Воспроизводство крупного рогатого скота

Другие факторы, такие как оценщик эмбрионов⁸⁹ и характеристики реципиента⁸⁶ , также могут влиять на успешное установление и поддержание беременности после переноса незамороженных in vivo и IVP эмбрионов крупного рогатого скота.

Эмбрионы крупного рогатого скота на предимплантационной стадии, полученные in vitro, отличаются по морфологии по сравнению с эмбрионами, полученными in vivo. При выращивании в среде, содержащей сыворотку, эмбрионы крс выглядят более темными, имеют менее организованную внутреннюю клеточную массу и менее компактны.^76,78 Эмбрионы IVP, независимо от того, производятся ли они в среде с сывороткой или без нее, имеют большее количество липидных капель, больше незрелых митохондрий и не демонстрируют сопоставимого увеличения плотности митохондрий при переходе от стадии морулы к стадии бластоцисты по сравнению с эмбрионами in vivo.^53,90–94

Общее количество клеток на бластоцист и распределение бластомеров во внутренней клеточной массе бластоцист также различаются между системами продуцирования in vitro и in vivo. Бластоцисты IVP демонстрируют меньшее число клеток и меньшую долю клеток, относящихся к внутренней клеточной массе.^94,95 Также существуют различия в степени аномальной плоидности (числа хромосом) среди бластомеров эмбрионов, полученных in vivo, по сравнению с их аналогами in vitro.⁹⁶ В то время как только 20-25% бластоцист из систем продуцирования in vivo демонстрируют миксоплоидию, приблизительно 45-70% бластоцист IVP были определены как миксоплоидные с частотой, зависящей от метода, используемого для определения числа хромосом.^97,98 Хотя эмбрионы, несущие повышенную долю миксоплоидии, могут успешно вынашиваться и поддерживать беременность,⁹⁶ резкое увеличение числа миксоплоидных бластомеров не способствует выживанию эмбрионов.⁹⁹

Ранние сравнения экспрессии генов предимплантационных эмбрионов крс, полученных in vivo и in vitro, продемонстрировали, что на экспрессию как импринтированных (активны только аллели от одного родителя) , так и не импринтированных генов может влиять продукция эмбрионов in vitro.^100–109 Дополнительное подтверждение гипотезе о том, что способность бластоцист устанавливать беременность связана с экспрессией определенных наборов генов, было предоставлено исследователями, которые проанализировали экспрессию мРНК из биопсийных образцов бластоцист, взятых до переноса эмбриона, и сопоставили ее с последующими событиями после переноса. Было обнаружено, что бластоцисты, которым не суждено установить беременность, экспрессируют повышенные уровни ингибитора имплантации CD9, а также воспалительных цитокинов фактора некроза опухоли (TNF) и мРНК, связанных с метаболизмом углеводов.¹¹⁰ Напротив, бластоцисты, перенос которых завершился рождением теленка, продемонстрировали повышенную экспрессию ряда специфических мРНК, в том числе некоторых, связанных с имплантацией (COX2, CDX2, PLAC8) и дифференцировкой (BMP15). Эти наблюдения согласуются с более ранним отчетом о корреляции профилей экспрессии мРНК с успешностью посттрансферной беременности пар демиэмбрионов (полуэмбрионы после разделения исходного эмбриона) , полученных путем расщепления бластоцист, полученных от суперовулированных коров-доноров.¹¹¹ Эти исследователи также отметили повышенную экспрессию PLAC8 у демиэмбрионов, чья двойная демибластоциста была связана с рождением теленка после переноса. Чтобы ответить на вопрос, когда профили мРНК, предсказывающие компетентность (способность к) в развитии, могут быть определены во время развития, Held et al.¹¹² оценили характер экспрессии мРНК у изолированных бластомеров из двухклеточных IVP-эмбрионов крупного рогатого скота с компетентностью в развитии их сестринских бластомеров.

Эти исследователи определили, что сестринские бластомеры, которым суждено развиться до стадии бластоцисты, экспрессировали повышенные уровни мРНК, связанные с реакциями на окислительный стресс, антиоксидантной активностью и окислительным фосфорилированием.¹¹² В совокупности эти наблюдения подтверждают, что сигнатуры мРНК эмбрионов на различных стадиях развития могут быть связаны как с исходом развития до, так и после переноса. Более того, они согласуются с гипотезой о том, что в будущем также могут быть идентифицированы специфические сигнатуры мРНК у эмбрионов, предназначенных для демонстрации определенных подтипов AOS после переноса эмбриона. Это, в свою очередь, поддержит разработку процедур скрининга эмбрионов перед переносом или усовершенствование методов получения эмбрионов in vitro для устранения возникновения АОС. Например, было продемонстрировано, что включение в среду, используемую для производства эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, специальных добавок, включая инсулиноподобный фактор роста (IGF)-1, колонистимулирующий фактор (CSF)-2 и гиалуронан, увеличивает процент стельностей после переноса.¹¹³ Интересно, что добавление CSF2 в культуральную среду устраняет возможность потери эмбриона до 35 дня беременности (тип I AOS); однако, количество наблюдений в этом исследовании было несколько ограниченным.¹¹³

Пери-имплантационное развитие

Подсчитано, что у молочных коров со средней продуктивностью наблюдается около 40% эмбриональной и плодной смертности; около 70–80% этих потерь приходится на период с 8 по 16 день стельности.¹¹⁴ Материнское распознавание беременности у крупного рогатого скота происходит примерно на 15-16 день беременности и требует адекватной экспрессии тау-интерферона (IFN) в развивающемся концептусе для предотвращения лютеолитического каскада.^115,116 Более высокий уровень потерь наблюдаются в периимплантационном периоде среди концептов после переноса IVP-эмбрионов.^{53,105,117,118} Сходным образом значительная потеря эмбрионов была зарегистрирована в течение 2-х недель после переноса IVP- и SCNT- эмбрионов, хотя часть этих потерь может быть связана с трудностями в восстановлении этих концептов. Например, после переноса IVP-эмбрионов наблюдалось 51,2% выживляемость на 12-й день и 33–38% на 14-й день.^105,119 На 14-й день было потеряно 75% перенесенных эмбрионов IVP по сравнению с 85– 93% эмбрионов SCNT.¹¹⁸ На 25-й день беременности было обнаружено только 19% и 15% концептов, полученных из IVP и клонированных эмбрионов, соответственно, по сравнению с 67% концептов, полученных с помощью ИО.¹²⁰

В дополнение к более низким показателям выживаемости концептов, полученных из IVP-эмбрионов, также обнаруживают некоторые морфологические отличия от таковых, полученных in vivo. У концептов, полученных из эмбрионов IVP, извлеченных на 17й день гестации, наблюдалась повышенная частота фрагментации и/ или дегенерации по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo.⁴⁵ Кроме того, концепты IVP также длиннее, чем концепты, полученные in vivo, как на 12-й, так и на 17-й день гестации.^105,117 Напротив, другие исследователи не обнаружили статистической разницы в уровне выживаемости интактных концептов на 16-й день между IVP и in vivo группами; тем не менее, они сообщили, что было больше целых структур или дегенерированных невылупившихся эмбрионов, извлеченных в группе IVP по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo.¹⁰⁴

В этом исследовании концепты, полученные из IVP-эмбрионов и извлеченные на 16-й день беременности, имели меньшие эмбриональные диски и, как правило, имели более короткую длину трофобласта по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo. Различия в длине концепцов между исследованиями можно объяснить различиями в условиях in vitro, используемых при получении эмбрионов, а также временем восстановления относительно признания беременности матерью.

По сравнению с концептами, полученными в результате переноса IVP-эмбрионов, среди эмбрионов SCNT на 20% меньше концептов имели эмбриональный диск при имплантации на 17-й день.¹²¹ Скорость имплантации обычно выше, если эмбриональный диск обнаружен без признаков дегенерации концепта.¹¹⁹ Условия культивирования могут влиять на присутствие эмбрионального диска в развивающихся концептах; в одном исследовании сообщается о более высоком проценте присутствия эмбриональных дисков при использовании среды KSOM (72%) по сравнению со средой SOF (46%).

119

Периимплантационные концепты, полученные из IVP- или SCNTэмбрионов, могут иметь разные онтогенетические и ультраструктурные свойства.¹¹⁸ И IVP, и SCNT концепты имели задержку в развитии на 14-й и 21-й день по сравнению с ожидаемым графиком развития, описанным для концептов in vivo.¹¹⁸ При сравнении концептов от эмбрионов, происходящих от IVP и SCNT-эмбрионов, концепты SCNT на 14-й и 21й дни беременности были короче по длине и демонстрировали больше ультраструктурных дефектов в обоих временных точках по сравнению с IVP-концептами.¹¹⁸ Например, SCNT-концепты демонстрируют более частое возникновение апоптоза, больше вакуолей, меньше митохондрий в гипобласте, разрушение базальной мембраны между гипобластом и эпибластом, менее выраженные межклеточные контакты между клетками трофэктодермы, меньшее количество десмосом и меньшее количество полирибосом.

Между концептами, полученными в результате переноса IVP- или in vivo-эмбрионов, наблюдались различия в экспрессии генов.¹⁰⁴ Например, контрольные эмбрионы in vivo показали временное снижение транскрипционной активности с 7 по 16 день, чего не наблюдалось в этот период у эмбрионов IVP. Более того, на 16-й день беременности концепты от эмбрионов, полученных из IVP, имели более высокую экспрессию транскрипта мРНК IGF1R по сравнению с in vivoконтролем.¹⁰⁴ В то время как бластоцисты IVP на 7 день имели более низкий относительный уровень транскрипта IFN-t au по сравнению с контрольными in vivo бластцистами, концепты IVP на 16 день с задержкой развития имели большее содержание мРНК IFN-t au.¹⁰⁴

По сравнению с концептами IVP, концепты, полученные в результате переноса SCNT-эмбрионов, не обладали экспрессией NANOG и FGF4 и сверхэкспрессировали мРНК IFN-tau на 17-й день гестации.¹²¹ Используя индивидуальный микрочип, было идентифицировано 47 генов, которые по-разному экспрессируются на 17-й день между концептами из эмбрионов SCNT и IVP. Кроме того, экспрессия генов, участвующих в пролиферации трофобластов (Mash2), дифференцировке (Hand1) и функции трофобластов (PAG9), была изменена в концептах SCNT на 17й день по сравнению с концептами из IVP или ИО.¹²² На 25-й день беременности концепты, полученные из IVP или NT-эмбрионов, имели более высокую экспрессию мРНК IGF1 по сравнению с контрольнями, полученными посредством ИО. Кроме того, концепты, полученные из эмбрионов SCNT, имели более высокую экспрессию мРНК IGF2, чем концепты, полученные из IVP.¹²⁰ Интересно отметить, что профили экспрессии генов эндометрия матки при вынашивании эмбрионов SCNT и IVP, различаются.¹²³ Эти наблюдения подтверждают предположение о том, что во время периимплантационного периода аномальная связь эмбриона с матерью может быть ответственной за измененный фенотип у клонированных животных.¹²³

Фактически, изменения в экспрессии генов, жизненно важных для нормальной дифференцировки трофобластов и последующего развития плаценты, связанные с IVP и SCNT, могут быть фактором, способствующим увеличению потерь беременности и другим аномалиям, наблюдаемым на более позднем этапе развития.

Развитие плода

Развитие плода после переноса эмбрионов IVP или SCNT связано с повышенной смертностью и множеством аномалий. После периода эмбриональных потерь у крупного рогатого скота плоды, полученные из эмбрионов IVP или SCNT, испытывают более высокие показатели гестационных потерь по сравнению с плодами, полученными in vivo (Рисунок 67.4). Крупномасштабное исследование, анализирующее результаты более 30 наборов данных по IVP и SCNT, показало, что после поправки на такие эффекты, как время года, родство и пол теленка, потери плода были выше для эмбрионов IVP и SCNT по сравнению с беременностями от ИО или переноса эмбрионов.⁵⁵ Кроме того, у телят IVP и SCNT наблюдался более длительный срок гестации и более высокий вес при рождении, а также повышенная частота дистоции и перинатальных потерь по сравнению с телятами, полученными путем искусственного осеменения или трансплантации эмбрионов.

Более высокий уровень невынашивания беременности после переноса IVP-эмбрионов наблюдается в позднем эмбриональном периоде (30-й день) и раннем плодном периоде до 90-го дня беременности по сравнению с контролем in vivo.⁵⁹ В то время как частота выкидышей на сроке примерно от 2 месяцев беременности до доношенного срока составляет менее 10% у реципиентов, несущих in vivo-продуцированные эмбрионы,^124–126 эти потери могут быть в два-три раза больше у реципиентов, несущих эмбрионы IVP.^7,54,127,128 Беременности IVP сопровождаются гибелью эмбриона и плода, особенно между 30 и 65 днями гестации, при этом большая часть потерь происходит между 30 и 44 днями.¹²⁸ Для сравнения, беременность, полученная от эмбрионов in vivo, имела более низкие показатели смертности, которые распределялись более равномерно между 30 и 90 днями.¹²⁸ Кроме того, процент стельных на 60-й день гестации был на 42% ниже среди реципиентов с IVP-эмбрионами 1 степени развития по сравнению с таковыми у реципиентов с эмбрионами 1 степени, полученными in vivо.⁴⁵ Частота сохранения беременности на 50-60-й день гестации после переноса свежих эмбрионов IVP степени 1 (59%) была значительно ниже по сравнению с таковой у свежих in vivoпродуцированных эмбрионов 1 степени (76%).

In vivo
IVP
SCNT
День 7 День 30 День 60 День 90 Срок
Дни гестации
Уровень стельностей

Рисунок 67.4 Относительный период гестационных потерь после переноса эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo, in vitro (IVP) или путем переноса ядра соматических клеток (SCNT).

Однако, согласно данным крупномасштабного исследования, частота сохранения беременности между 90 и 150 днями гестации была одинаковой как для свежих, так и для замороженных IVPэмбрионов (43,5%).¹²⁹

Возникновение ранней смертности плода происходит еще чаще после переноса клонированных (NT и SCNT) эмбрионов. Потери от 50 до 100% беременностей при использовании клонированных эмбрионов могут происходить между 30 и 60 днями гестации, по сравнению с 2-10% потерей беременностей, полученных естественным путем, которые обычно происходят в этот период.^15, 20, 62, 130 Второй период высокого уровня потерь наступает во втором триместре беременности в случае клонированных эмбрионов.^15,62,131 Во многих из этих случаев у абортированных плодов отмечают мало грубых аномалий, в то время как плаценты часто имеют серьезные аномалии.^15,62,131 Клонированные беременности также могут подвергаться большим потерям в течение третьего триместра, часто характеризующимся плацентарными аномалиями, включая гидраллантоис, сокращенное количество плацентом и отек плацентарных оболочек.^15,62 Согласно результатам общенационального исследования выживаемости эмбрионов и телят, полученных с помощью SCNT с 1998 по 2007 г., проведенного в Японии, выживаемость SCNT-эмбрионов и телят не улучшилась за этот 10-летний период.¹³² Уровень подтвержденных стельностей на 30-й день после переноса эмбрионов SCNT варьировался от 21,6% до 32,9% и был ниже по сравнению с уровнем стельностей после переноса эмбрионов, полученных in vivo (50–52%) и эмбрионов IVP (37–46%).¹³²

Помимо увеличения частоты внутриутробной смертности, плоды, полученные из эмбрионов IVP и SCNT, демонстрируют множество морфологических аномалий на ранних сроках беременности. По сравнению с контрольной группой ИО, у плодов SCNT и IVP на 80-й день беременности была увеличена масса тела, масса печени и окружность грудной клетки.¹³³ Более того, эти исследователи обнаружили, что отношение копчико-теменной длины темени к окружности грудной клетки является определяющей морфологической характеристикой фенотипа непропорционального чрезмерного роста плода. У клонированных плодов уменьшение копчико-теменной длины и/или сердцебиение плода были предиктивными ультразвуковыми маркерами гибели плода, которая произошла примерно у 27% клонов, умерших до 90 дня беременности.⁴⁹ Эти исследователи отметили, что на основе ультразвуковых исследований после 100-го дня беременности факторы риска потери плодов, полученных из SCNT, включали отек плаценты, водянку и увеличение окружности живота.

Частота врожденных пороков развития, включая гидраллантоис и аномалии конечностей, повышена у телят от эмбрионов IVP (3,2%) по сравнению с контрольной группой ИО (0,7%).¹²⁹ На 90-й день гестации IVP-беременности были связаны с увеличением копчико-теменной длины плода и веса органов по сравнению с контролем in vivo.¹³⁴ На 180-й день гестации IVP-беременность была связана с бо'льшим весом матки, плаценты и плода по сравнению с контролем in vivo. Вес плода, его печени, сердца и вес плацентомы - все коррелировали и были значительно выше при IVP-беременностях.¹³⁴ На 222-й день гестации плоды от IVP-эмбрионов были на 17% крупнее, чем в контрольной группе, произведенной в естественных условиях, и демонстрировали значительное увеличение массы тела плода, размера сердца, веса сердца и длины длинных костей.⁴⁵ Кроме того, у плодов из IVPэмбрионов не наблюдалось разницы в общей массе висцеральных органов, но показатели скелетных мышц на килограмм массы тела были меньше по сравнению с плодами из группы in vivo, что позволяет предположить, что развитие плодов IVP непропорционально их массе тела.

Гистологически плоды IVP на 222-й день гестации демонстрировали значительно большее соотношение числа вторичных и первичных волокон скелетных мышц, чем в контрольной in vivo группе. Также пропорциональный объем ткани, присутствующей между миофибриллами, был больше в мышцах IVP-плодов по сравнению с контролем.¹³⁵ Экспрессия мРНК миостатина была снижена в скелетных мышцах плодов из группы IVP, в то время как экспрессия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) имела тенденцию к увеличению по сравнению с группой, полученной in vivo. Эти наблюдения согласуются с наблюдаемыми изменениями в соотношении мышечных волокон, поскольку миостатин является ингибитором развития мышечных волокон, а GAPDH является ключевым ферментом в гликолизе - пути, который активно используется вторичными мышечными волокнами.¹³⁵

Показатели перинатальной смертности 8,6–15,6% среди IVP- телят при рождении или вскоре после рождения были зарегистрированы у телок-реципиентов и достигали 17,9% у коров-реципиентов.^7,54,129 Напротив, уровень перинатальной смертности телят от ИО составлял приблизительно 6,2–9,0% для беременностей с переносом эмбрионов in vivo.^22,129 В одних исследованиях сообщалось об увеличении срока беременности для IVP-плодов¹²⁹ , в то время как в других - нет.⁴⁴ Частота мертворождений и перинатальной смертности в течение первых 48 часов после отела была увеличена у IVP-телят по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo, но не из-за изменения продолжительности беременности.¹³⁶ Мертворождение и послеродовая смертность также увеличивались при беременностях с SCNT. Только около 70% клонированных плодов крс выживают в перинатальном периоде, и эти потери, как правило, распространяются на первую неделю постнатальной жизни (см. ссылку 48). По данным национального опроса 2012 года, проведенного Министерством сельского хозяйства Японии, из 594 клонированных телят, родившихся в Японии в период с 1998 по 2007 год, 14,8% были мертворожденными, а 95% умерли в течение 24 часов после родов.¹³⁷ Частота отелов при SCNT-беременностях (5,1–12,6%) также была ниже, чем при переносе эмбрионов in vivo (23,9–34,8%) и IVP (20,2–22,3%).¹³² По данным 5- летней практики коммерческого клонирования в США, Аргентине и Бразилии,⁴⁹ из 3374 перенесенных эмбрионов SCNT, 41% были живы на 30-й день беременности, но только 9% от общего числа перенесенных эмбрионов привели к живорождению. Из этих 388 живых SCNT-телят около 42% умерли в период между родами и 150 днем жизни.⁴⁹ Эффективность клеточных линий для успешного получения жизнеспособных беременностей SCNT варьировалась от 0 до 45%, при этом около 24% клеточных линий не давали живых телят.⁴⁹

Наиболее заметными аномалиями, наблюдаемыми в перинатальном периоде после переноса эмбрионов IVP, являются появление телят с большой массой тела при рождении в сочетании с более широким распределением показателей массы тела при рождении по сравнению с контрольной группой in vivo. Высокий уровень перинатальных потерь, ассоциированный с IVP-беременностью, в значительной степени может быть связан с дистоцией, возникающей в результате крупноплодия.^44,59 Дистоция может иметь долгосрочные последствия для здоровья, продуктивности и будущей репродуктивной способности животных-реципиентов.⁵⁹ Высокий вес при рождении, связанный с пересадкой IVP-эмбрионов был зарегистрирован среди нескольких пород Bos taurus, включая голштинскую, ангусскую, симментальскую и японскую черную.^{55,129,136,138,139} Перенос IVP-продуцированных эмбрионов у индийского крупного рогатого скота породы Гир также привел к более высокому весу при рождении, чем в контрольной группе от ИО, особенно выраженном среди бычков.¹⁴⁰ Интересно, что IVP-телята показали не только более высокий вес при рождении, но и повышенные концентрации фруктозы в плазме после рождения по сравнению с контрольной группой in vivo.¹³⁴ Эти факторы, повидимому, связаны с метаболическим расстройством у IVP-телят.