Воспроизводство крупного рогатого скота

Для культивирования образец инкубируют до 6 дней приблизительно при 36°С. Образец ежедневно проверяют под световым микроскопом на наличие T. foetus.⁵ Определение T. fetus в культуре основано на морфологических и двигательных характеристиках организма.¹ Чувствительность теста может быть определена как доля фактически положительных животных, которые диагностированы правильно. Специфичность теста может быть определена как доля фактически отрицательных животных, которые диагностированы правильно. На чувствительность и специфичность культивирования и ПЦР при T. fetus могут оказывать влияние факторы, возникающие на каждом уровне процесса тестирования, включая сбор образцов, их обработку и доставку, а также лабораторные процедуры и тип ПЦР-теста, используемого в лаборатории.¹⁰ Сообщается, что чувствительность для отдельной культуры варьирует от 84 до 96% в экспериментальных условиях, но может быть снижена до 65% в субоптимальных полевых условиях.⁷ Специфичность культуры может ухудшаться из-за присутствия морфологически сходных трихомонад.^1,3,5–7,10 ПЦР позволяет обнаруживать малые количества генетического материала организма-мишени путем амплификации специфических фрагментов ДНК, уникальных для микроорганизма.10 ПЦР может также использоваться для подтверждения идентичности микроорганизмов после культивирования, чтобы избежать ложноположительных результатов из-за морфологически сходных трихомонад.1,3,4,7,10,11 Поскольку с помощью ПЦР можно обнаруживать меньшее количество T. fetus, чем при культивировании, образцы могут обрабатываться иначе, чем для культивирования.^10,11 Эти варианты включают, но не ограничиваются, немедленное тестирование образца из культуральной среды с помощью ПЦР, инкубацию в течение 1-2 дней в культуральной среде с последующей ПЦР, инкубацию в течение 1-2 дней в культуральной среде и затем замораживание образца перед отправкой, и свежий образец для ПЦР-тестирования без использования какого-либо типа питательной среды.^5,7,10,12 Поскольку чувствительность и специфичность этих разных методов варьируют, перед отправкой следует проконсультироваться с принимающей лабораторией, чтобы выполнить конкретные требования этой лаборатории. Показано, что чувствительность и специфичность однократного теста ПЦР выше, чем однократного посева, хотя оба параметра могут быть улучшены с помощью серийного тестирования, а также комбинирования тестов ПЦР и культивирования на одном образце.5

Сравнение различных схем тестирования с использованием различных комбинаций ПЦР и культивирования, а также различных полевых условий и способов обработки образцов показывает, что достигнут широкий диапазон чувствительности и специфичности.^3,5,7,12

Как и в большинстве схем тестирования, повышение чувствительности может оказать негативное влияние на специфичность. Хотя все типы ПЦР-тестов обладают специфичностью, превышающей 90%, ветеринары и производители должны знать, что могут иметь место ложные срабатывания, хотя было показано, что эта вероятность уменьшается при серийном и/или комбинированном тестировании.^5,7 Из-за вероятности ложных срабатываний ветеринарному, лабораторному и управляющему персоналу следует проявлять осмотрительность в отношении животных с положительным тестом, особенно до тех пор, пока результаты теста не будут подтверждены.

Об обнаружении Трихомониаз сообщается государственным органам по контролю за здоровьем животных, и в нескольких штатах у прежде крывших быков должны быть отобраны препуциальные образцы, протестированные либо однократно ПЦР, либо трехкратным еженедельным культивированием. Эти правила часто меняются и отличаются между штатами. Данные полевых исследований, в которых использовались общие методы тестирования, а также экспериментальные эпидемиологические модели, не подтверждают практику приравнивания одного теста ПЦР к трехкратному еженедельному культивированию препуциальных проб.^5,7 Cobo с соавт.⁷ показали чувствительность однократного посева на уровне 67,8%, а чувствительность однократного анализа ПЦР - 65,9%. Объединение обоих тестов на одном образце увеличило чувствительность до 78,3%, что эквивалентно двум тестам ПЦР, взятым с интервалом в 1 неделю. Ondrak и соавт.⁵ сообщили, что ПЦР в реальном времени была менее чувствительной и специфичной, чем гель-ПЦР (gPCR) при сравнении их результатов с образцами, взятыми у быков, которые были либо положительными, либо отрицательными при трехкратном культивировании с интервалом в 1 неделю. Монтилья и др.¹² продемонстрировали отличную чувствительность при использовании одного gPCR, когда образцы инкубировали в течение 24 часов, а затем замораживали для отправки. Неопубликованные экспериментальные эпидемиологические данные, сформулированные с помощью моделей, разработанных Сандерсоном, показывают значительное снижение чувствительности и специфичности при сравнении однократного анализа ПЦР с трехкратным еженедельным культивированием (из личного сообщения М. Сандерсона). Из-за сложностей, связанных с цитируемыми исследованиями, схемы тестирования должны быть адаптированы к распространенности трихомониаза в стаде и прилегающих районах, возрасту и анамнезу тестируемого быка, индивидуальным государственным нормативам и используемой лаборатории.

Производители должны быть осведомлены об ограничениях этих протоколов и о том, как можно улучшить чувствительность и специфичность, используя более интенсивные протоколы, чем те, что установлены правилами.^5,7 Поскольку нет протокола исследований, подходящего для всех ситуаций, эти протоколы должны основываться на соответствующем риске, с повышением уровня тестирования в областях с более высокой частотой трихомониаза, а также на отдельных быках в группе высокого риска, таких как более старые быки, о которых известно, что они спаривались ранее.^8,11 Практика 6-кратного еженедельного культивирования исторически считалась золотым стандартом в индустрии искусственного осеменения.⁷ Должно применяться любое количество еженедельных посевов, ПЦР-анализов или их комбинаций, чтобы убедиться в отсутствии уровня риска тестируемого быка, независимо от минимальных требований к тестированию для соответствия государственным нормам.

Правильный отбор проб у быка ветеринаром требует обучения, внимания к деталям и базовых знаний о патогене и его поведении в транспортных / культуральных средах.

Материалы, необходимые для взятия проб, включают в себя инфузионную пипетку, шприц на 12 мл, маркерную ручку, емкость для хранения трих-пакетиков в вертикальном положении после инокуляции (прививки, помещения в них зараженного образца) , ножницы, дезинфицирующее средство, бумажные полотенца, перчатки для осмотра, шприц на 60 мл, физиологический раствор, InPouch™, вторичные транспортные контейнеры и изолированный транспортный бокс^5,7,13 (рис. 56.2).

Быки должны быть освобождены от случки за 1 неделю до тестирования. Сбор образцов начинается с подготовки необходимых материалов и удержания быка таким образом, чтобы образец был взят правильно и безопасно. Задняя нога, ближайшая к ветврачу, при необходимости может быть привязана для безопасности. Ветеринар надевает чистую пару латексных перчаток, чтобы уменьшить вероятность перекрестного заражения между быками. Волосы возле препуциального отверстия подстригают, а само отверстие высушивают бумажным полотенцем. Крайняя плоть теперь может быть промыта небольшим количеством физиологического раствора у быков, у которых она чрезмерно грязная или сухая. Инфузионную пипетку прикрепляют к стерильному шприцу объемом 12 мл. Пипетку желательно защитить пластиковым чехлом. Затем пипетку продвигают в канал препуциального мешка приблизительно до уровня свода, и крайняя часть достаточно агрессивно соскребается с одновременным приложением отрицательного давления в присоединенном шприце (Рисунок 56.3). Соскоб должен быть достаточно агрессивным, чтобы захватить не менее 1,5–2 см смегмы внутрь пипетки, но не настолько агрессивным, чтобы образец был загрязнен кровью. Затем образец инокулируется в правильно идентифицированный InPouch™ (автономное устройство со средой для выделения и обнаружения патогена) .

Пипетку помещают в среду в верхней камере InPouch™, аспирируя и удаляя жидкость несколько раз, чтобы эффективно смыть образец из пипетки в среду. Пакет затем складывают несколько раз в соответствии с рекомендациями производителя для экспрессии жидкости и образца из верхнего в нижний отсек пакета. Затем пакет закрывают проволочными стяжками и помещают в вертикальное положение. Теперь он должен быть защищен от прямых солнечных лучей и храниться при температуре от 20 до 37°C до тех пор, пока он не попадет в лабораторию с собственноручной доставкой или посредством службы ночной доставки. Поскольку требования к перевозке могут варьироваться в разных лабораториях, необходимо проконсультироваться с лабораториейполучателем до начала тестирования.^4,5,7,10,13

Для доставки пакеты должны быть помещены во вторичный транспортный контейнер, который трудно помять, а он помещен в изолированный бокс (коробку) , который должным образом маркирован для биологических продуктов, подлежащих отправке в течение ночи.^7,13 Эти образцы должны быть отправлены в ветеринарную диагностическую лабораторию, которая придерживается руководящих принципов, соответствующих или превышающих те, которые установлены Американской ассоциацией ветеринарных лабораторных диагностов. Эти лаборатории нацелены использовать лучшие доступные методы тестирования и по мере необходимости обращаются к услугам сторонних лабораторий для подтверждения результатов. Недавно появились новые устройства для отбора проб у быков. Устройство, известное как бычий рашпиль или Tricamper™, продаваемый в Австралии, и устройство, известное как Trichit™, которое продается в Соединенных Штатах, вводятся в препуциальную полость, как и пипетка, и используются для соскоба тканей. Эти устройства затем промывают в питательную среду для извлечения образца. Эти устройства могут обеспечить лучший отбор проб с меньшим загрязнением кровью. Сбор образцов слизи из влагалища у самок для культивирования или ПЦР также можно осуществить с помощью пипетки или любого из этих устройств¹⁴ (рис. 56.4).

Поскольку надлежащие методы отбора проб и их обработки непосредственно связаны с лабильной природой патогена, Общество териогенологии рекомендует ветеринарам пройти подготовку перед предоставлением образцов T. fetus.¹⁵ В некоторых штатах требуют или рассматривают возможность обучения и сертификации ветеринаров по взятию образцов T. fetus, прежде чем лаборатории примут от них образцы.

В стадах, о которых известно, что они заражены T. fetus, следует использовать серийное тестирование в сочетании с изменениями в управлении для создания стада без заболевания.⁵ Поскольку нет никакого законного или эффективного лечения для быков, зараженных T. fetus, эти быки должны быть отправлены на убой.^1,5 Расположение зараженных животных должно быть согласовано с руководителями. Не существует законного или эффективного лечения инфицированных коров, но поскольку самки обычно сами устраняют инфекцию, можно рассмотреть иные варианты, кроме убоя.^1,3,6 Положительные коровы могут содержаться в отдельном стаде и осеменяться ИО. В стадах с известными положительными случаями, нестельные положительные коровы должны быть выбракованы, абортированные плоды должны быть проверены на наличие T. fetus, а вакцинация может быть использована для ограничения воздействия заболевания.^1,16

Заключение

В 1947 году д-р Дейв Бартлетт суммировал практические меры борьбы с трихомониазом при естественном осеменении крупного рогатого скота на два основных принципа: не допускать осеменения восприимчивых коров инфицированными быками и осеменения восприимчивыми быками инфицированных коров.¹⁷

Эти принципы составляют основу борьбы с трихомониазом сегодня и могут быть достигнуты благодаря вниманию к деталям, знаниям о болезни и здравому смыслу. Следует избегать смешивания животных из разных стад. Ограниченный случной сезон и своевременная диагностика стельности могут повысить вероятность более раннего выявления проблемы.

Старших быков следует заменить более молодыми, и проверять всех быков перед введением в стадо и перед каждым сезоном размножения. Выявленных при диагностике стельности холостых коров, следует отбраковать. Абортировавших коров или имеющих заметные выделения, следует отбраковывать, а абортированные плоды или любые выделения следует проверять на наличие T. fetus. Существует вакцина против T. fetus, и хотя эффективность вакцины исторически считалась ограниченной, было показано, что она уменьшает негативное влияние заболевания у самок. Недавняя работа Cobo и соавт.¹⁶ указывает на то, что вакцинация быков также может быть полезной. ИО с использованием спермы от быков с отрицательным анализом на трихомониаз, явно ограничивает распространение болезни, хотя техники ИО должны придерживаться жестких процедур профилактики заболеваний. Вакцинация от других репродуктивных заболеваний облегчит проблему трихомониаза в стаде с репродуктивной недостаточностью.

Как и в случае многих других проблем со здоровьем стада, командный подход, задействующий производителей, ветеринаров и руководящий персонал, является наилучшим способом разработки и реализации эпидемиологически обоснованных протоколов биобезопасности для предотвращения внедрения венерического трихомониаза. Надлежащее тестирование имеет первостепенное значение для предотвращения заражения, а также для оздоровления инфицированных стад. Точность тестирования напрямую связана с качеством образца, что, в свою очередь, напрямую связано с его надлежащим сбором, обработкой и доставкой.

Ссылки

1. BonDurant R. Венерические заболевания крупного рогатого скота: естественное течение, диагностика и роль вакцин в борьбе с ними. Vet Clin North Am Food Anim Pract 2005;21:383–408.

2. Edmondson M. Борьба с трихомонозом крупного рогатого скота у самок. Clin Theriogenol 2013;5:225–230.

3. Corbeil B, Campero M, Hoosear V, BonDurant H. Обнаружение трихомонад разных видов в половых путях быков, использовавшихся и не использовавшихся для разведения. Vet Parasitol 2008;154:226–232.

4. Peter D, Fales W, Miller R и др. Tritrichomonas foetus Инфекция в стаде крупного рогатого скота в штате Миссури. J Vet Diagn Invest 1995;7:278–280.

5. Ondrak J, Keen J, Rupp G, Kennedy J, McVey D, Baker W. Повторные исследования методом культивирования и ПЦР для выявления быков — носителей Tritrichomonas foetus в заражённом стаде штата Небраска. J Am Vet Med Assoc 2010;237:1068–1073.

6. Ho M, Conrad P, Conrad P, LeFebvre R, Perez E, BonDurant R. Выявление трихомоноза крупного рогатого скота с помощью специфического ДНК-зонда и системы ПЦР-амплификации. J Clin Microbiol 1994;32:98–104.

7. Cobo E, Favetto P, Lane V и др. Чувствительность и специфичность культурального исследования и ПЦР образцов смегмы быков, экспериментально заражённых Tritrichomonas foetus . Theriogenology 2007;68: 853–860.

8. Rae D, Crews J, Greiner E, Donovan G. Эпидемиология Tritrichomonas foetus в популяциях быков мясных пород во Флориде. Theriogenology 2004;61:605–618.

9. Strickland L, Wolfe D, Carson R и др. Поверхностная архитектоника эпителия полового члена и препуция быков. Clin Theriogenol 2011;3:362 (аннотация).

10. Mukhufhi N, Irons P, Michel A, Peta F. Оценка ПЦР-теста для диагностики Tritrichomonas foetus у быков: влияние способа отбора проб, условий хранения и транспортной среды на результаты теста. Theriogenology 2003;60:1269–1278.

11. BonDurant R, Campero C, Anderson M, Van Hoosear K. Выявление Tritrichomonas foetus методом полимеразной цепной реакции в культивированных изолятах, цервиковагинальной слизи и тканях заражённых тёлок и плодов, фиксированных формалином. J Vet Diagn Invest 2003;15:579–584.

12. Montilla H, Estill C, Villarroel A, Bounpheng M. Материалы конференции Американской ассоциации американских ветеринарных диагностов,