(a) (b)
(c) (d)
(a) (b)
Микробиологическая диагностика ЭА остается затруднительной из-за невозможности культивирования возбудителя. Хотя ограниченная кратковременная репликация баЭА наблюдалась в первичных культурах макрофагов, полученных из аутопсийных лимфоидных тканей плода, самостоятельное размножение бактерии как в первичных, так и в устойчивых клеточных линиях было невозможно; все попытки культивировать баЭА на синтетических носителях также потерпели неудачу.5 Тогда были разработаны анализы полимеразной цепной реакции (ПЦР), как традиционные, так и на основе зондов типа TaqMan, с целью выявления бактериального рибосомального гена 16S.6–8
Оба анализа могут быть использованы для выявления присутствия баЭА в аутопсийных тканях инфицированных плодов, имеющих классическую патологию ЭА. TaqMan является предпочтительным анализом для выявлении низких уровней бактерий в аутопсийных тканях, полученных от предположительно зараженных плодов, таких, как плоды с сомнительной или неклассической патологией ЭА и слабых телят, как подсосных, так и нет. Анализ TaqMan также предпочтителен для выявления баЭА в переносчике инфекции, поскольку только случайный зараженный клещ будет иметь достаточные уровни бактерий, определяемые стандартной ПЦР.7
(a)
(b)
Обычные бактериальные гистологические способы окрашивания не выявляют баЭА в тканях плода, поэтому для его микроскопической визуализации в срезах тканей некропсии, фиксированных формалином, использовали модифицированную технику окрашивания серебром по Штейнеру, примененную к отдаленно родственной дельтапротеобактерии Lawsonia intracellularis. Окрашивание по Штейнеру и иммуногистохимия, применяемые к тонким срезам тканей некропсии, фиксированных формалином (рис. 61.3а, б), и иммунофлюоресцентный анализ, применяемый к отпечаткам мазков и/или гомогенатам свежих тканей, являются современными предпочтительными методами микроскопической диагностики ЭА.9,10
Серологический анализ на основе флуоресцирующих антител в настоящее время проходит валидацию (экспериментальное подтверждение эффективности) . Данный анализ представляется имеющим хорошую специфичность и чувствительность, и должен оказаться полезным диагностическим методом, когда большая часть баЭА устранена иммунной системой плода. Однако, интерпретация результатов серологического анализа будет затруднена у подсосных телят из-за присутствия материнских антител.
Патогенез
По-видимому, баЭA получает доступ к развивающемуся плоду через плаценту от зараженной матери. Инфицированная через укус клеща или посредством экспериментальной прививки стельная корова не имеет явных клинических признаков. Реакции на экспериментальные укусы клещей, зарегистрированные в различных источниках, были, скорее всего, реакцией на микробную контаминацию и/или слюну клеща. В развитии плода есть «окно», когда он подвержен инфекции, которая в конечном итоге приведет к заболеванию. Это "окно" точно не установлено, но обычно считается, что восприимчивость возникает на гестационном сроке 60–140 дней. Восприимчивость на более ранних сроках стельности (<60 дней) не известна. Хотя патоген, повидимому, не влияет на зачатие, изучается возможность того, что он может вызвать раннюю эмбриональную гибель у небольшого процента инфицированных животных. Заражение плода - это медленный процесс с развитием явных поражений, которые не проявляются в течение 2–3 месяцев.3 Бактерии, по-видимому, реплицируются внутриклеточно в гистиоцитах, что определяется иммуногистохимией (рис. 61.2); при краткосрочном культивировании макрофагов, полученных из тканей аутопсии плода репликация происходит чрезвычайно медленно (~1 день). Внутриклеточный характер инфекции, сосудистая ориентация поражений по всему плоду, а также медленное и хроническое развитие заболевания соответствует гипотезе о том, что поражения являются иммунологически опосредованными. Медленный рост бактерий, несомненно, ответственен за медленное распространение по всему телу и развитие поражений, совпадающее с развитием иммунологического созревания иммунной системы плода. Суягные овцы, по-видимому, не подвержены предгорному аборту; неопубликованные исследования, в которых беременные овцы были инфицированы в первом триместре, привели к рождению здоровых ягнят. Эти последние исследования соответствуют гипотезе о том, что бактерии размножаются и распространяются медленно, а у овец период беременности слишком короток для развития иммунологически опосредованных поражений и абортов. Чернохвостый длинноухий олень (Odocoileus hemionus) служит основным переносчиком клеща, но нет никаких свидетельств того, что ЭА встречается у этого вида. Продолжительность беременности у них является промежуточной (6–7 месяцев) между овцами и крупным рогатым скотом и может быть слишком короткой для развития болезни. С другой стороны регулярное воздействие бактерий на организм через укусы клещей может привести к выработке иммунитета, и в тех случаях, когда происходят аборты, плоды быстро подбирают падальщики, не оставляя никаких следов. Многочисленные попытки вызвать заболевание у иммунокомпетентных лабораторных животных, таких как мыши и кролики, потерпели неудачу.
Однако, мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитным заболеванием (SCID) подвержены инфицированию баЭА. У мышей с C3H-scid появляются признаки истощения через 7–8 недель после заражения, а еще через 2–3 недели им требуется эвтаназия, как неизлечимо больным.10 Единственным очевидным грубым поражением является увеличенная селезенка, которая содержит большое количество бактерий. Криоконсервированные баЭА-инфицированные клетки селезенки мыши с SCID являются отличным источником бактерий для предсказуемой передачи инфекции беременным телкам.
В отличие от бактерий, полученных из плода крс, выращенные бактерии не опсонизированы (не подвергались опсонизации антителами) и, по-видимому, обладают превосходной жизнеспособностью. Отсутствие ЭАподобных поражений у мышей с иммунодефицитом подтверждает указанную выше гипотезу о том, что поражения у плода крс иммунологически опосредованы.10
Передача инфекции
Наблюдения того, что ареал распространения клеща Ornithodoros coriaceus накладывается на территориальное распределение случаев предгорного аборта подгоняли ученых установить его в качестве потенциального биологического переносчика.4,7,8 Этот необычный клещ с мягкими покровами (обычно называемый клещом Паджарелло) несет в себе красочное прошлое, поскольку коренные американцы в Калифорнии опасались его укуса как укуса гремучей змеи. Они полагали, что второй или третий укус клеща приведет к смерти.
Предполагается, что сильная боль и отек придатков, которые иногда возникают после последовательных укусов клещей Паджарелло, являются экстремальной аллергической реакцией на слюну клеща и/или содержащиеся в ней микробы. Был проведен необычный и классический эксперимент, в котором наивные нетели были разделены на две группы в области, считающейся эндемичной для этой болезни. Одна половина телок содержалась в домиках на деревянных сваях, основания свай были плотно обернуты металлом, чтобы помешать потенциальному подъему ползающих насекомых, а другая половина содержалась на земле. Все живущие в домиках тёлки давали здоровых телят, в то время как у "наземных" животных происходил предгорный аборт. Впоследствии были проведены исследования, в которых пойманные в дикой среде клещи были экспериментально подсажены наивным нетелям для дополнительной демонстрации передачи заболевания.4,5 Клещ O. coriaceus был собран в Мексике, Калифорнии, Неваде и Орегоне (рис. 61.4), но предгорный аборт был описан только в вышеупомянутых трех штатах США.7,8,11 Особенность практики скотоводства в Мексике вполне может быть причиной отсутствия диагностики предгорного аборта в этой стране; в стадах крс с вольным содержанием абортированные плоды могут быть быстро уничтожены ( подобраны хищниками или растоптаны?) , что делает диагностику маловероятной.
