Воспроизводство крупного рогатого скота

Многочисленные эксперименты на крупном рогатом скоте и овцах, изучающие аберрантную экспрессию импринтированных генов после переноса эмбрионов IVP или SCNT, подтверждают эту гипотезу.^{146,172,177–} 183 Недавно однонуклеотидные полиморфизмы в модели Bos taurus × Bos indicus были использованы для исследования экспрессии импринтированных генов для концептов in vivo, IVP и SCNT на 17-й

день гестации и для плодов и плаценты на 45-й день.¹⁷¹ Моноаллельная экспрессия исследованных импринтированных генов не поддерживалась в полной мере в исследуемых тканях, а в некоторых случаях релаксация импринтов метилирования ДНК была связана с несоответствующей двуаллельной экспрессией.¹⁷¹ Дополнительные исследования по изучению отпечатков метилирования ДНК, важных для развития импринтированных генов, также подтверждают гипотезу о том, что эпигенетическая дисрегуляция является ключевым фактором, который, вероятно, способствует возникновению аномалий, связанных с AOS.^175, 177, 182, 184–186

Дальнейшее подтверждение этой гипотезе было предоставлено исследованиями других известных эпигенетических изменений, таких как ковалентные модификации гистонов.^187–193 Предполагается, что модификации гистонов, включая ацетилирование и метилирование, играют роль в регуляции экспрессии импринтированных генов посредством замалчивания РНК ( подавление экспрессии генов)^194,195 или активации моноаллельной экспрессии.¹⁹⁶

В настоящее время известно более 140 импринтированных генов у мышей и людей.¹⁷⁰ Однако, до сих пор исследования на крупном рогатом скоте были сосредоточены только на небольшом подмножестве импринтированных генов. Известно, что доимплантационный эмбрион крупного рогатого скота чувствителен к измененным эпигенетическим модификациям, производимым системой IVC или протоколами SCNT на основе результирующей аберрантной экспрессии импринтированных генов.^{63,101, 197} Наблюдение за тем, что некоторые импринтированные гены обладают способностью регулировать экспрессию неимпринтированных генов, предполагает, что начальная эпигенетическая дисрегуляция, вызванная IVC и SCNT, может усугубляться этим последующим влиянием на экспрессию неимпринтированных генов.^59,198,199

Эпигенетическая дисрегуляция неимпринтированных генов

Среда для IVC (культивирования эмбрионов) и протоколы SCNT могут влиять на экспрессию неимпринтированных генов посредством последующих эффектов аберрантно экспрессируемых импринтированных генов и эпигенетической дисрегуляции самих неимпринтированных генов. В раковых клетках человека аберрантная экспрессия импринтированного гена p73 подавляла экспрессию VEGF - не импринтированного гена, который является важным плацентарным ангиогенным фактором.^198,199 Разумно ожидать, что аналогичные эффекты на не импринтированные нижестоящие регуляторы могут также возникать у бычьих эмбрионов и плодов, созданных в таких условиях, как при IVC и SCNT, которые вызывают аберрантную экспрессию импринтированных генов. Альтернативно, аберрантная экспрессия неимпринтированных генов может происходить в результате гиперметилирования на CpG-островках, окружающих промоторы неимпринтированных генов.²⁰⁰ В этом случае такие эпигенетические ошибки не будут зависеть от механизмов импринтинга. Например, в хорионе SCNT-беременных коров промотор эпидермального гена цитокератина и повторяющиеся элементы сателлита-1 были гиперметилированы по сравнению с таковыми у контрольных животных in vivo.^59,201 Хотя точные механизмы, которые регулируют экспрессию неимпринтированных генов, остаются неясными, очевидно, что протоколы IVC и SCNT могут отрицательно влиять на экспрессию неимпринтированных генов и, в свою очередь, способствовать аномалиям, связанным с AOS.^{51,63,135,202–204}

Измененная экспрессия мРНК, кодируемых неимпринтированными генами, включая миостатин и GAPDH, была связана с повышенным соотношением типов вторичных мышечных волокон к первичным мышечным волокнам у IVP-плодов.¹³⁵ Аналогичным образом, измененная экспрессия мРНК или белков VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) , PPARγ (рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами) , лептина, лактогена бычьей плаценты, трансформирующего фактора роста TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, рецепторов TGFβ (TGFβ - трансформирующий фактора роста бета - белок (представитель цитокинов), который контролирует пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток) и основных антигенов класса I гистосовместимости были обнаружены в плаценте от беременностей IVP или SCNT.^{50,51,202–204} Эти более тонкие изменения в развитии плода или плаценты после процедур IVP или SCNT, которые не подпадают под классическое определение синдрома «крупноплодия», могут, тем не менее, отражать возникновение эпигенетической дисрегуляции, характерной для AOS.⁵⁹

Исследование паттернов экспрессии генов у эмбрионов, плодов и плаценты крупного рогатого скота, овец и мышей, полученных с помощью IVC или прошедших процедуры SCNT, продемонстрировало измененную экспрессию импринтированных,^{63,104,146,177,205} X-сцепленных,^63,201,206 и не импринтированных^{51,63,135,203,204} генов. Изменения в паттернах метилирования эмбрионов и глобальных уровнях метилирования были связаны с изменением доимплантационного развития^207,208 и неблагоприятными исходами беременности с SCNT-плодами.²⁰⁹ Эти эффекты могут быть лишь вторичными ответными реакциями, которые являются результатом начального влияния измененного эпигенетического статуса импринтированных генов на ранней стадии доимплантационного или периимплантационного развития. С другой стороны, они могут указывать на то, что IVC и обработка могут влиять на паттерны метилирования, которые могут участвовать в регуляции экспрессии неимпринтированных генов, как это было предложено для других систем^200,210 и наблюдалось при беременностях с SCNT.²⁰¹ Таким образом, вероятно, что гиперметилирование промоторов, содержащих CpG-островки, при SCNT-беременностях может приводить к изменениям в экспрессии генов независимо от импринтинга. В совокупности эти наблюдения подтверждают предположение, что глобальные эпигенетические модификации, влияющие на экспрессию неимпринтированных генов, могут играть важную роль в возникновении AOS.

В исследованиях тканей плаценты человека была признана важность как импринтированных, так и не импринтированных генов в контроле роста плода и функции плаценты. Например, была выявлена взаимосвязь между нарушением регуляции импринтированных генов и возникновением задержки внутриутробного развития у человека, синдрома, который влияет как на функцию плаценты, так и на рост плода.²¹¹ Интересно, что в то время как эпигенетическая дисрегуляция у таких видов, как крупный рогатый скот и овцы, приводит к чрезмерному росту плода, аналогичная дисрегуляция приводит к противоположному фенотипу у людей. Эти наблюдения подтверждают необходимость изменения номенклатуры с синдрома «крупноплодия» на более точный и широко применимый термин AOS.⁵⁹

Нарушение эпигенетических регуляторов

У млекопитающих в период раннего эмбрионального развития паттерны метилирования ДНК, которые регулируют экспрессию генов, приобретаются и поддерживаются семейством ферментов, называемых ДНК-метилтрансферазами (DNMT).^168,170,212

У растущего плода появляются примордиальные половые клетки, которые мигрируют к генитальному гребню, претерпевая митотическое деление. В этот период их ДНК подвергается полному деметилированию. DNMT3A, 3B и 3L являются de novo метилтрансферазами, которые функционируют для установления полоспецифичных паттернов метилирования локусов импринтированных генов во время гаметогенеза.^168,174,212

Материнские импринты (или отпечатки - специфическая память родительского происхождения хромосом) приобретаются постнатально во время фолликулогенеза, что совпадает с ростом глобального метилирования ДНК, которое достигает своего максимума перед овуляцией в полностью выросших ооцитах, которые задерживаются на стадии диктиата (GV) (или стадии покоя, когда первичные ооциты перестают делиться) .^213,214 Напротив, отцовские импринты устанавливаются еще до рождения в половых клетках развивающегося самца.¹⁷⁶ В зиготе отцовский геном подвергается активному деметилированию ДНК, которое происходит быстро после оплодотворения.^176,212 Для сравнения, деметилирование материнского генома происходит пассивно из-за исключения DNMT1 из ядра во время ранних делений расщепления.¹⁷⁶ DNMT1 отвечает за поддержание паттернов метилирования во время репликации ДНК.²¹⁵ В то время как глобальное деметилирование ДНК происходит в родительских геномах ранней зиготы, следы полоспецифического метилирования сохраняются. Считается, что у мышей материнский и отцовский импринты поддерживаются в зиготе с помощью ооцит-специфической изоформы DNMT1, обозначенной как DNMT1o.²¹⁶ Однако, у крупного рогатого скота эта изоформа ооцита не была идентифицирована.^217,218 У мышей протеин DNMT1 присутствует в фолликулах на ранних стадиях, а затем переходит в цитоплазму на более поздних этапах дифференцировки ооцитов и раннего эмбриогенеза.^219,220 Считается, что деметилирование родительского генома происходит в результате исключения DNMT1 из ядра во время ранних делений дробления.¹⁷⁵ У крупного рогатого скота новообразованный эмбриональный геном реметилируется по мере перехода к стадии бластоцисты под действием метилтрансфераз de novo DNMT3A, 3B и 3 L.^{168, 174, 176, 212}

У эмбрионов, продуцируемых in vivo, активное деметилирование отцовского генома и пассивное деметилирование материнского генома приводит к гипометилированию в период раннего дробления.^175,221 Когда эмбрион достигает стадии бластоцисты, метилирование de novo совпадает с дифференцировкой клеток, участвующих в формировании внутренней клеточной массы и трофэктодермы. Таким образом, устанавливаются тканевые и временно-специфические паттерны метилирования, которые будут передаваться на протяжении всего развития.^212,222,223 Поскольку DNMT отвечают за стирание, приобретение и поддержание импринтов метилирования в гаметах, а также за создание и поддержание паттернов метилирования ДНК во время эпигенетического репрограммирования эмбриона, было высказано предположение, что аномалии, связанные с AOS после переноса эмбрионов IVP или SCNT могут быть результатом аномальной экспрессии или функции DNMT.^224–226 Измененная экспрессия мРНК DNMT1 и DNMT3a наблюдалась у эмбрионов IVP и SCNT перед имплантацией⁶³ , что еще раз подтверждает гипотезу о том, что нарушение регуляции DNMT приводит к каскаду аберрантной экспрессии импринтированных генов и последующим аномалиям развития.⁶³ Дополнительные нарушения могут возникать из-за изменений структуры хроматина и модификаций гистонов, которые могут способствовать нарушению доступа DNMT к геному во время развития.⁵⁹

Эмбрионы SCNT крупного рогатого скота демонстрируют гиперметилированную ДНК по сравнению с эмбрионами in vivo - ситуация, которая напоминает статус метилирования соматической донорской клетки.^{187,224,227,228}

У SCNT-эмбрионов крупного рогатого скота деметилирование ДНК не происходит после 2-клеточной стадии.¹⁷⁵ Таким образом, некоторые сбои в развитии беременностей с SCNT могут возникать из-за неправильного деметилирования ДНК с последующим поддержанием гиперметилированного состояния клеток линии трофэктодермы, что приводит к аберрантной экспрессии генов и аномалиям плаценты.^{223,224,229,230} Действительно, экспрессия мРНК DNMT1 и уровни метилирования ДНК были значительно выше на всех предимплантационных этапах у SCNT-эмбрионов по сравнению с контрольными IVP-эмбрионами.²²³ Когда уровень транскриптов DNMT1 снизился за счет встраивания siRNA для DNMT1, метилирование уменьшилось, и количество эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, значительно увеличилось.²²³ В аналогичном исследовании SCNT-эмбрионы с пониженным уровнем siRNA DNMT1 показали рост до стадии бластоцисты, хотя не было никаких различий в их развитии до доношенного срока.²¹⁷

Ооцит-зависимые эпигенетические аномалии

Аберрантные эпигенетические модификации, ведущие к аномалиям у эмбрионов, плодов и плаценты после переноса эмбрионов IVP или SCNT, могут первоначально возникать в гаметах. Больше внимания уделяется оценке потенциальных аберраций импринтингового статуса генов в ооците, а не в сперматозоидах, поскольку ооциты млекопитающих начинают приобретать свои материнские отпечатки (импринты) во время фолликулогенеза и завершают во время созревания ооцитов, происходящего непосредственно перед овуляцией.²³¹ Для сравнения, сперматозоиды приобретают отцовские отпечатки in vivo во время сперматогенеза, и их ДНК упакована в очень защищенном виде. Однако, сперматозоиды, подвергнутые замораживанию и оттаиванию, а также процедурам разделения по полу, также могут подвергаться эпигеномным изменениям, поскольку они демонстрируют низкие темпы развития бластоцист во время производства эмбрионов IVP и низкие показатели стельности после ИО.^232–236 При анализе двух специфических импринтированных генов, IGF2 и его рецептора IGF2R, не было обнаружено различий в паттернах метилирования ДНК в регуляторных, дифференциально метилированных участках этих генов между размороженными, несортированными и отсортированными по полу спермиями быков породы Нелоре.²³⁶ Кроме того, не было обнаружено различий в импринтах метилирования ДНК этих генов между неразделенными сперматозоидами и разделенными по полу X-несущими или Y- несущими сперматозоидами.²³⁶ Эти наблюдения подтверждают предположение, что импринты метилирования ДНК на отцовском геноме не повреждены до момента оплодотворения in vitro. Низкие параметры бластоцист и низкий процент наступления беременности после осеменения спермой, отсортированной по полу, могут быть результатом фрагментации ДНК, изменения процесса упаковки хроматина и эпигенетических дефектов метилирования ДНК внутри чередующихся повторов (последовательности нуклеотидных повторов идут не сразу одна за другой, а рассредоточены по всему геному и не являются смежными) или модификаций гистонов.^236,237.

У млекопитающих материнские отпечатки приобретаются во время фолликулогенеза, и поэтому незрелые фолликулы, которые аспирируют и подвергают процедуре IVM, могут иметь измененные материнские отпечатки по сравнению с ооцитами, полностью созревшими и овулированными in vivo. Таким образом, использование систем IVM может быть фактором, способствующим аберрантной экспрессии импринтированных генов и аномалиям, связанным с возникновением AOS.

В ооцитах крупного рогатого скота существуют существенные различия в развитии и физиологии между кумулюс–ооцитными комплексами, созревшими in vitro, и комплексами, созревшими in vivo. Например, 50–80% созревших ооцитов in vivo развиваются до стадии бластоцисты, тогда как только 15–40% ооцитов IVM достигают стадии бластоцисты.^71–74 Несколько ранних исследований стремились связать IVM-ооциты с фенотипом избыточного роста. Например, ооциты овцы, которые были подвергнуты IVM и оплодотворению in vitro с последующим культивированием in vivo в течение 6,5 дней перед последующим переносом самкам-реципиентам, привели к появлению ягнят, которые были тяжелее при рождении, чем ягнята, полученные из ооцитов, которые созрели, были оплодотворены и культивированы in vivo.²³⁸ Фенотип избыточного роста плода также наблюдался у трансгенных телят, полученных из ооцитов IVM, по сравнению с таковыми, полученными из ооцитов, созревших in vivo.⁷⁹ Интересно, что когда для создания SCNT-концептов использовались незрелые фолликулы (1–3 мм), было замечено, что они обладают меньшими внеэмбриональными мембранами по сравнению с таковыми из более зрелых фолликулов (6–12 мм).⁵⁷ Однако, не было явных различий по размеру плода, аллантоидной васкуляризации, частоте наступления беременности или выживаемости до срока между SCNTбеременностями после переноса незрелых или зрелых ооцитов.⁵⁷ Недавние исследования были сосредоточены на оценке эпигенетических профилей в ооцитах и влиянии IVM на экспрессию мРНК и последующее эмбриональное развитие. Например, экспрессия мРНК ооцитов для ферментов, необходимых для установления или поддержания метилирования ДНК и модификации гистонов, включая G9A, SUV39H1 и DNMT1, в значительной степени зависела от размера фолликула.²³⁹ Кроме того, было обнаружено, что мРНК генов, участвующих в цикле трикарбоновых кислот и в путях окислительного фосфорилирования, аберрантно (аномально) экспрессируются в метафазе II ооцитов крупного рогатого скота, созревших in vitro.²⁴⁰ Кроме того, важные для развития импринтированные гены, включая IGF2R, PEG3 и SNRPN, также были аномально экспрессированы, что позволяет предположить, что ошибки в установлении или поддержании паттернов метилирования ДНК ооцитов произошли во время IVM.²⁴⁰

Отпечатки метилирования материнской ДНК для SNRPN, MEST, IGF2R, PEG10 и PLGAL1 были проанализированы в ооцитах крупного рогатого скота, которые были сгруппированы на группы с малым (101– 110 мкм) или большим (> 120 мкм) диаметром.¹⁷⁴ Дифференциально метилированные участки (DMR) у этих импринтированных генов в малых ооцитах были гипометилированы. Напротив, в больших ооцитах эти DMR были гиперметилированы. Эти наблюдения подтверждают предположение, что приобретение материнских отпечатков коррелирует с размером ооцита.

Fagundes и соавт.²⁴¹ оценили отпечаток метилирования гена IGF2 у ооцитов, аспирированных из малых (<3 мм) и больших (>8 мм) фолликулов и подвергнутых IVM. IGF2 импринтируется по отцовской линии и становится гипометилированным в зрелых преовуляторных ооцитах.²⁴¹ Ооциты, взятые из мелких или крупных фолликулов, после IVM подразделялись на зрелые и незрелые. Созревшие ооциты были идентифицированы по наличию второго полярного тельца при прекращении культивирования.²⁴¹ Интересно, что созревшие ооциты из крупных фолликулов демонстрируют большую степень гипометилирования по сравнению со зрелыми ооцитами, полученными из маленьких фолликулов.²⁴¹ Эти результаты согласуются с предпосылкой, что отпечатки метилирования для IGF2 устанавливаются правильно во время IVM у ооцитов, которые получены из крупных фолликулов и созрели in vitro. Кроме того, оценка импринтов IGF2 может быть потенциально полезной в качестве маркера способности ооцитов к развитию.²⁴¹

Эти результаты также подтверждают предположение о том, что когда ооциты получают из более мелких фолликулов, материнские импринты могут быть неправильно установлены во время IVM, несмотря на тот факт, что ооциты успешно достигают метафазы II мейоза во время культивирования. Такие неправильно установленные импринты могут способствовать возникновению аномалий в развитии после оплодотворения.

Хотя отпечатки метилирования ДНК, по-видимому, правильно устанавливаются в ооцитах из крупных фолликулов, созревших in vitro, следует отметить, что в исследованиях, обсужденных выше, анализировались пулы ооцитов, а не единичные ооциты. Используя анализ паттернов метилирования в отдельных созревших ооцитах с использованием бисульфатного секвенирования с ограниченным разведением, El Hajj и др.²⁴² обнаружили, что паттерны метилирования ДНК для H19, SNRPN и PEG3 были правильно установлены в семи из восьми ооцитах, а один из восьми показал обратный импринтинг для H19 и SNRPN.²⁴² Таким образом, можно исследовать паттерн метилирования нескольких генов из отдельных клеток и, что более важно, IVM может привести к аберрантному установлению эпигенетических паттернов в подмножестве ооцитов крупного рогатого скота до оплодотворения.²⁴²

Во время созревания ооцитов метилирование ДНК регуляторных CpG-островков не всегда коррелирует с подавлением экспрессии мРНК соответствующего гена. Например, метилирование ДНК CpGостровков в генах PEG3, H19 и SNRPN не отличалось или отличалось лишь незначительно между созревшими ооцитами in vivo и созревшими ооцитами in vitro.²⁴³ Однако, экспрессия мРНК для H19 и PEG3 была значительно выше в ооцитах, созревших in vitro, по сравнению с ооцитами, созревшими in vivo, и была аналогична уровням экспрессии, обнаруженным в незрелых ооцитах.²⁴³ Таким образом, хотя паттерны метилирования ДНК, повидимому, и были установлены правильно, некоторые импринтированные гены сохраняют паттерны экспрессии, характерные для незрелых ооцитов, даже после того, как они подвергаются воздействию среды IVM.²⁴³ Разумно ожидать, что существуют дополнительные уровни регуляции помимо статуса метилирования CpG-островков в пределах регуляторных областей генов, и на них неблагоприятно влияют условия IVM-среды.

Ссылки

1. Elsden R, Hasler J, Seidel G. Безоперационное извлечение яйцеклеток крупного рогатого скота. Theriogenology 1976;6:523–532.

2. Боуэн Дж., Элсден Р., Сейдел Г. Нехирургическая пересадка эмбрионов у коров. Theriogenology 1978;10:89–95.

3. Сейдел Г. Суперовуляция и пересадка эмбрионов у крупного рогатого скота. Science 1981;211:351–358.

4. Тибье М. Статистика пересадки эмбрионов в мире. IETS Newsletter 1998;16. http://www.iets.org/pdf/comm_data/ декабря1998.pdf, онлайн.

5. Тибье М. Неоднозначный год для мировой отрасли пересадки эмбрионов животных: отчёт Комитета IETS по сбору данных. IETS Newsletter 2002;20:13–19.

6. Страуд Б. Мировая статистика пересадки эмбрионов сельскохозяйственных животных за 2011 год. IETS Newsletter 2012;30:16–26.

7. Блок Дж., Дрост М., Монсон Р. и др. Использование инсулиноподобного фактора роста I при культивировании эмбрионов и обработка коров-реципиентов гонадотропин-рилизинг-гормоном для повышения частоты наступления стельности после переноса эмбрионов, полученных in vitro , лактирующим коровам, подвергшимся тепловому стрессу. J Anim Sci 2003;81:1590–1602.

8. Хансен П., Блок Дж. На пути к миру, в центре которого — эмбрион: современное и потенциальное применение эмбриональных технологий в молочном животноводстве. Reprod Fertil Dev 2004;16:1–14.