Воспроизводство крупного рогатого скота

Что касается хронического заболевания слизистой оболочки, то заболевание слизистой с отсроченным началом вызвано гетерологичным цитопатическим штаммом из внешнего источника, но клинические признаки заболевания проявляются после рекомбинации РНК между штаммом ПИ и гетерологичным цитопатическим штаммом. Эта РНК-рекомбинация и создает гомологичный цитопатический штамм, вызывающий фатальную болезнь слизистой оболочки.¹⁸⁹

Инфекции быков

Как персистентно, так и остро инфицированные быки выделяют BVDV со спермой, но продолжительность и уровень выделения гораздо больше у ПИ-Быков. У экспериментально инфицированных быков титры вируса в сперме колебались от 5 до 75 CCID50/мл, при этом изоляция вируса была одинаково эффективной из свежесобранной и разбавленной спермы.¹⁹⁰ В группе телок, экспериментально осемененных зараженной спермой от остро инфицированного быка, примерно 5% заболели системно.¹⁹¹ Хотя этот первоначальный уровень заражения был низким, этого было достаточно для дальнейшей передачи вируса восприимчивым телкам и поддержания BVDV в стаде.¹⁹¹ В полевых условиях ИО спермой от двух остро инфицированных быков привело к заболеванию 15,4% и 1,8% коров соответственно.¹⁹² Сперма от ПИ-быков может содержать большое количество BVDV (103–107 CCID50/мл).^193,194 Оплодотворение восприимчивых телок спермой ПИ-быков приводит к развитию у них персистентной инфекции.^193–195

Качество спермы у ПИ-быков на основании концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов колеблется от нормального до ненормального, с морфологическими аномалиями сперматозоидов и низкой концентрацией и подвижностью.¹⁹³ 196 Использование спермы ПИ-быков обычно негативно влияет на оплодотворяемость, что, вероятно, связано с сочетанием таких факторов, как низкокачественная сперма, плохая сохранность семени пораженных быков и влияние BVDV на репродуктивный тракт осемененных коров.^150,193,197

У остро инфицированных быков образование нейтрализующих антител приводит к вирусному клиренсу из большинства систем органов, однако, описаны хронические инфекции тканей семенников, несмотря на образование сывороточных антител.¹⁹⁸ Впервые этот феномен был описан у серопозитивного невиремического (есть антитела, но нет вируса в крови) быка, который постоянно выделял BVDV со спермой, что, как считается, является результатом острой инфекции BVDV до окончательного формирования функционального гемато-тестикулярного барьера.¹⁹⁹ Инсеминация серонегативных телок спермой быка, содержащей менее 2 × 103 CCID50/мл BVDV, привела к инфекции и сероконверсии.²⁰⁰ Также, экспериментально были получены локальные и пролонгированные инфекции семенников после интраназальной инокуляции и подкожной вакцинации перипубертатных быков BVDV.^201,202 Вирусная РНК была обнаружена в сперме спустя 2,75 лет после воздействия BVDV, а инфекционный BVDV изолировали из ткани семенника вплоть до 12,5 месяцев после воздействия BVDV.²⁰³ Внутривенное введение серонегативному теленку спермы от быка с пролонгированной тестикулярной инфекцией приводило к передаче ему инфекции.²⁰¹ Однако, этот результат не смогли повторить в других исследованиях, а искусственное или естественное осеменение не привело к передаче BVDV, что указывает на то, что хроническое присутствие BVDV в тканях семенников может иметь ограниченное эпидемиологическое значение в результате нейтрализации инфекционного вируса в эякуляте посредством гуморального иммунитета.^198,203

BVDV и полученные in vivo и in vitro эмбрионы

Потенциальное введение BVDV в системы получения эмбрионов in vivo и in vitro может происходить из трех источников: коров-доноров, коров-реципиентов и материалы животного происхождения, такие как эмбриональная бычья сыворотка, и для предотвращения передачи все три категории должны быть свободны от BVDV.²⁰⁴ Всемирная организация здоровья животных (OIE) заявляет, что «BVDV представляет собой особо серьезную опасность для эмбриотрансфера и изготовления биопрепаратов для других заболеваний из-за высокой частоты загрязнения партий фетальной телячьей сыворотки».²⁰⁵ Полученные in vivo эмбрионы могут подвергаться воздействию BVDV, если они были собраны у остро инфицированных или ПИ-коров, или если в средах для сбора эмбрионов, культивирования или криоконсервации использовались зараженные сыворотки.²⁰⁴ Однако, BVDV, по-видимому, представляет более серьезную угрозу в производстве эмбрионов, полученных in vitro, чем in vivo. Вирус может быть введен через полученные со скотобойни сыворотку или ооциты и соматические клетки, используемые в производстве эмбрионов in vitro. Следовательно, невыявленные инфекции нецитопатическими изолятами могут привести к амплификации (усилению) вируса в процессе созревания ооцитов in vitro, оплодотворения in vitro и культивирования эмбрионов in vitro.²⁰⁶ Кроме того, вирус легко прилипает к zona pellucida эмбрионов, полученных in vitro, что делает процедуры промывания эмбрионов и обработки трипсином даже менее эффективными, чем для эмбрионов, полученных in vivo.²⁰⁷

Производство эмбрионов с помощью переноса ядер соматических клеток представляет еще больший риск, чем эмбрионы, полученные in vivo или in vitro. Введение BVDV вместе с сывороткой, используемой для культивирования как цитопласт-донорских клеточных линий (ооциты с удаленным ядром) , так и полученных в результате эмбрионов, может происходить довольно легко. Культивируемые эмбрионы особенно уязвимы, потому что их zona pellucida была либо разрушена, либо удалена, чтобы облегчить процесс слияния клеток. Кроме того, кумулюсооцитные комплексы обычно отбираются на скотобойнях у доноров с неизвестным статусом BVDV, а клеточные линии часто имеют эмбриональное происхождение, создавая расширенные возможности для внедрения и амплификации BVDV по мере образования и развития зародышей.²⁰⁶ Таким образом, BVDV по-прежнему остается проблемой для эмбриональных технологий, и более подробное обсуждение этого вопроса включено в главу 80.

Диагностика, профилактика и контроль

Как и в случае с другими инфекционными патогенами, основными принципами борьбы с BVDV являются устранение резервуаров патогенов и предотвращение передачи инфекции от зараженных животных к восприимчивым. Любая программа борьбы с BVDV должна фокусироваться на трех основных принципах: 1) идентификация и уничтожение ПИ-животных, 2) повышение иммунитета посредством вакцинации и 3) усовершенствование мер биобезопасности для предотвращения воздействия вируса на восприимчивый крс.²⁰⁸ ПИкрупный рогатый скот считается наиболее распространенным источником BVDV и занимает центральное место в эпидемиологии вируса. В идеале, ПИ-животные выявляются до попадания в стадо, и всех вновь поступивших в стадо особей, включая племенных быков, следует проверять. В стадах, в которых применяется контролируемый случной сезон, все телята, ремонтные телки, нестельные коровы и племенные быки должны тестироваться одновременно до его начала. Если присутствуют стельные матки, они должны быть разделены, а их потомство должно быть проверено как можно скорее. Все новорожденные телята также должны быть проверены как можно скорее, чтобы предотвратить воздействие на восприимчивых животных. Поскольку ПИ-телята могут родиться от остро инфицированных или ПИ-коров, необходимо повторно протестировать матерей ПИ-телят. При попытке контроля BVDV на уровне стада диагностические тесты должны иметь высокую чувствительность для выявления животных с BVDV, использовать легко получаемые образцы и быть высокоспецифичными для статуса ПИ. Для этой цели хорошо подходят анализы ELISA или ИГХ с захватом антигена, использующие образцы биопсии кожи (насечки с уха). Несмотря на то, что существуют различные диагностические тесты для выявления инфекции BVDV, не из них применимы к каждому клиническому случаю. Нерациональное использование тестов затрудняет усилия по решению производственных проблем, вызванных BVDV.²⁰⁹ В принципе, все доступные диагностические анализы могут быть классифицированы на методы, которые культивируют BVDV в клетках ткани, обнаруживают антиген в диагностических образцах, амплифицируют РНК-геном BVDV или обнаруживают присутствие антител в сыворотке или молоке.²⁰⁹

Изоляция вируса

Изоляция BVDV из различных образцов, в том числе сыворотки крови, лейкоцитарной пленки (фракция крови, образующаяся при центрифугировании - слой над осадком эритроцитов, состоящий из лейкоцитов и тромбоцитов) , спермы, мазков из носа и образцов тканей, остается «золотым стандартом» диагностики.^201,209,210

Для диагностики BVDV у живых животных предпочтительными образцами для изоляции вируса являются белые кровяные клетки, поскольку на них не влияют нейтрализующие сывороточные антитела, и вирус тесно связан с клетками. Ткани лимфоидной системы, включая селезенку, тимус и лимфатические узлы, являются предпочтительными образцами для посмертных исследований или исследования абортированных плодов.²⁰⁹ BVDV легко культивируется на различных клеточных линиях, включая линии других видов, и это может привести к трудностям при использовании зараженных BVDV клеточных культур.^211– 213 Об успешном культивировании цитопатических штаммов BVDV свидетельствует вакуолизация и гибель клеток в течение нескольких дней после инокуляции вируса. Для нецитопатических штаммов используют методы иммунофлуоресценции или окрашивания иммунопероксидазой для визуализации клеточной инфекции BVDV.^214,215 Изоляция вируса также может быть использована в качестве скринингового тестирования стада в форме иммунопероксидазного монослойного анализа (ИПМА).²¹⁶ Несмотря на экономичность, этот тест в качестве диагностического образца использует сыворотку и не идеален в плане выявления острых инфекций или тестирования телят в возрасте до 3 месяцев, которые имеют приобретенный колостральный иммунитет. Сообщалось о невозможности обнаружения ПИ-животных с помощью ИПМА, хотя частота ошибочного выявления крайне низкая.²¹⁷

Обнаружение антигена

Прямая детекция антигена BVDV позволяет проводить более быстрое и экономичное тестирование образцов по сравнению с изоляцией вируса. Обнаружение антигена может быть выполнено методами иммунофлюоресценции, ИГХ и ELISA. В целом, аналитическая чувствительность и специфичность анализов на детекцию антигена меньше, чем анализов на изоляцию вируса, что позволяет лучше обнаруживать ПИ-коров, а не острые инфекции. В отличие от традиционной лабораторной идентификации ПИ-крупного рогатого скота с использованием двух положительных вирусных изоляций, выполненных с интервалом в 3 недели, коммерчески доступные тестнаборы ELISA и ИГХ используются для идентификации ПИ-крупного рогатого скота один образец.²¹⁸ Несколько исследований продемонстрировали отличные результаты ELISA с захватом антигена и ИГХ при использовании в качестве скрининговых тестов для ПИкрупного рогатого скота.^219–222 Ложноположительные результаты, вызванные острыми инфекциями, редки, и тесты ELISA с захватом антигена и ИГХ можно использовать для тестирования ПИ-телят до ослабления колострального иммунитета, который создает помехи другим тестам.^209.223 Детекция антигена чаще всего выполняется по биопсии уха, но для этой цели после соответствующей обработки подходят разные образцы, включая ткани, цельную кровь, сыворотку, молоко и назальные мазки.²⁰⁹ В дополнение к лабораторным тестам ELISA был разработан chute-side тест ELISA для индивидуального образца, который можно использовать на биоптатах уха или образцах сыворотки от ПИ-животных за 20 минут.²²⁴

ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией)

Описание геномной последовательности BVDV и разработка подходящих зондов и коммерчески доступных тест-наборов позволили широко использовать ОТ-ПЦР в качестве рутинного метода диагностики.²²⁵ Методика очень чувствительна и может использоваться для различных диагностических образцов, включая молоко, мочу, ткани, сыворотку, цельную кровь, сперму и эмбрионы.^226–231 Хотя методы ОТ-ПЦР можно использовать для фиксированных в формалине диагностических образцов, происходит фрагментация РНК и чувствительность анализа снижается.²³²

Высокая чувствительность ОТ-ПЦР превосходит чувствительность изоляции вируса, и тест способен обнаружить вирусную РНК одного виремического образца в пуле из 100 отрицательных сывороток.²³³

Возможность объединения образцов, таких как молоко, сыворотка или цельная кровь, компенсирует изначально более высокую стоимость анализа и позволяет проводить экономичный скрининг для ПИживотных. Практика объединения таких образцов, как биопсия кожи или пробы крови, в отличие от использования сборного молока, не отменяет необходимости взятия образцов от каждого животного в стаде.²²⁹ В молоке BVDV выявляли методом ОТ-ПЦР в пробах, которые серийно разводили до 1:640.²³⁴ Количество проб, которое является оптимальным для объединения, оставалось спорным, но в итоге было рекомендовано объединять от 30 до 100 образцов сыворотки.^235,236 Экономические преимущества от объединения образцов уменьшаются, когда в популяциях существуют более высокие показатели распространенности, а конкурентные преимущества объединения уменьшаются, когда показатели распространенности превышают 3%.²³⁷

Серология

Выявление сывороточных антител против BVDV может быть выполнено с помощью различных тестов, но ELISA и анализ реакции нейтрализации сыворотки преобладают и заменили непрямой иммунопероксидазный или непрямой иммунофлюоресценцентный методы.²³⁸ При соответствующем применении серологические тесты позволяют оценить эффективность вакцины и соблюдение установленных протоколов вакцинации, определить подверженность стада BVDV и связь клинических признаков с этой инфекцией. Существуют трудности при определении этиологии обнаруженных антител, поскольку сероконверсия может быть результатом острых инфекций, вакцинации или передачи материнского иммунитета через молозиво. Коммерческие блокирующие анализы ELISA, которые выявляют антитела, направленные против белка NS3 BVDV, не способны дифференцировать антитела, полученные в результате естественной инфекции или вакцинации, а маркерные вакцины с BVDV в настоящее время недоступны.²³⁹ Серологическое тестирование ранее не подвергавшихся воздействию вируса сентинельных ( безмикробных) животных может быть использовано для обнаружения присутствия ПИкоров в стадах.²⁴⁰ Тем не менее, анализ и сравнение серологических титров не позволяют провести четкое различие между стадами без ПИ и ПИ-крс.²⁴¹

Вакцинация

В Соединенных Штатах широко доступны модифицированные живые и инактивированные вакцины против BVDV, чаще всего в форме поливалентных вакцин, содержащих другие респираторные и репродуктивные патогены. В то время как модифицированные живые вакцины стимулируют более обширный иммунный ответ у вакцинированных животных, являются менее дорогостоящими и обеспечивают некоторую защиту после введения однократной дозы, инактивированные вакцины используются, когда существуют проблемы безопасности. Однако, если по какой-либо причине не будет введена необходимая вторая бустерная доза при начальной иммунизации, это может привести к срыву программ контроля BVDV с использованием инактивированных вакцин.²⁴²

Из-за антигенного разнообразия штаммов BVDV и неспособности некоторых животных адекватно реагировать на иммунизацию, эффективность вакцинации не может быть 100%. Следовательно, программы вакцинации должны быть частью стратегии контроля, которая включает удаление из стада животных с ПИ и меры биобезопасности.²⁴³ Традиционно, при производстве вакцин использовались только штаммы BVDV-1, но антигенное разнообразие между обоими видами BVDV побудило включить в большинство вакцин и BVDV-2.

Исследования документировали защиту от BVDV-2-индуцированного заболевания у крупного рогатого скота, вакцинированного модифицированными живыми или аттенуированными вакцинами, содержащими BVDV-1,^244–246 но антигенная разнородность BVDV и, как следствие, неспособность к перекрестной защите продолжают вызывать беспокойство.

Хотя целью программ вакцинациии является защита от BVDVиндуцированного заболевания каждого отдельного животного, повышение иммунитета стада и предотвращение распространения вируса после случайного его внедрения являются более разумными целями в борьбе с BVDV. Вакцинация против BVDV-индуцированного заболевания в основном направлена на достижение двух целей: 1) защита от клинического заболевания и 2) профилактика внутриутробной инфекции и рождение ПИ-потомства. Несмотря на то, что для достижения любой из этих целей стимулируются одни и те же иммунные механизмы, для предотвращения внутриутробной инфекции необходим гораздо более высокий уровень иммунной защиты с привлечением Т- и В-клеточных реакций, приближающих иммунитет у стерилизующему.²⁴³ Программы вакцинации должны разрабатываться с акцентом на любую из двух целей, диктующую оптимальные сроки вакцинации и выбор типа вакцины.

Защита от клинического заболевания является желательной целью вакцинации против BVDV у телят, при этом наивысшие уровни гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета должны присутствовать во время наивысшего риска, как, например, при группировке, прибытии на стокерные фермы или перевозке на откормочную площадку.²⁴⁷ У телят, прибывающих на откормочную площадку с низкими титрами антител против BVDV и других респираторных патогенов, наблюдались снижение экономической отдачи, повышение риска заболеваемости и увеличение затрат на лечение.^247,248 Увеличение уровня заболеваемости и затрат на лечение было связано с неподходящими сроками вакцинации перед отелом или отсутствием ревакцинации в программах с использованием инактивированных вакцин, что подчеркивает ценность адекватных программ предварительной обработки.²⁴⁸ Как правило, программы предварительной обработки, реализуемые в стадах коров-телят, требуют отъема телят за 45 дней до отгрузки и включают в себя декорнуацию (удаление рогов) , кастрацию, приучение к кормушке и применение антигельминтиков и вакцин. Телята, вакцинированные за 30 и 17 дней до отправки на откормочную площадку многовалентной модифицированной живой вакциной, не становились виремическими и не выделяли BVDV при контакте с ПИ-сородичами.²⁴⁹ Несмотря на то, что модифицированные живые вакцины способны быстро обеспечивать клиническую защиту и защищать телят от экспериментального заражения уже через 3–5 дней после вакцинации в полевых условиях, не следует ожидать полной защиты в короткие сроки.^250,251

При планировании протокола вакцинации против BVDV для телят следует учитывать блокирование защитных иммунных реакций присутствием материнских антител, особенно у телят раннего отъема.²⁵² Двухнедельные телята, вакцинированные модифицированной вакциной в присутствии высоких титров колостральных антител, не были защищены от BVDV-индуцированного заболевания в возрасте 4 месяцев, в отличие от телят BVDV-серонегативных при вакцинации.²⁵³ Кроме того, существует большая разница между индивидуальными титрами материнских антител, что затрудняет оценку идеального времени первичной вакцинации телят.^254,255 Тем не менее, в последнее время разные исследователи продемонстрировали, что ранняя вакцинация телят на фоне материнских антител может привести к клеточно-опосредованному анамнестическому (вторичному, после повторного заражения) иммунному ответу и защите от BVDV-индуцированного заболевания, особенно при двукратном введении модифицированных живых вакцин.^256,257 Несмотря на то, что после вакцинации однократной дозой модифицированной живой вакцины наблюдалось снижение титров антител в трех возрастных группах телят, все группы были клинически защищены от BVDV-индуцированного заболевания и проявляли анамнестические реакции Т-клеток, что указывает на то, что вакцинация на фоне материнского иммунитета может быть эффективной в случае воздействия вируса (живой вакцины) в более раннем возрасте.²⁵⁸