Воспроизводство крупного рогатого скота

Из четырех нетелей, инфицированных в период между 29 и 41 днем стельности, у двоих наблюдался аборт и у двоих резорбция плода.¹⁶⁸ В то время как заражение в предимплантационной фазе (до 40-го дня беременности) приводит к массовым потерям стельности, плоды, которые выживают после инфицирования нецитопатическим BVDV от низкой до умеренной вирулентности на сроке примерно от 40 до 125 дней, становятся ПИ.^169,170 Персистентные инфекции могут возникать только с нецитопатическими штаммами BVDV, а экспериментальное заражение цитопатическими изолятами не приводило к рождению ПИ-телят.^170,171 Экспериментальная инокуляция серонегативного крупного рогатого скота нецитопатическим BVDV на 75-й день стельности приводит к персистирующей инфекции до 100% плодов, и этот гестационный возраст обычно используется для индуцирования персистирующей инфекции в научных исследованиях.^{164,166,172,173} Патофизиология персистирующей инфекции не совсем понятна, но это явление возникает у плодов до завершения развития иммунной системы, когда вирусные антигены распознаются как собственные антигены, что приводит к отрицательной селекции BVDV-специфических лимфоцитов.¹⁵⁰ Отрицательный отбор реагирующих CD4+ лимфоцитов высокоспецифичен, и замены одной аминокислоты в антигене BVDV может быть достаточно для стимуляции иммунных реакций в CD4+ лимфоцитах крупного рогатого скота.¹⁷⁴ Отсутствие иммунного ответа приводит к обширному распространению BVDV по тканям хозяина, и ПИ-скот выделяет BVDV со многочисленными секретами и экскретами, включая выделения из носа, мочу, сперму, молозиво, молоко и кал.¹⁷⁵

Инфицирование плода в период органогенеза (приблизительно 100– 150 дней беременности) может приводить к врожденным порокам развития, многие из которых связаны с аномальным развитием нервных тканей. Дефекты ЦНС включают гипоплазию мозжечка (рис. 60.2), гидранэнцефалию, гидроцефалию, порэнцефалию, микроэнцефалию, гипоплазию спинного мозга и различные изменения глаза, такие как катаракта, неврит зрительного нерва, дегенерация сетчатки и микрофтальмия.^150,176,177 Реже врожденная инфекция BVDV может вызывать гипомиелинизацию ЦНС, которую, по сообщениям, провоцируют оба вида BVDV.^178,179

В дополнение к аномалиям ЦНС врожденные инфекции BVDV могут приводить к брахигнатизму, остеопетрозу, аплазии тимуса, гипотрихозу, аномалиям волосяного покрова, легочной гипоплазии и задержке роста.^{150,175,176,180} Хотя аборты все еще возможны на более поздних сроках стельности, врожденные инфекции после завершения органогенеза и установления иммунокомпетентности приводят к эффективным иммунным реакциям и очищению от вируса. Такие телята рождаются с высокими титрами доколостральных сывороточных антител и обычно выглядят нормальными при рождении.¹⁵⁰ Тем не менее, одно исследование показало, что у телят, рожденных с преколостральными антителами против BVDV, чаще развивается тяжелое заболевание в течение первых месяцев жизни, что указывает на то, что поздние гестационные инфекции с BVDV могут быть не доброкачественными.¹⁸¹

Инфекции у персистентно зараженных животных (болезнь слизистой оболочки)

Хотя ПИ-телята могут дожить до репродуктивного возраста, многие рождаются слабыми, отстают в росте и умирают вскоре после рождения.¹¹² ПИ-крупный рогатый скот имеет на 50% больше риска выбыть из стада до первого года жизни, умереть или отправиться на убой из-за худосочности по сравнению с нормальными когортами, что может быть отчасти связано со слабым иммунным ответом и подверженностью оппортунистическим инфекциям.^188,183 Дополнительным риском для ПИ-крс является развитие фатальной болезни слизистой оболочки, которая развивается, когда животные, персистентно инфицированные нецитопатическим BVDV, становятся суперинфицированными цитопатическим штаммом. Тяжесть развивающихся клинических признаков зависит от гомологии между обоими штаммами, а само заболевание слизистой оболочки можно классифицировать как острое, хроническое или заболевание с отсроченным началом.¹⁸⁴

Острое заболевание слизистой оболочки возникает, когда суперинфицирующий цитопатический штамм находится в тесной антигенной гомологии со штаммом ПИ, что чаще всего является результатом мутаций, которые изменяют биотип штамма ПИ.¹⁸⁵ Из-за близкой гомологии обоих штаммов, острое заболевание слизистых (ОЗС) приводит к тому, что смертность достигает 100%.¹¹⁷ Поскольку ОЗС поражает только ПИ-крс, болезнь характеризуется низкой заболеваемостью, но очень высокой смертностью.¹¹⁷ Тем не менее, в группах коров с многочисленными ПИ-коровами, инфицированными аналогичными штаммами BVDV, были зарегистрированы вспышки ОЗС.¹⁸⁶ Клинические признаки включают лихорадку, анорексию, тахикардию, полипноэ, выделения из носа и профузную зловонную диарею со слизью, фибрином и кровью. Кроме того, на пищеварительном эпителии, коронарных артериях, препуции и вульве обычно присутствуют эрозии и язвы (рис. 60.3).¹¹⁷ Суперинфекции с гетерологичными цитопатическими штаммами могут привести к хроническим формам заболеваний слизистой оболочки, которые не являются смертельными, но приводят к хроническим клиническим признакам. Источником гетерологичных цитопатических штаммов обычно являются вакцинные штаммы в модифицированных живых вакцинах.¹⁸⁴ Клинические признаки включают анорексию, потерю веса, диарею, вздутие живота, хромоту и эрозивно-язвенные поражения на эпителиальных поверхностях.¹⁸⁴ Достаточная гетерология между штаммом ПИ и цитопатическим штаммом может вызвать иммунный ответ, который устраняет суперинфекцию, способствуя выздоровлению животного от заболевания слизистой оболочки, но не от персистентной инфекции.¹⁸⁴ В условиях эксперимента инкубационный период острого фатального заболевания слизистой оболочки составлял 7–14 дней.¹⁸⁷ Напротив, заболевание слизистой с отсроченным началом встречается у ПИкрупного рогатого скота спустя период от нескольких недель до месяцев после инокуляции цитопатическим штаммом.¹⁸⁸

Что касается хронического заболевания слизистой оболочки, то заболевание слизистой с отсроченным началом вызвано гетерологичным цитопатическим штаммом из внешнего источника, но клинические признаки заболевания проявляются после рекомбинации РНК между штаммом ПИ и гетерологичным цитопатическим штаммом. Эта РНК-рекомбинация и создает гомологичный цитопатический штамм, вызывающий фатальную болезнь слизистой оболочки.¹⁸⁹

Инфекции быков

Как персистентно, так и остро инфицированные быки выделяют BVDV со спермой, но продолжительность и уровень выделения гораздо больше у ПИ-Быков. У экспериментально инфицированных быков титры вируса в сперме колебались от 5 до 75 CCID50/мл, при этом изоляция вируса была одинаково эффективной из свежесобранной и разбавленной спермы.¹⁹⁰ В группе телок, экспериментально осемененных зараженной спермой от остро инфицированного быка, примерно 5% заболели системно.¹⁹¹ Хотя этот первоначальный уровень заражения был низким, этого было достаточно для дальнейшей передачи вируса восприимчивым телкам и поддержания BVDV в стаде.¹⁹¹ В полевых условиях ИО спермой от двух остро инфицированных быков привело к заболеванию 15,4% и 1,8% коров соответственно.¹⁹² Сперма от ПИ-быков может содержать большое количество BVDV (103–107 CCID50/мл).^193,194 Оплодотворение восприимчивых телок спермой ПИ-быков приводит к развитию у них персистентной инфекции.^193–195

Качество спермы у ПИ-быков на основании концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов колеблется от нормального до ненормального, с морфологическими аномалиями сперматозоидов и низкой концентрацией и подвижностью.¹⁹³ 196 Использование спермы ПИ-быков обычно негативно влияет на оплодотворяемость, что, вероятно, связано с сочетанием таких факторов, как низкокачественная сперма, плохая сохранность семени пораженных быков и влияние BVDV на репродуктивный тракт осемененных коров.^150,193,197

У остро инфицированных быков образование нейтрализующих антител приводит к вирусному клиренсу из большинства систем органов, однако, описаны хронические инфекции тканей семенников, несмотря на образование сывороточных антител.¹⁹⁸ Впервые этот феномен был описан у серопозитивного невиремического (есть антитела, но нет вируса в крови) быка, который постоянно выделял BVDV со спермой, что, как считается, является результатом острой инфекции BVDV до окончательного формирования функционального гемато-тестикулярного барьера.¹⁹⁹ Инсеминация серонегативных телок спермой быка, содержащей менее 2 × 103 CCID50/мл BVDV, привела к инфекции и сероконверсии.²⁰⁰ Также, экспериментально были получены локальные и пролонгированные инфекции семенников после интраназальной инокуляции и подкожной вакцинации перипубертатных быков BVDV.^201,202 Вирусная РНК была обнаружена в сперме спустя 2,75 лет после воздействия BVDV, а инфекционный BVDV изолировали из ткани семенника вплоть до 12,5 месяцев после воздействия BVDV.²⁰³ Внутривенное введение серонегативному теленку спермы от быка с пролонгированной тестикулярной инфекцией приводило к передаче ему инфекции.²⁰¹ Однако, этот результат не смогли повторить в других исследованиях, а искусственное или естественное осеменение не привело к передаче BVDV, что указывает на то, что хроническое присутствие BVDV в тканях семенников может иметь ограниченное эпидемиологическое значение в результате нейтрализации инфекционного вируса в эякуляте посредством гуморального иммунитета.^198,203

BVDV и полученные in vivo и in vitro эмбрионы

Потенциальное введение BVDV в системы получения эмбрионов in vivo и in vitro может происходить из трех источников: коров-доноров, коров-реципиентов и материалы животного происхождения, такие как эмбриональная бычья сыворотка, и для предотвращения передачи все три категории должны быть свободны от BVDV.²⁰⁴ Всемирная организация здоровья животных (OIE) заявляет, что «BVDV представляет собой особо серьезную опасность для эмбриотрансфера и изготовления биопрепаратов для других заболеваний из-за высокой частоты загрязнения партий фетальной телячьей сыворотки».²⁰⁵ Полученные in vivo эмбрионы могут подвергаться воздействию BVDV, если они были собраны у остро инфицированных или ПИ-коров, или если в средах для сбора эмбрионов, культивирования или криоконсервации использовались зараженные сыворотки.²⁰⁴ Однако, BVDV, по-видимому, представляет более серьезную угрозу в производстве эмбрионов, полученных in vitro, чем in vivo. Вирус может быть введен через полученные со скотобойни сыворотку или ооциты и соматические клетки, используемые в производстве эмбрионов in vitro. Следовательно, невыявленные инфекции нецитопатическими изолятами могут привести к амплификации (усилению) вируса в процессе созревания ооцитов in vitro, оплодотворения in vitro и культивирования эмбрионов in vitro.²⁰⁶ Кроме того, вирус легко прилипает к zona pellucida эмбрионов, полученных in vitro, что делает процедуры промывания эмбрионов и обработки трипсином даже менее эффективными, чем для эмбрионов, полученных in vivo.²⁰⁷

Производство эмбрионов с помощью переноса ядер соматических клеток представляет еще больший риск, чем эмбрионы, полученные in vivo или in vitro. Введение BVDV вместе с сывороткой, используемой для культивирования как цитопласт-донорских клеточных линий (ооциты с удаленным ядром) , так и полученных в результате эмбрионов, может происходить довольно легко. Культивируемые эмбрионы особенно уязвимы, потому что их zona pellucida была либо разрушена, либо удалена, чтобы облегчить процесс слияния клеток. Кроме того, кумулюсооцитные комплексы обычно отбираются на скотобойнях у доноров с неизвестным статусом BVDV, а клеточные линии часто имеют эмбриональное происхождение, создавая расширенные возможности для внедрения и амплификации BVDV по мере образования и развития зародышей.²⁰⁶ Таким образом, BVDV по-прежнему остается проблемой для эмбриональных технологий, и более подробное обсуждение этого вопроса включено в главу 80.

Диагностика, профилактика и контроль

Как и в случае с другими инфекционными патогенами, основными принципами борьбы с BVDV являются устранение резервуаров патогенов и предотвращение передачи инфекции от зараженных животных к восприимчивым. Любая программа борьбы с BVDV должна фокусироваться на трех основных принципах: 1) идентификация и уничтожение ПИ-животных, 2) повышение иммунитета посредством вакцинации и 3) усовершенствование мер биобезопасности для предотвращения воздействия вируса на восприимчивый крс.²⁰⁸ ПИкрупный рогатый скот считается наиболее распространенным источником BVDV и занимает центральное место в эпидемиологии вируса. В идеале, ПИ-животные выявляются до попадания в стадо, и всех вновь поступивших в стадо особей, включая племенных быков, следует проверять. В стадах, в которых применяется контролируемый случной сезон, все телята, ремонтные телки, нестельные коровы и племенные быки должны тестироваться одновременно до его начала. Если присутствуют стельные матки, они должны быть разделены, а их потомство должно быть проверено как можно скорее. Все новорожденные телята также должны быть проверены как можно скорее, чтобы предотвратить воздействие на восприимчивых животных. Поскольку ПИ-телята могут родиться от остро инфицированных или ПИ-коров, необходимо повторно протестировать матерей ПИ-телят. При попытке контроля BVDV на уровне стада диагностические тесты должны иметь высокую чувствительность для выявления животных с BVDV, использовать легко получаемые образцы и быть высокоспецифичными для статуса ПИ. Для этой цели хорошо подходят анализы ELISA или ИГХ с захватом антигена, использующие образцы биопсии кожи (насечки с уха). Несмотря на то, что существуют различные диагностические тесты для выявления инфекции BVDV, не из них применимы к каждому клиническому случаю. Нерациональное использование тестов затрудняет усилия по решению производственных проблем, вызванных BVDV.²⁰⁹ В принципе, все доступные диагностические анализы могут быть классифицированы на методы, которые культивируют BVDV в клетках ткани, обнаруживают антиген в диагностических образцах, амплифицируют РНК-геном BVDV или обнаруживают присутствие антител в сыворотке или молоке.²⁰⁹

Изоляция вируса

Изоляция BVDV из различных образцов, в том числе сыворотки крови, лейкоцитарной пленки (фракция крови, образующаяся при центрифугировании - слой над осадком эритроцитов, состоящий из лейкоцитов и тромбоцитов) , спермы, мазков из носа и образцов тканей, остается «золотым стандартом» диагностики.^201,209,210

Для диагностики BVDV у живых животных предпочтительными образцами для изоляции вируса являются белые кровяные клетки, поскольку на них не влияют нейтрализующие сывороточные антитела, и вирус тесно связан с клетками. Ткани лимфоидной системы, включая селезенку, тимус и лимфатические узлы, являются предпочтительными образцами для посмертных исследований или исследования абортированных плодов.²⁰⁹ BVDV легко культивируется на различных клеточных линиях, включая линии других видов, и это может привести к трудностям при использовании зараженных BVDV клеточных культур.^211– 213 Об успешном культивировании цитопатических штаммов BVDV свидетельствует вакуолизация и гибель клеток в течение нескольких дней после инокуляции вируса. Для нецитопатических штаммов используют методы иммунофлуоресценции или окрашивания иммунопероксидазой для визуализации клеточной инфекции BVDV.^214,215 Изоляция вируса также может быть использована в качестве скринингового тестирования стада в форме иммунопероксидазного монослойного анализа (ИПМА).²¹⁶ Несмотря на экономичность, этот тест в качестве диагностического образца использует сыворотку и не идеален в плане выявления острых инфекций или тестирования телят в возрасте до 3 месяцев, которые имеют приобретенный колостральный иммунитет. Сообщалось о невозможности обнаружения ПИ-животных с помощью ИПМА, хотя частота ошибочного выявления крайне низкая.²¹⁷

Обнаружение антигена

Прямая детекция антигена BVDV позволяет проводить более быстрое и экономичное тестирование образцов по сравнению с изоляцией вируса. Обнаружение антигена может быть выполнено методами иммунофлюоресценции, ИГХ и ELISA. В целом, аналитическая чувствительность и специфичность анализов на детекцию антигена меньше, чем анализов на изоляцию вируса, что позволяет лучше обнаруживать ПИ-коров, а не острые инфекции. В отличие от традиционной лабораторной идентификации ПИ-крупного рогатого скота с использованием двух положительных вирусных изоляций, выполненных с интервалом в 3 недели, коммерчески доступные тестнаборы ELISA и ИГХ используются для идентификации ПИ-крупного рогатого скота один образец.²¹⁸ Несколько исследований продемонстрировали отличные результаты ELISA с захватом антигена и ИГХ при использовании в качестве скрининговых тестов для ПИкрупного рогатого скота.^219–222 Ложноположительные результаты, вызванные острыми инфекциями, редки, и тесты ELISA с захватом антигена и ИГХ можно использовать для тестирования ПИ-телят до ослабления колострального иммунитета, который создает помехи другим тестам.^209.223 Детекция антигена чаще всего выполняется по биопсии уха, но для этой цели после соответствующей обработки подходят разные образцы, включая ткани, цельную кровь, сыворотку, молоко и назальные мазки.²⁰⁹ В дополнение к лабораторным тестам ELISA был разработан chute-side тест ELISA для индивидуального образца, который можно использовать на биоптатах уха или образцах сыворотки от ПИ-животных за 20 минут.²²⁴

ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией)

Описание геномной последовательности BVDV и разработка подходящих зондов и коммерчески доступных тест-наборов позволили широко использовать ОТ-ПЦР в качестве рутинного метода диагностики.²²⁵ Методика очень чувствительна и может использоваться для различных диагностических образцов, включая молоко, мочу, ткани, сыворотку, цельную кровь, сперму и эмбрионы.^226–231 Хотя методы ОТ-ПЦР можно использовать для фиксированных в формалине диагностических образцов, происходит фрагментация РНК и чувствительность анализа снижается.²³²

Высокая чувствительность ОТ-ПЦР превосходит чувствительность изоляции вируса, и тест способен обнаружить вирусную РНК одного виремического образца в пуле из 100 отрицательных сывороток.²³³