаковывать отдельно. Не объединяйте образцы от нескольких абортов. Ткани следует хранить в прохладном месте, но не замораживать до прибытия в диагностическую лабораторию. Если ткани не будут использоваться немедленно, то лучше заморозить их при –70 °C, чем при –20 ° C.39 Если живые вирусы отправляются упакованными в сухой лед, обязательно поместите образцы в герметичные контейнеры, так как газообразной фазой сухого льда является углекислый газ, который может снизить рН образца и инактивировать некоторые вирусы. Некоторые лаборатории могут иметь разные предпочтения в отношении вирусологических образцов, особенно если есть веские подозрения на определенный патоген.
Бактериологические образцы тканей должны иметь размер 2,5–5 см с каждой стороны, чтобы поверхности могли быть подвергнуты термоизоляции для правильного культивирования. Наружные пробы и пробы из пищеварительного тракта не должны упаковываться внутренними органами. Если образцы загрязнены, может принести пользу отправка тампонажной культуры (Culturette) в дополнение к тканям. Для сильно разложившихся образцов асептически собранная ткань мозга может быть полезна для выделения соответствующих организмов.22 Грибковые пробы должны, по крайней мере, включать пораженные котиледоны; однако, лучше всего отправить всю плаценту. Данная инфекция плода противоречива, но в ее диагностике могут быть полезны легкие, кожа и содержимое сычуга.
Для гистопатологии лучше всего использовать срезы шириной около 5 мм в 10% нейтральном буферном формалине. Мозг, однако, должен быть погружен в формалин целиком, без рассечения.
Если мозг сжижен, фиксируйте отдельно. Для небольших поражений, должны быть представлены несколько очагов.
При крупных повреждениях следует отбирать несколько срезов, включая края с нормальными и ненормальными тканями. Четко идентифицируйте любые видимые повреждения, чтобы предупредить диагноста.
Для правильной фиксации необходимо не менее 10 объемов формалина на объем ткани. Ткани должны быть зафиксированы в течение не менее 24 часов, предпочтительно в течение 3-х дней. В частности, мозг требует достаточного количества фиксатора в течение 3-4 дней. В регионах с холодным климатом для предотвращения замерзания образцов можно добавить 1 часть этанола к 9 частям формалина (10% этанола, 90% формалина).45 Если формалина нет в наличии, можно использовать 70% этанол. Ткани могут быть отправлены в формалине, в противном случае зафиксируйте ткани на 24 часа, слейте формалин и отправьте в пакетах с увлажненной формалином марлей. Убедитесь, что образцы упакованы в двойные пакеты, так как контейнеры могут порваться при транспортировке. Свяжитесь с вашей диагностической лабораторией для получения инструкций.
В идеале образцы крови должны быть отобраны у абортировавшей коровы и плода. Свежие мазки крови особенно пригодятся, если есть подозрение на анаплазмоз. Кровь в ЭДТА является предпочтительной для ПЦР-тестирования. Для образцов сыворотки, наберите 8–10 мл сыворотки в пробирки без добавок, оставьте на 1-2 часа, пока сгусток не начнет втягиваться, затем поместите в холодильник на ночь. Сыворотку центрифугируют при 1000×g в течение 10 Tmin и декантируют; в таблице 54.5 перечислены типичные условия хранения образца. Отправьте в отдельной стерильной пробирке. Можно заморозить сыворотку (не замораживать цельную кровь) до тех пор, пока она не понадобится.
Диагностика
Постановка точного диагноза зависит от совместных усилий лечащего ветеринарного врача и диагностов в лаборатории. Даже с предоставлением надлежащих образцов поставить точный диагноз достаточно трудно. Изгнание мертвого плода часто происходит от нескольких часов до нескольких дней после смерти; в результате аутолиз еще более затрудняет задачу идентификации поражений плода. Фетальные мембраны, которые могут иметь единственные существенные поражения, часто отсутствуют для исследования. Кроме того, во многих случаях исследуемые ткани сильно загрязнены, либо из-за неполного изгнания, либо из окружающей среды. Наконец, диагностические лаборатории проводят рутинные тесты для своевременного выявления хорошо известных причин абортов. Таким образом, исследование необычных или недостаточно изученных этиологий выходит за рамки их компетенции.
Имейте в виду, что большая часть потерь беременности происходит на более ранних стадиях развития, когда изгнанные ткани менее всего заметны. Заболевания на ранних сроках беременности часто выявляются через несколько недель после свершившегося факта, что делает исследование и диагностику практически невозможными.
Таблица 54.5 Свежие образцы, собранные для фетальной и неонатальной диагностики.
| Тесты | Хранение | Образцы | Примечания |
|---|---|---|---|
| Бактериологический / | Хранить в холодильнике не | Содержимое желудка, перикардиальная | Соберите содержимое желудка или |
| микологический (культивирование, ПЦР) | замороженным, если только ПЦР | жидкость, печень, легкое, мозг, плацента | перикардиальную жидкость в шприц с помощью иглы большого калибра. |
| Вирусологический (выделение | Может быть заморожен (в | Легкие, печень, почки, сердце, кровь, | Упакуйте каждый образец в отдельные контейнеры |
| вируса, тест на флуоресцентные антитела, ПЦР) Кормление, токсикология | –70 ° C при необходимости) Может быть заморожен | плацента Печень, почки, глазная жидкость | Упакуйте каждый образец в отдельные контейнеры |
| Плодные / материнские жидкости | Хранить в холодильнике | Сыворотка коровы/фетальные жидкости | По возможности парные образцы сыворотки (в день аборта и спустя 2-3 недели |
Большая часть тканей, обследованных врачами и диагностическими лабораториями, от крупных плодов, что может повлиять на интерпретацию проблемы в стаде, в котором потери происходят на разных стадиях беременности. Аборты на поздней стадии могут быть результатом травмы за много недель до изгнания; они могут не показывать важных или значительных изменений, которые могли бы присутствовать в плодах, абортированных на более раннем сроке, что мешает точной диагностике. Что еще хуже, в попытке найти причину могут ошибочно обвиняться другие совпадающие агенты, в зависимости от того, что найдено в представленном плоде.6 Важно понимать, что в стаде могут работать более одного заболевания или проблем в управлении, что усложняет решение эндемических проблем. Могут присутствовать несколько патогенов; некоторые из них могут быть неочевидными, в то время как те, которые очевидны, не способны непосредственно приводить к аборту. В этих случаях определение фактической причины аборта является сложной задачей.
Результаты серологии следует интерпретировать с осторожностью. Положительный анализ от коровы указывает на воздействие, которое может иметь или не иметь значение в свете статуса вакцинации. Увеличение титра в 2–4 раза в течение 2-х недель может быть значительным, особенно при сравнении с образцами других коров стада.6 Однако, вполне вероятно, что уровни антител в сыворотке абортировавшей коровы достигли своего пика к моменту аборта, поэтому не удивительно, если отсутствует повышение титра через 2–3 недели.24 Серология может быть особенно полезна при диагностике BVDV, лептоспироза, анаплазмоза и абортов, при которых агент трудно выявить другими методами.17 Присутствие специфических антител в сыворотке крови плода не означает, что именно этот агент является причиной аборта; BVDV и Neospora caninum - два тому примера. Результаты серологии должны быть тщательно взвешены с данными микробиологии, гистопатологии и анамнеза стада. В таблице 54.6 перечислены основные диагностические тесты для конкретных патогенов.
Таблица 54.6 Обзор диагностических тестов для патогенных микроорганизмов.
| Агент | Предпочтительные ткани плода | Предпочтительный диагностический тест | Дополнительная диагностика |
|---|---|---|---|
| Герпесвирус крупного рогатого скота 1 | Почки, надпочечники, печень, легкие | FA (замороженные ткани), IHC, VI | IHC плаценты, если присутствует плацентит |
| Вирусная диарея крупного рогатого скота вирус | Легкое, сердце, почки, плацента, кожа | FA, IHC, VI, PCR | ELISA с захватом антигена, RT-PCR |
| Вирус блютанга | Мозг, селезенка | PCR, VI | Серология плода |
| Буньявирусы | Никакая | Никакой | Фетальная / доколостральная серология; врожденные аномалии |
| Brucella | Плацента, легкое, содержимое | Бактериальный посев | Посев молока от матери; серология матери и плода |
| сычуга, содержимое матки | Окрашивание по Граму свежих абортированных | ||
| Listeria | Плацента, легкое, мозг, содержимое сычуга | Бактериальный посев, IHC | тканей, ПЦР |
| Salmonella | Плацента, печень, легкое, содержимое сычуга | Бактериальный посев | |
| Yersinia pseudotuberculosis | Плацента, печень, легкое, содержимое сычуга, кишечник | Бактериальный посев | |
| Leptospira | Почки, плацента | FA (мазок из почек плода), IHC, PCR | ПЦР мочи плода; фетальная и материнская |
| Ureaplasma | Легкое, содержимое сычуга, плацента | Посев на уреаплазмы, PCR | серология |
| Campylobacter | Легкое, содержимое сычуга, плацента | Посев на кампилобактер, IHC, темнопольная микроскопия | Окрашивание серебром гистологических тканей, ПЦР |
| Эпизоотический аборт крупного рогатого скота аборт | Тимус, селезенка, лимфатические узлы | Модифицированная окраска гистологических срезов серебром по Штейнеру, IHC | Повышенный уровень сывороточных иммуноглобулинов у плода |
| Chlamydophila | Плацента | PCR, IHC, FA | Красители Macchiavello's, Gimenez или модифиц-ные кислотостойкие красители для гистологич. срезов |
| Coxiella burnetii | Плацента | PCR, IHC | Красители Macchiavello's, Gimenez или модифиц-ные кислотостойкие красители для гистологич. срезов |
| Грибы | Плацента, содержимое сычуга, легкие, поражения кожи | Микологический посев, H&E | Прямая идентификация с помощью KOH влажных участков кожи или плаценты или GMS и PAS окрашивание гистологических срезов |
| Tritrichomonas | Плацента, содержимое сычуга, легкое | Посев на трихомоноз, окрашивание гистологических срезов серебряным красителем по Бодиану, IHC, H&E | Темнопольная микроскопия сычужного содержимого, ПЦР |
| Neospora | Мозг, легкие, почки, скелетные мышцы, печень, плацента | IHC, PCR | Серология плода (I FA, титр микроагглютинации, ELISA (твердофазный ИФА)) |
| Sarcocystis | Мозг, легкие, печень, почки, скелетные мышцы, плацента | IHC | Геномный зонд; анализ рибосомальной РНК |
ELISA - иммуноферментный анализ; FA -непрямой флуоресцентный тест; GMS - метенаминовое окрашивание серебром по методу Гомори; H & E - стандартные гистопатологические красители; IFA - непрямой флуоресцентный тест; IHC - иммуногистохимия (обычно ткани, фиксированные формалином); КОН - тест с гидроокисью калия; PАS - циклическое Шифф-кислотное окрашивание; PCR - полимеразная цепная реакция; RT-PCR - ПЦР с обратной транскрипцией; VI - выделение вируса. Источник:Njaa BL. «Диагностика абортов и гибели новорождённых животных» Киркбрайда (Kirkbride) , 4-е изд., 2012.
Специфические видимые изменения в концепте, относящийся к патологии
Мумификация
Мумификация - это редкое явление, которое зачастую не имеет определенной причины. Это процесс прогрессирующего обезвоживания и уплотнения достаточно зрелого мертвого плода в утробе матери. Чтобы это произошло, бактериальная инфекция (тканевые литические микроорганизмы) мертвого плода должна отсутствовать, в матке не должно быть воздуха (закрытая шейка матки) и должно присутствовать функциональное ЖТ. Длительность процесса, которая может занимать месяцы, зависит от размеров плода. Этот процесс обычно происходит во втором и третьем триместрах, когда кости плода достаточно развиты, чтобы противостоять резорбции. По мере абсорбции фетальных жидкостей ткани становятся плотными, сморщенными, красно-коричневыми и клейкими, без запаха. По мере атрофии плодных мембран и инволюции матки происходит кровоизлияние между тканями матки и плода, что приводит к образованию красного «гематического» липкого материала на тканях (рисунки 54.15 и 54.16). Этот гематический тип мумификации, очевидно, свойственен крс.11,27 Матка тесно обволакивает плод, уплотняя мумию.
Чем дольше это продолжается, тем суше и плотнее становится плод, который может оставаться в утробе до 2 лет. У крс мумификация наиболее распространена в конце первого и начале второго триместров.46 Различные инфекционные и неинфекционные причины вовлечены в их возникновение (BVDV, трихомониаз), но обычно причина неизвестна.10,16 Мумификация может быть связана с определенными породами (Гернси, Джерси) или определенными племенными/генетическими комбинациями.11 В случаях неосложненной мумификации в плане фертильности прогноз благоприятный.27
Мацерация
Мацерацией называют эффект размягчения мертвой ткани плода из-за впитывания жидкости и сапрофитного переваривания в утробе матери (рис. 54.17). У крупного рогатого скота это связано с воздействием бактерий на ткани плода. Это происходит, когда после смерти плод не изгоняется, а частично или полностью сохраняется в матке. Бактериями могут быть те, которые вызвали гибель плода, или те, что попадают через открытую шейку матки.10 Мацерация отличается от аутолиза, который заключается в переваривании тканей эндогенными ферментами и не требует присутствия бактерий. Когда бактерии получают доступ к мертвому плоду в репродуктивном тракте, они начинают быстро размножаться при температуре тела и в относительной изоляции от иммунной системы коровы. В результате происходит бактериальное переваривание тканей с образованием газов (эмфизема). Матка окружает плод и наблюдается интенсивный метрит.
В начале беременности мацерированные эмбрионы резорбируются или удаляются с незначительными выделениями. После первого триместра скелет плода достаточно сформирован, чтобы противостоять распаду, и фрагменты скелета могут быть сохранены. Фрагменты костей могут врезаться в матку или перфорировать ее стенку и свободно плавать в брюшной полости.46 При регрессии ЖТ и раскрытии шейки матки их можно обнаружить пальпаторно. У коров могут быть размытые признаки болезни из-за хронической и тяжелой инфекции матки. Эмфизема обычно возникает, когда неполный аборт или кратковременная дистоция позволяют гнилостной вагинальной флоре проникать в мертвый плод. Неполный аборт возникает при частичном раскрытии шейки матки и недостаточном изгнании плода, который частично или полностью сохраняется в матке.16
