Воспроизводство крупного рогатого скота

Общие морфологические аномалии, о которых сообщалось после переноса эмбрионов SCNT, включали увеличенную пуповину, респираторные проблемы, длительное лежачее положение и контрактуру сухожилий сгибателей.⁴⁹ Кроме того, клонированные телята демонстрировали другие аномалии при рождении, включающие гипотермию, гипогликемию, тяжелый метаболический ацидоз и гипоксию, хотя эти параметры не имели достоверной корреляции с массой тела при рождении. Поскольку концентрации инсулина в плазме были значительно повышены, а концентрация глюкагона в плазме коррелировала с массой тела при рождении, аберрантная доступность энергии и ее использование в утробе матери могут вызывать состояния, аналогичные тем, которые наблюдаются при гестационном диабете у человека.¹⁴¹ При рождении у клонированных телят часто наблюдается респираторный дистресс-синдром¹⁴² , а в некоторых случаях наблюдается левосторонняя кардиопатия с расширением желудочков и легочной гипертензией.¹⁴² Кроме того, при рождении телят, которые выглядели аномальными, также наблюдался отек плаценты.¹⁴² В других исследованиях сообщалось об увеличении пупочных сосудов и различной степени отека, а также о таких заболеваниях, как руменит, абомазит и кокцидиоз при рождении.^{15,20,52,64,143} Среднее количество плацентом также было ниже, а средний вес плацентом выше в плаценте клонированных телят по сравнению с контрольной группой IVP.⁵²

Плоды и телята от эмбрионов IVP или SCNT демонстрируют правостороннее распределение веса по сравнению с ИО или in vivo полученными контролями.^52,54,55,144 Клонированные телята при рождении были на 20% крупнее по сравнению с телятами, полученными в результате переноса in vivo эмбрионов или ИО-телят, и имели более значительные различия в весе при рождении.³³ Интересно, что клонированные телята, полученные из ооцитов, созревших in vitro, имели значительно более высокий вес при рождении, чем клонированные телята, полученные из ооцитов, созревших in vivo. Фактически, средний вес при рождении телят-самок, полученных in vitro, был значительно выше, чем у in vivo полученных телят-самцов.⁷⁹ Сообщалось, что доля потомства мужского пола, полученного в результате переноса эмбрионов IVP, увеличилась по сравнению с ожидаемым соотношением 1:1 по сравнению с контрольной группой ИО, где сохранялось нормальное соотношение полов.^104,129,140 Напротив, в других исследованиях не сообщалось о различиях в доле самцов, рожденных после переноса эмбрионов IVP.^45,54,145

Плоды, полученные из IVP-эмбрионов, также могут отличаться по экспрессии генов и белков по сравнению с плодами, полученными in vivo. На 90-й день гестации IVP-беременности были связаны с более низкими концентрациями глюкозы у плода, чем в контроле in vivo.¹²⁸ Экспрессия мРНК IGF2 была вдвое выше в ткани печени на 63-й день, но уменьшилась в ткани скелетных мышц плодов, полученных из эмбрионов IVP, по сравнению с таковой в контрольной группе, полученной in vivo.¹⁴⁶ Кроме того, скелетная мышечная ткань IVPплодов на 222-й день гестации имела более низкую экспрессию мРНК миостатина и имела тенденцию к повышению экспрессии мРНК GAPDH по сравнению с контролем in vivo.¹⁴⁷ Напротив, несмотря на различия в морфологии плода и плаценты на 90-й или 180-й день гестации между беременностями, полученными переносом IVP- или in vivo-эмбрионов, не было обнаружено значительных различий в уровнях экспрессии мРНК в печени плодов и тканях плаценты при этих беременностях, когда для анализа использовалось 13000 олигонуклеотидных микрочипов.¹⁴⁸ Поскольку эти результаты противоречили данным более ранних исследований, Jiang и др.¹⁴⁸ предположили, что аномальная экспрессия генов может быть специфичной для стадии развития и ткани. С другой стороны, ограниченное количество наблюдений, используемых в каждой подгруппе обработка/стадия в сочетании с ограниченным размером массива экспрессии могло препятствовать идентификации различий в экспрессии мРНК.

Развитие плаценты

Помимо аномалий плода, получение телят путем переноса эмбрионов IVP или SCNT связано с дефектами развития плаценты и кровообращения. Плаценты при беременностях IVP или SCNT плодами могут отличаться морфологией, функцией, экспрессией генов, выработкой гормонов или белка по сравнению с плацентами при пересадке in vivo эмбрионов или беременности от ИО.^{15,51,52,59,62,149} Нарушения плацентации и функции плаценты могут повлиять на рост и развитие этих плодов, полученных с помощью методов in vitro. Аномалии развития плаценты еще более выражены при беременности с эмбрионами SCNT; фактически, большинство случаев невынашивания беременности при SCNT связано с плацентарной недостаточностью.^62, 142 Напротив, при нормальных беременностях (полученных in vivo) большая часть потерь происходит из-за аномалий развития плода.⁵⁴

Потеря IVP-беременностей на ранних сроках может быть связана с аномалиями и сбоями в развитии плаценты. Общие морфологические аномалии, зафиксированные в плаценте IVP, включают увеличение размера (плацентомегалия), увеличение объема плацентарной жидкости (гидроллантоис) и уменьшение площади поверхности плацентом (см. Ссылку 59). При анализе плаценты на 70-й день беременности от эмбрионов, полученных in vitro с использованием либо полуопределенной ( полусинтетической) культуральной среды (mSOF), либо неопределенной (натуральной) среды с добавлением сыворотки (M199), и в сравнении с in vivo продуцированными контролями, 51 из плацент от эмбрионов, полученных в среде mSOF, были тяжелее, имели пониженную производительность, меньшее количество плацентом и меньшее количество плацентарной жидкости по сравнению с таковыми в группе М199 или с контрольными группами in vivo. Кроме того, плаценты из группы mSOF имели пониженную плотность кровеносных сосудов и уровни мРНК фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в котиледонах, что свидетельствует о нарушении развития сосудов. Кроме того, наблюдалась повышенная плотность пикнотических клеток (клетки со сморщенным ядром из-за потери воды) плода в плацентомах из группы mSOF по сравнению с контрольными группами M199 и in vivo, что указывает на повышенную гибель клеток в ворсинах плода.⁵¹ Другие аномалии плаценты, которые наблюдались при беременностях с IVP на ранних сроках, включают различия в распределении размеров плацентом, их весе и площади поверхности на 90-й и 180-й дни гестации.^128,134 Более того, плацентомы, непосредственно окружающие плод, были длиннее и тоньше в течение первого триместра IVP-беременностей по сравнению с контрольной группой. На 180-й день беременности увеличение площади поверхности плацентом и их веса было связано с повышенным накоплением глюкозы и фруктозы в плазме и жидкостях плода.¹³⁴ Несмотря на то, что плаценты у IVP-беременных коров имели значительно меньшее количество котиледонов, чем плаценты от контрольных животных in vivo, они имели большую площадь поверхности котиледонов. Была выдвинута гипотеза, что повышенное использование питательных веществ у более крупных IVP-плодов может быть ответственным за более высокий вес плода, наблюдаемый в этой экспериментальной группе.^{128, 134}

Плаценты первого триместра у беременных с SCNT-плодами могут не иметь надлежащей васкуляризации и демонстрировать аномалии, включая гипоплазию и отставание котиледонарного развития.^62,150–153

Точно так же потеря SCNT-беременности на более поздних сроках была связана с рядом факторов, включая уменьшение числа котиледонов или плацентом, гидроллантоис, отек плаценты и анасарку плода.¹⁵ Неправильное развитие аллантоиса часто является основной причиной гибели эмбрионов после 30 дня беременности, поскольку аллантоис необходим для формирования хориоаллантоисной плаценты. Плацентомы начинают формироваться примерно с 30 дня.¹⁵⁴ Эмбрионы SCNT могут иметь нарушенное формирование котиледонов или другие проблемы, которые препятствуют правильному развитию структуры и количества плацентом.¹⁵⁰ Количество плацентом более вариабельно при беременностях с SCNT по сравнению с контрольной группой ИО^62,150 , и существует высокая вероятность выкидыша к 90-му дню беременности, если количество плацентом очень низкое.^59,62,150

На более поздних сроках беременности плаценты при IVP- или SCNTбеременностях могут иметь другие морфологические или функциональные аномалии. На 222-й день гестации плаценты, полученные от беременных IVP-плодами, имели увеличенный пропорциональный объем кровеносных сосудов в материнских карункулах по сравнению с контролем in vivo.⁵⁰ Кроме того, плаценты из группы IVP имели повышенное соотношение объема ткани, занимаемого кровеносными сосудами, к площади поверхности плацентом, что указывает на потенциально повышенную васкуляризацию по сравнению с контролем. Напротив, не было выявлено различий в объемной плотности ворсинок плода на 70-й день между группами IVP и in vivo, что позволяет предположить, что нарушения в формировании ворсинок, вероятно, возникают на более поздних сроках беременности.⁵¹ Точно так же не было разницы в массе плаценты на 70-й день беременности, тогда как на 222-й день плаценты от IVP-плодов были тяжелее, чем контрольные in vivo.⁵⁰ Эти результаты также подтверждают предположение о том, что отклонения в росте плаценты, связанные с IVP-беременностью, происходят на более поздних сроках.⁵¹ Избыточный рост плода, связанный с in vitroпроцедурой его получения, вероятно, приводит к повышенной потребности в питательных веществах и газообмене, а плаценты от IVPбеременных могут развивать компенсаторные механизмы в сосудистой системе для решения проблемы уменьшенной площади поверхности, доступной для контакта плода и матери.⁵⁰ Заболеваемость гидраллантоисом среди IVP-беременных составляет примерно 1 из 200 беременностей, что значительно выше, чем 1 из 7500 случаев, зарегистрированных при нормальной беременности.⁵⁴

Во второй половине гестации в SCNT-плаценте могут наблюдаться плацентомегалия и гидраллантоис, при этом отек плода и тканей плаценты является основной причиной гибели плода при беременности с SCNT.¹⁵⁰ Кроме того, диаметр пуповины, как правило, больше, а ее просвет увеличен из-за отсутствия складок в просвете при SCNTбеременностях по сравнению с контрольными беременностями ИО.^150,151 Избыточный рост плаценты при SCNT-беременностях может быть вызван врожденными дефектами плаценты, а не чрезмерным ростом плода, и может охватывать до 50% поздне-гестационных SCNTбеременностей.¹⁵¹ Разрастание плаценты происходило до избыточного роста плода, и соотношение веса плода к весу плацентом было ниже при беременностях с SCNT по сравнению с контрольной группой ИО и in vitro.¹⁵¹

Плаценты от беременностей IVP или SCNT демонстрируют различия в экспрессии генов или продукции белка. Например, карункулярные уровни PPARγ - транскрипционного фактора, участвующего в экспрессии VEGF и развитии сосудов, - были увеличены на 222-й день у плацент при IVP-беременности по сравнению с контролем in vivo.⁵⁰ Различия в экспрессии генов плацентом между беременностями в группах SCNT, IVP и ИО, взятых между 174-м днем беременности и доношенным сроком, оценивались с помощью микрочипового анализа.¹⁴⁹

В общей сложности между плацентомами IVP и SCNT были идентифицированы 162 дифференциально экспрессируемых гена (DEG), а между плацентомами ИО и SCNT были идентифицированы 276 DEG.¹⁴⁹ Некоторые DEG были общими для плацентомов IVP и SCNT, что свидетельствует о влиянии системы культивирования на транскриптом плацентома. Плаценты SCNT имели сильно измененные уровни экспрессии генов, независимо от наличия нормальной или аномальной морфологии. Более того, авторы исследования предположили, что неспособность компенсировать плацентарную дисфункцию приводит к гибели плода и другим аномалиям, связанным с АОS.¹⁴⁹ Это также согласуется с предположением о том, что голодание плода из-за плацентарной недостаточности может быть основной причиной потери SCNT-беременностей после 50го дня.⁶² Весьма вероятно, что недостаточность обмена питательными веществами между плодом и матерью и выведения продуктов обмена является основной причиной потери беременности в интервале от середины до позднего гестационного срока в сочетании с AOS типа III.

Астон и др.¹⁵⁵ использовали массив генома крупного рогатого скота Affymetrix GeneChip для исследования экспрессии генов между SCNT-котиледонами на 70-е сутки и ИО-плацентой и сообщили о 19 DEGs между группами. Однако, ни один из их DEG не совпадал с таковыми в исследовании Everts и др.¹⁴⁹ Вероятно, это связано с взятием образцов разных тканей в разные моменты времени. Недавно тот же самый Affymetrix GeneChip был использован для исследования глобального транскриптома плаценты на 50-й день, полученной при беременностях ИО, IVP и SCNT.¹⁵⁶ Всего между плацентами групп SCNT и ИО было идентифицировано 1196 DEG, из которых 9% были вызваны ошибкой транскрипционного репрограммирования.¹⁵⁶ Плаценты из группы IVP имели только 72 DEG по сравнению с группой ИО, причем 58 из этих DEG также были общими для SCNT-плацент. DEG в группах SCNT и IVP участвовали в развитии органов, развитии кровеносных сосудов, организации внеклеточного матрикса и иммунной системы.¹⁵⁶ Интересно, что 96% DEG в группе SCNT не отличались по регуляции от группы IVP, указывая на то, что эти плаценты испытывают уникальное нарушение экспрессии генов. Кроме того, более высокий уровень дисрегуляции транскриптома в плаценте SCNT согласуется с более высокой степенью морфологической дисрегуляции, сообщаемой при беременностях SCNT. Средние концентрации глюкозы в жидкости плода не различались между беременностями SCNT и ИО на ранних сроках; тем не менее, уровни глюкозы в плодной жидкости были ниже при прерывании SCNT-беременности с наличием увеличенной плаценты или уменьшенного количества плацентом.¹⁵⁷ Скорость роста плаценты при SCNT-беременностях не снижалась, как при ИО-беременностях, и есть доказательства того, что экспрессия транспортера глюкозы GLUT3 была повышена в SCNT-плаценте, что указывает на увеличение поглощения глюкозы плацентой при SCNT-беременности.^158,159 Плацента крупного рогатого скота также является основным источником эстрона, а эстрогены, полученные из плаценты, играют роль в проницаемости сосудов и распределении внеклеточной жидкости.¹⁵⁰ Повышенные уровни эстрадиола были зарегистрированы при SCNT-беременности, начиная с 80-го дня, и они могут способствовать часто наблюдаемому отеку плаценты и плода.¹⁵⁰ Нарушенные уровни эстрогена при SCNTбеременности также могут быть причиной недостаточного развития молочных желез, наблюдаемого непосредственно перед отелом, и недостаточной подготовки к родам.¹³¹

Аномально высокие концентрации связанных с беременностью гликопротеинов (PAG) на 50-й день стельности коррелировали с гибелью плода при SCNT-беременности.¹³¹ На основании данных, полученных с использованием глобального протеомного подхода (исследование белков) для изучения дифференциальной экспрессии белков в плаценте, взятой либо после отела с SCNT-плодами, закончившегося постнатальной смертью, либо после родов с нормальной беременностью ИО,¹⁶⁰ было идентифицировано 60 дифференциально экспрессируемых белков. Эти белки связаны с репарацией (восстановлением) белков, цитоскелетом, передачей сигналов, иммунной системой и метаболизмом.¹⁶⁰ Эти исследователи подтвердили аномальные уровни экспрессии нескольких предполагаемых дифференциально экспрессируемых белков, включая TIMP2, в SCNT-плаценте, которые, как известно, играют важную роль в развитии плаценты.

Долгосрочное влияние на жизнеспособность телят

Телята, полученные в результате переноса эмбрионов IVP или SCNT, дожившие до родов, могут по-прежнему демонстрировать ухудшение здоровья. У этих телят могут быть врожденные проблемы, такие как гипоплазия мозжечка, респираторная недостаточность и увеличение сердца.⁵⁹ Несмотря на различия в массе тела при рождении между телятами, полученными в результате переноса IVP и in vivo эмбрионов, на скорость постнатального роста и массу годовалых телят не влиял источник эмбриона или масса при рождении.^33,139

Клонированные телята также могут проявлять аномалии в течение первых нескольких месяцев жизни. Средний объем эритроцитов у клонированных телят был выше при рождении, а в течение первой недели после рождения температура тела и концентрации лептина в плазме были выше, а уровни тироксина ниже у клонированных телят по сравнению с контрольной группой.⁵² Интересно, что в этом исследовании повышенная температура тела наблюдалась, по крайней мере, до 50 дней после родов. Другие зарегистрированные различия у клонированных телят включают различную длину теломер (концевых участков хромосом) у клонированных телят, связанную с разными типами донорских ядер клеток¹⁶¹ , и более позднее начало полового созревания у клонированных телок по сравнению с контрольными животными от ИО.¹⁶² У быков, полученных в результате переноса эмбрионов IVP, которые были слишком крупными при рождении, было зарегистрировано увеличение веса сердца на килограмм веса тела при убое.¹³⁹ Таким образом, несмотря на то, что они выглядят здоровыми, эти данные свидетельствуют о том, что по крайней мере часть телят, полученных в результате переноса эмбрионов IVP и SCNT, не является физиологически нормальными в течение первых нескольких месяцев жизни.

Хотя АОS наблюдается при большом количестве клонированных беременностей, некоторые особи рожают нормально и после родов не требуют особой ветеринарной помощи. Несмотря на различие в весе при рождении в 24% между телятами, полученными от эмбрионов SCNT и контрольной группы in vivo, ускоренный рост и вариабельность веса не продолжались во время постнатального развития и составляли менее 5% в возрасте 1 года.³³ Те клоны, которые доживают до зрелого возраста, по-видимому, имеют нормальную репродуктивную функцию и потомство. Клонированные телки, использованные в программе эмбриотрансфера, имели уровни производства эмбрионов, аналогичные контрольным, а также нормальные показатели воспроизводства и отела.⁴⁹ Аналогичным образом было обнаружено, что клоны взрослых самцов дают сперму хорошего качества с нормальной фертильностью при ИО. Кроме того, потомство нескольких клонированных взрослых особей в этом исследовании также показало нормальные репродуктивные показатели и молочную продуктивность.⁴⁹

Ряд исследований практически не выявили различий в скорости роста, продолжительности эстрального цикла, гормональных профилях, включая лютеинизирующий гормон (ЛГ), ФСГ, E2, P4, IGF1 и гормон роста, а также в характеристиках лактации и общей репродуктивной способности клонов по сравнению с неклонированными телятами того же возраста.^15,33,52,163 Кроме того, было обнаружено, что производство молока и мяса клонированным рогатым скотом было таким же, как и у крупного рогатого скота, полученного путем ИО.^164-166 Таким образом, хотя перенос IVP- или SCNTэмбрионов может быть связан с широким спектром аномалий во время беременности и даже после родов, телята, дожившие до взрослого возраста, могут вести здоровую продуктивную жизнь.

Механизмы, лежащие в основе AOS

Изначально предполагалось, что аномалии, наблюдаемые у эмбрионов, плодов, плаценты и потомства крс, полученного путем переноса эмбрионов IVP или SCNT, являются результатом эпигенетической дисрегуляции и последующей аберрантной экспрессии мРНК важных для развития импринтированных генов.^{63,105,167,168} Импринтированные гены экспрессируются моноаллельно, в зависимости от того, от какого родителя поступили аллели, в результате эпигенетических модификаций.¹⁶⁹ Эпигенетические модификации - это химические изменения ДНК или гистоновых белков, которые изменяют структуру хроматина без изменения нуклеотидной последовательности.¹⁷⁰ Эмбрионы, полученные из IVP и SCNT, подвергаются воздействию среды IVC, которая, как считается, нарушает приобретение или поддержание эпигенетических паттернов, регулирующих экспрессию импринтированных генов.^{115, 171, 172} В дополнение к повреждениям под действием среды IVC, SCNT-эмбрионы также должны преодолеть разрыв зоны, потерю материнской цитоплазмы и цитоскелета, электрическое или химическое слияние и активацию энуклеированного ооцита с донорской клеткой, а также эпигенетическое перепрограммирование донорского ядра в тотипотентное состояние (способность одной клетки делиться и производить все дифференцированные клетки в организме. Полностью дифференцированная клетка может вернуться в состояние тотипотентности, что и происходит при клонировании) .¹⁷³ Другой источник эпигенетической дисрегуляции, способствующий аномальным фенотипам, связанным с AOS, может возникать в результате аспирации и IVM ( дозревание in vitro) ооцитов крупного рогатого скота перед манипуляциями IVP или SCNT. Приобретение материнских эпигенетических модификаций, которые регулируют экспрессию импринтированных генов, происходит на последних стадиях развития фолликулов, в период, когда кумулюсооцитные комплексы аспирируются и могут также изменяться во время IVM.¹⁷⁴ Интересно, что многие импринтированные гены регулируют экспрессию не импринтированных генов. Следовательно, аномальные фенотипы могут возникать из-за аберрантной экспрессии неимпринтированных генов, возникающей вследствие эпигенетической дисрегуляции импринтированных генов.⁵⁹ Кроме того среда IVC и протоколы SCNT могут оказывать неблагоприятное влияние на модификации ДНК, регулирующие экспрессию неимпринтированных генов, независимо от геномного импринтинга.⁵⁹ Сложность потенциальных механизмов, лежащих в основе AOS, усугубляется наблюдением, что протоколы IVC и SCNT также негативно влияют на экспрессию генов, которые регулируют приобретение и поддержание эпигенетических модификаций, необходимых для соответствующей экспрессии импринтированных генов.

Эпигенетическая дисрегуляция импринтированных генов

Предполагается, что аномалии, наблюдаемые у эмбрионов, плодов, плаценты и потомства, полученного в результате переноса эмбрионов IVP или SCNT, являются результатом неадекватных условий IVC или неправильного эпигенетического репрограммирования во время процедур SCNT, ведущих к неправильному установлению или поддержанию эпигенетических паттернов, регулирующих экспрессию импринтированного гена в критические периоды доимплантационного развития.^{59,168,175,176}