Воспроизводство крупного рогатого скота

Диагностика

Для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота можно использовать три метода: 1) серологический - обнаружение антител к бактериям; 2) бактериологический - выделение организма из тканей животных; и 3) молекулярно биологический с использованием молекулярных методов для выделения и идентификации бактериальной ДНК (ПЦР) . Серологический метод обычно используется для тестирования животных, потому что результаты могут быть получены за короткий период времени. Все серологические тесты основаны на связывании бычьих антител с антигенами бруцелл. Обычно страна будет следовать предлагаемым серологическим методам OIE (Всемирная организация по охране здоровья животных) или МСХ США.^44,45 Стандартные серологические тесты включают Роз-бенгал тест (РБТ) (реакция агглютинации, проводимая посредством смешивания на стекле сывороток с суспензией окрашенных клеток B. abortus) , тест молочного кольца ( антиген Brucella, окрашенный гематоксилином, добавляют к молоку - любые агглютинины в молоке, которые переносятся молочным жиром, когда он поднимается на поверхность, реагируют с антигеном) , Кард-тест (тест на агглютинацию для выявления антител к B. abortus) , риваноловый тест, метод стандартных пробирок (STT), буферный подкисленный планшетный тест на антиген и тест фиксации комплемента. Основные тесты на связывание включают иммуноферментный анализ концентрации частиц (PCFIA), непрямой и прямой конкурентный иммуноферментный анализ (ELISA) и поляризационный флуоресцентный анализ (FPA). Современные надзорные меры в США включают тест молочного кольца для проверки молочных заводов и серологическое тестирование крупного рогатого скота. В идеале, для постановки окончательного диагноза можно использовать серологию в сочетании с культивированием бруцелл или молекулярным типированием.^46,47 Идентификация серологически положительного животного запускает принятый регуляторный процесс, который может включать тестирование и убой, карантин, вакцинацию и корректировку управления стадом. При обнаружении заболевания у человека проводят соответствующую антибиотикотерапию после выяснения вида бактерий. Эпидемиологический надзор обычно требует видовой состав, поэтому можно использовать все три методологии.

Иммунная реакция

Иммунный ответ хозяина на типичный вирулентный штамм B. abortus включает как клеточные, так и гуморальные реакции. Гуморальный аспект включает выработку антител, которые нацелены на поверхностные компоненты внешней мембраны клетки. Было показано, что комплемент неэффективен в борьбе с B. abortus напрямую, но может помочь при фагоцитозе.⁴⁸ Основным иммуногенным элементом гладкой наружной мембраны является OPS-часть (О-боковые связи (перосамин) липополисахарида (LPS) на поверхности бактериальной клетки) LPS. Антительный ответ хозяина на OPS недостаточен для обеспечения защиты от инфекции. Эффективность шероховатого вакцинного штамма RB-51, в котором отсутствует OPS, также демонстрирует, что гуморальный ответ не имеет первостепенного значения. Антитела IgG-1, преимущественно продуцируемые в ответ на B. abortus, не коррелируют с элиминацией патогена.⁴⁹ Антитела могут способствовать внутриклеточному уничтожению посредством опсонизации и замедлять скорость размножения внутриклеточного B. abortus, но одни только антитела не могут защитить хозяина от бактерий.^48–50

С точки зрения вакцинации крупного рогатого скота, должен быть вызван клеточный иммунный ответ для защитного иммунитета. Клеточноопосредованная иммунная реакция хозяина на B. abortus в основном достигается активацией Т-клетками адаптивного иммунного ответа. Функция клеточного иммунитета заключается в поиске и уничтожении клеток-хозяев, содержащих внутриклеточные патогены, такие как вирусы и факультативные или облигатные внутриклеточные бактерии.⁵¹

Макрофаг в первую очередь ответственен за проглатывание и выведение бруцелл из внеклеточной среды. Презентация антигена как CD4, так и CD8 Т-клеткам является важным шагом в формировании протективного иммунитета хозяина. Макрофаги, которые не активировались до проглатывания B. abortus, отличаются по ответной реакции на антиген по сравнению с ранее активированными макрофагами, которые значительно более эффективны в уничтожении бруцелл.^52,53 Brucella abortus, проглатываемые инактивированными макрофагами, могут ингибировать развитие фаголизосом или нейтрализовать кислую среду, что позволяет им избежать гибели и размножаться в клетке относительно незатронутыми.⁵² D этих неактивированных фагоцитах бруцеллы заставляют макрофаги подавлять их реакцию на сильный CD4 + Th1 имунный ответ. Активированные макрофаги разрушают B. abortus при проглатывании и фаголизосомном слиянии, поле чего бактерии могут быть распознаны и представлены корецеторам CD4+ Th1-клеток главного комплекса гистосовместимости класса II. Эффекторная CD4+ Th1-клетки секретирует интерферон (IFN)-γ, который дополнительно активирует макрофаги, вызывая увеличение противомикробной активности против патогена. Brucella abortus вызывает сильный CD8+ Т-клеточный ответ, который опосредует цитотоксическую активность для лизиса инфицированных клеток. Если макрофаг, содержащий реплицирующийся B. abortus, лизируется, бактерии высвобождаются во внеклеточную среду, где они могут либо заражать другие клетки, либо подвергаться воздействию иммунной системы, а также проглатываться и уничтожаться активированными макрофагами.^{27,53,55–57}

Вакцина

Разработка эффективных вакцин против бруцеллеза находится на передовой профилактики этого заболевания. Было проведено множество экспериментов с использованием инактивированных и живых культур возможных кандидатов на вакцину. Инактивированные кандидаты на вакцины обычно дают плохой иммунитет, в то время как живые вакцины вирулентных штаммов обычно обеспечивают хорошую защиту против абортов, но часто приводят к высвобождению патогенных микроорганизмов и возможному заражению восприимчивых животных инфекцией.⁵⁸ Вакцины против бруцеллы должны характеризоваться ослабленностью патогена, способностью индуцировать защитный клеточный иммунный ответ и стабильностью при многократных пассажах in vivo.^58–60 Идеальные качества кандидата на вакцину включают: 1) большую продолжительность защиты; 2) минимальное вмешательство в диагностические тесты; 3) простоту производства и хранения с повышенной стабильностью; и 4) минимальное неблагоприятное воздействие на вакцинированных животных без опасности для человека в случае воздействия.^59,61 Ни одна программа вакцинации не дает 100% эффекта, а вакцины против бруцеллеза не предотвращают заражение. Цель вакцинации против бруцеллеза - повысить иммунитет стада и предотвратить аборты и распространение возбудителя. Программы контроля многогранны и включают вакцинацию, надзор и управление стадом. Вакцинация против бруцеллеза крупного рогатого скота является мощным инструментом, используемым в программе ликвидации бруцеллеза в Соединенных Штатах. Первой вакциной против бруцеллеза, одобренной федеральным правительством, был штамм-19 (S19) гладкой формы B. abortus, который был внедрен в 1941 году.⁵⁸ После многих лет успешного использования конфликты с S19 возникли из-за его вмешательства в диагностические тесты, и в 1996 году Министерство сельского хозяйства США утвердило новую вакцину с шероховатой формой B. abortus RB51 (RB51) вместо S19 в качестве официальной вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота.⁶²

Хотя RB51 решил проблемы, связанные с влиянием S19 на результаты диагностических тестов, некоторые считают, что RB51 может обеспечить менее эффективную иммунизацию, чем S19.⁶³ Иммуногенными различиями между S19 и RB51 являются в основном их вариабельность в структуре, функции и выживаемости в организме хозяина.

Три основные вакцины, используемые для предотвращения бруцеллеза у крупного рогатого скота, а также у коз и овец, включают штамм B. abortus 19, штамм B. abortus RB51 и штамм B. melitensis Rev. 1.⁶⁴ В США нет эффективных коммерческих вакцин для свиней или людей.

B. abortus штамм 19

Штамм 19 был первоначальной вакциной, используемой в программах борьбы с бруцеллезом крупного рогатого скота в Соединенных Штатах. После того, как он стал официальным кандидатом на применение в вакцинах в США, он впоследствии использовался во всем мире. Штамм 19 является наиболее широко используемой вакциной для профилактики бычьего бруцеллеза.^58,59,65 Он произошел от вирулентного изолята B. abortus, который был серийно пассирован (многократный пересев в новую пит.среду или животное) и хранился при комнатной температуре в течение нескольких месяцев и, повидимому, ослаблялся при репликации.⁶⁶ Сообщается, что иммунитет у беременных телок, вызванный S19, на 70–90% защищает их от аборта и/ или инфекции.^66–68 Вакцина S19 была и остается эффективным средством борьбы с бруцеллезом; однако, она имеет свои преимущества и недостатки. Это живая вакцина, которая стимулирует как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ у вакцинированных животных, чтобы защитить их от вирулентных видов бруцелл в течение длительного периода времени (лет), а детектируемые антитела обычно исчезают через несколько месяцев. Некоторые недостатки включают аборт при применении вакцины на позднем сроке беременности, орхит, гипертермию, анорексию, хронические низкие титры и изредка персистентную инфекцию вымени.⁵⁸ Иммунологический ответ хозяина на S19 аналогичен таковому на воздействие инфекционного (полевого) штамма B. abortus, но не приводит к клинической инфекции.⁵⁸ Как и гладкий штамм B. abortus, S19 экспрессирует полностью интактный и функциональный LPS с OPS на поверхности наружной мембраны. Он способен индуцировать OPS-специфические антитела у хозяина, поскольку он стимулирует как клеточный, так и гуморальный иммунитет. Однако, этот аспект S19 может быть проблематичным, поскольку стандартные диагностические тесты выявляют присутствие анти-OPS-иммуноглобулинов, и по ним нельзя отличить вакцинированное животное от полевого штамма. Обычно вакцинированное животное сохраняет устойчивость к болезням в течение длительного периода времени (около года), но серологически детектируемые антитела исчезают через несколько месяцев. Некоторые животные могут стать персистентно инфицированными S19 после вакцинации, продолжая вырабатывать антитела против OPS в течение многих лет после обработки.⁶⁹ У таких хронических носителей диагностические тесты покажут ложноположительные результаты хотя эти вакцинированные животные не заражены полевым штаммом. Из-за этой проблемы исследователи искали вакцину, которая не мешала бы программе ликвидации бруцеллеза, и в 1996 году была получена лицензия на новую вакцину RB51.⁶² RB51 - шероховатый штамм B. abortus 2308, лишен OPS, обнаруженного в вирулентных штаммах и в вакцине S19, поэтому проблема с диагностическими тестами была решена. RB51 не способствует выработке антител против OPS, но эффективен в обеспечении адекватной защиты от инфекций, вызывающих заражение.⁷⁰

B. abortus RB51

Нынешняя вакцина в США, используемая для защиты от бруцеллеза крупного рогатого скота, представляет собой B. abortus RB51, и была разработана путем серийных пассажей гладкого штамма B. abortus на рифампицине и чашках с триптическим соевым агаром с добавлением пенициллина.⁷¹ Полученный шероховатый штамм был устойчив к рифампицину и не имел OPS родительского штамма из-за изменения локусов биосинтеза LPS.^64,72 Несмотря на некоторые опасения относительно выпуска антибиотикоустойчивого штамма B. abortus, Соединенные Штаты в 1996 году утвердили RB51 в качестве предпочтительной вакцины для программы ликвидации вместо S19.^62,70 RB51 не стимулирует выработку гладких форм антител против OPS, которые могут мешать серологическому тестированию, поэтому вакцинированные животные не реагируют на стандартные диагностические тесты на бруцеллез. Эта вакцина с шероховатым ослабленным штаммом и она не переходит обратно к гладкому фенотипу после введения. RB51 столь же эффективен, как и S19, но менее абортогенный и не вызывает симптомов заболевания после вакцинации.^70,73 Введение вакцины стимулирует клеточно-опосредованный ответ, необходимый для защиты животного от полевой инфекции.⁷⁰ Исследования показали, что защита, обеспечиваемая RB51, аналогична S19, и на 70–90% эффективна в плане предотвращения абортов и заболевания.^62,74,75

RB51 остается современной вакциной против бруцеллеза крупного рогатого скота и продолжает оставаться важным компонентом регуляторных программ мониторинга бруцеллеза. Домашние телки получают RB51 в возрасте 4–12 месяцев в дозе 1,0–3,4 × 1010 КОЕ и помечаются как вакцинированные.^62,70 После иммунизации RB51 обычно не обнаруживается в кровотоке через 3 дня после вакцинации, быстро выводится из дренирующих лимфатических узлов и не может быть выделен у животного уже через 6–8 недель.^62,76,77 Шероховатый вакцинный штамм RB51 обеспечивает защиту от бруцеллеза крупного рогатого скота без нежелательных побочных эффектов, связанных с S19.

B. melitensis Rev. 1

Вакцина Rev. 1 была разработана Элбергом и Герцбергом в 1957 г. как живая вакцина против B. melitensis коз и овец.⁶⁶ Rev.1 представляет собой гладкую бактерию с полным LPS, которая индуцирует реакции антител, аналогичные тем, которые вызываются полевыми штаммами, и не может быть легко дифференцирована при обычном серологическом исследовании. Вакцина вирулентна для людей и устойчива к стрептомицину, что затрудняет профилактическое лечение.^64,77 Подкожная вакцинация Rev.1 рекомендуется для коз и овец в возрасте от 4 до 6 месяцев. Вакцина вызывает мощный и длительный серологический ответ, который часто создает помехи диагностическим тестам.⁷⁸ При введении во время беременности вакцина может вызывать аборты у овец и коз. В эндемичных районах с широко распространенной инфекцией или вероятностью повторного заражения рекомендуется, чтобы взрослые животные получали уменьшенные дозы вакцины.⁷⁹ Rev.1 представляет собой эффективную вакцину для борьбы с бруцеллезом у мелких жвачных животных, но, несмотря на тестирование на крупном рогатом скоте, она обычно не используется против бычьих заболеваний.

Лечение и профилактика заболевания у человека

Бруцеллез человека (волнообразная лихорадка) проявляется как фебрильная болезнь, которая имеет ряд клинических симптомов.²² Лица, инфицированные микробами, могут страдать от циклической лихорадки, недомогания и головных болей, а также болей в суставах и спине. Как правило, острая фаза заболевания вызывает гриппоподобные симптомы, тогда как хроническая фаза проявляется в виде деформирующего артрита или, в редких случаях, менингита, эндокардита и психоневроза.^80–82 Хотя это заболевание, как правило, не смертельное, нелеченные человеческие инфекции могут привести к смертельному исходу.^82,83 Человеческий бруцеллез диагностируется путем анализа полной истории болезни, физического обследования, серологического обследования и культивирования бактерий из крови, лимфы или спинномозговой жидкости.⁶⁵

Как правило, люди заражаются одним из трех способов: прием зараженных продуктов животного происхождения; вдыхание бруцеллезных организмов через полости носа, рта и глотки; или попадание бактерий в организм через открытые кожные раны.⁸⁴ Наиболее распространенным способом заражения является употребление в пищу или питье загрязненных молочных продуктов. Вдыхание бруцеллезных организмов не является распространенным путем заражения, но оно может представлять значительную опасность для людей определенных профессий, в том числе тех, кто работает в лабораториях, где выращивают этот микроорганизм, ветеринарным врачам, оказывающим помощь при родах или вводящим вакцины против бруцеллеза, и работникам скотобойни. Загрязнение кожных ран может быть проблемой для упомянутых выше категорий; охотники могут также заразиться при контакте с бактериями на тушах зараженных бизонов, лосей или диких свиней.

Пациентов, инфицированных бруцеллезом, обычно лечат комбинацией антибиотиков, таких как рифампицин и доксициклин или стрептомицин и доксициклин.⁸⁵ Всемирная организация здравоохранения при остром бруцеллезе у взрослых рекомендует лечение 600–900 мг рифампицина и 200 мг доксициклина в день в течение как минимум 6 недель.⁸⁶ Из-за зоонозных аспектов этого инфекционного заболевания борьба с бруцеллезом у домашнего скота и диких видов животных имеет решающее значение для искоренения бруцеллеза человека.

При работе с животными, подозреваемыми на наличие бруцеллеза, следует принимать общие меры предосторожности. Для предотвращения профессиональной контаминации при родовспоможении, проведении вскрытия или разделке потенциально зараженных животных должны использоваться личная гигиена и защитная одежда или оборудование. В идеале перчатки следует носить всегда, чтобы избежать прямого контакта кожи с плодными или материнскими жидкостями/мембранами, а для предотвращения вдыхания инфекционных частиц следует использовать респиратор определенного типа. Охотники, ветеринары и работники скотобоен должны следовать этим правилам, и все открытые части тела должны быть вымыты с мылом и водой, чтобы минимизировать риск инфицирования. Ветеринары должны принимать дополнительные меры предосторожности при удалении пузырьков воздуха из шприцов перед инъекцией, поскольку это приводит к аэрозолизации живых вакцин, и следует избегать травм от укола иглой, поскольку вакцины могут вызывать инфекцию у людей. Молочные и сырные продукты всегда следует готовить из пастеризованного молока, так как организм чувствителен к нагреванию. Путешественники, планирующие посещение эндемичных районов должны знать о потенциальной инфекционной природе молочных продуктов. Большинство случаев бруцеллеза у человека (около 100 в год) в Соединенных Штатах происходит в Техасе и Калифорнии и, вероятно, связано с употреблением нелегально импортированных непастеризованных молочных продуктов. Во всем мире около 500 000 человек заражаются бруцеллезом ежегодно.⁸⁷

Соблюдение методик лабораторной работы при строгом соблюдении протоколов по биобезопасности и применении надлежащего оборудования для защиты персонала предотвратит большинство лабораторных инфекций. Потенциально зараженные ткани и бактериальные культуры следует обрабатывать в кабинете биобезопасности класса II, а процедуры, при которых образуются аэрозоли, должны быть сведены к минимуму. Диагностические лаборатории могут работать с рутинными клиническими образцами, используя оборудование и методы биобезопасности второго уровня. Центры по контролю за заболеваниями и Министерство сельского хозяйства США в качестве отдельных агентов рассматривают три вида бруцелл и требуют, чтобы лаборатории получили специальное разрешение на работу с этими бактериями.⁸⁸

Новые технологии и инструменты для исследования

Ученые используют геномы B. abortus, B. melitensis и B. suis для поиска новых факторов вирулентности и потенциальных кандидатов на вакцины. Молекулярные технологии помогли в идентификации видов и биоваров. Традиционно для видовой типизации изолятов бруцелл использовались серологические и микробиологические методы. Позднее результаты серотипирования стали подтверждать методом молекулярного генотипирования, который доступен в различных вариантах: ПЦР полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP) (способ исследования геномной ДНК путём разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путём гель-электрофореза (электрофореза ДНК, ПЦР) ;⁸⁹ анализ специфического для цитоплазматического белка генного зонда⁹⁰ , анализ множественных локусов с переменным числом тандемных повторов,^91,92 и типирование с геном rpoB, кодирующим β- субъединицу ДНК-зависимой РНК-полимеразы (RNAP).^93,94 Важным шагом в понимании молекулярных основ патогенеза является выявление генов, вызывающих заболевание. Возможности определения генов вирулентности у видов Brucella увеличиваются с описанием геномов вида. Для оценки потенциальных генов вирулентности и генов выживания используются различные методы.^95–101

Идеальная цель - разработать вакцины нового поколения, которые обеспечивают 100% иммунитет к бактериальным видам и их хозяевам. Эти вакцины не должны мешать серологическим тестам; они должны быть независимы от холодовой цепи (обеспечение оптимального температурного режима хранения и транспортировки вакцины на всех этапах пути ее следования от предприятия-изготовителя до вакцинируемого) ; они должны быть безопасны для всех животных, независимо от возраста или статуса беременности; и они не должны вызывать болезни у людей.

Ликвидация человеческой инфекции зависит от ликвидации болезней животных, что потребует совместных усилий правительственных учреждений, ветеринаров и фермеров во всем мире.

Ссылки

1. Capasso, L. Бактерии в сыре двухтысячелетней давности и связанные с ними эпизоонозы среди населения Древнего Рима. J Infect 2002;2:122–127.

2. Центр продовольственной безопасности и общественного здравоохранения, Университет штата Айова. Бруцеллёз у морских млекопитающих. Июль 2009. Доступно по адресу: www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/brucellosis_marine.pdf

3. Carvalho Neta A, Mol J, Xavier M, Paixao T, Lage A, Santos R. Патогенез бруцеллёза крупного рогатого скота. Vet J 2010;184:146–155.

4. Jiménez de Bagüés M, Ouahrani-Bettache S, Quintana J и др. Новый вид Brucella microti размножается в макрофагах и вызывает гибель мышей в экспериментальных моделях инфекции. J Infect Dis 2010;202:3–10.