Воспроизводство крупного рогатого скота

8
In vivo
7
In vivo
6
5
4
3
2
1
0
2001 2003 2005 2007 2009 2011
Год
5(× 10)Количество пересадок эмбрионов

Рисунок 67.1 Количество коммерческих трансферов in vivo или in vitro эмбрионов крупного рогатого скота во всем мире в период с 2001 по 2011 гг.

Пересечение исследований в этих областях быстро привело к применению манипуляций с бычьими эмбрионами in vitro в попытке повысить эффективность коммерческого производства, сначала за счет применения расщепления эмбриона, а затем за счет клонирования эмбриона или переноса ядра (NT). Для разделения эмбрионы извлекали нехирургическим путем, обычно на стадии развития от морулы до ранней бластоцисты, делили пополам для получения однояйцевых близнецов и переносили в течение нескольких часов подходящим самкам-реципиентам нехирургическими методами.^27–29 Расщепление и другие методы биопсии также применялись для определения пола эмбриона: один полученный демиэмбрион переносили, а другая часть использовалась для определения пола.³⁰ Поскольку после этих процедур впоследствии получали телят, не было сообщений об аномалиях развития потомства, полученных в результате использования этих методов. В отличие от разделенных пополам эмбрионов, развитие эмбрионов, продуцируемых NT с использованием эмбриональных бластомеров в качестве источника донорских ядер²⁶ , по сообщениям, привело к получению потомства слишком большого размера и аномальному развитию плода и плаценты.^31–33

Одновременно с развитием технологий интенсивной обработки, таких как бисекция эмбриона (деление пополам) и NT, также были разработаны методы успешного оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота in vitro³⁴ или успешного созревания in vitro, оплодотворения in vitro и культивирования бычьих эмбрионов in vitro до стадии развития от 8 до 16 клеток.^35,36 Но было перенесено и несколько эмбрионов крс IVP, потому что их нельзя было культивировать дальше стадии развития 8-16 клеток in vitro.^37,38 Поскольку к тому времени нехирургический перенос эмбрионов стал отраслевым стандартом, подходящими кандидатами для переноса считались только эмбрионы на стадиях развития морулы (32–64 клетки) или бластоцисты (100–128+ клетки). В конце 1980-х годов использовался метод сокультивирования яйцеводных клеток в качестве метода успешного преодоления задержки развития культивируемых эмбрионов крупного рогатого скота на стадии от 8 до 16 клеток.³⁹ В течение последующего десятилетия 1990-х эмбрионы крупного рогатого скота на стадии бластоцисты регулярно получали из ооцитов, полностью созревших in vitro, оплодотворенных in vitro и культивированных in vitro.^40–42

Ранние неофициальные сообщения о развитии телят, полученных путем переноса эмбрионов IVP³⁸ , первоначально предполагали потери беременности во втором и третьем триместрах.

Аналогичным образом, в отчете о развитии зигот овец, продуцируемых in vivo и извлеченных хирургическим путем из яйцевода, которые затем культивировались in vitro в течение 5 дней⁴³ , продемонстрировано, что длительное воздействие на эмбрионы условий in vitro перед пересадкой привело к увеличению продолжительности беременности, увеличению веса ягнят при рождении и более высокой смертности по сравнению с контрольной группой, не подвергшейся культивированию. В 1995 г. были опубликованы три статьи^44–46 , в которых задокументировано формирование слишком крупных плодов или телят в результате переноса IVP-эмбрионов крупного рогатого скота. Кроме того, повышение перинатальной смертности было связано с получением плодов и телят в результате переноса эмбрионов, полученных in vitro (44,45). В каждом из этих случаев созревание ооцитов in vitro использовалось в сочетании с оплодотворением in vitro и культивированием in vitro (IVC) для получения изученных эмбрионов, плодов и телят. Это смешение сделало невозможным определение влияния отдельных компонентов процесса in vitro на формирование крупных плодов и телят. Таким образом, невозможно четко определить, была ли только IVC ответственна за появление крупногабаритных особей крс, как предполагалось на основе данных по овцам⁴⁷ , или же другие компоненты производственного процесса in vitro также внесли свой вклад. В совокупности эти наблюдения были первыми, позволившими предположить, что манипуляции с окружающей средой во время созревания, оплодотворения и предимплантационного культивирования in vitro способствуют изменениям в последующем гестационном и перинатальном развитии. Более того, изменения развития во многом напоминали те, что наблюдались у некоторых потомков крс, полученных в результате клонирования бластомеров (NT)^31–33 и, позже, SCNT.^15,48,49

Система классификации синдрома аномального потомства

Как отмечалось выше, перенос эмбрионов крупного рогатого скота, подвергшихся манипуляции IVP, NT или SCNT, приводит к появлению части концептуальных клеток, плодов или потомков, у которых обнаруживаются аномалии развития или аномалии в связанных с ними плацентарных тканях.^{32,44,45,50,51} Поскольку чрезмерный рост плода или потомства был наиболее ярким наблюдением, первоначально идентифицированным как результат переноса эмбрионов IVP или SCNT, этот феномен первоначально стал известен как «синдром крупного потомства».^{31–33,44,47,50} Но по мере того, как все больше исследователей начали изучать этот феномен, стало ясно, что не все беременности от эмбрионов IVP и SCNT приводят к фенотипам, демонстрирующим чрезмерный рост плода.^52–58 Поэтому термин «синдром аномального потомства» (AOS) был использован для более точного описания ряда характеристик, связанных с этим синдромом.⁵⁹

Аббревиатура этого синдрома - AOS используется при обсуждении аномалий развития, связанных с манипуляциями с эмбрионами in vitro у других видов млекопитающих. У свиней, например, фенотип чрезмерного роста не был связан с SCNT.^60,61 Однако, клонированные свиньи могут демонстрировать другие отклонения в развитии, которые все же можно было бы описать как AOS.⁶⁰ Поскольку этиология AOS-подобных характеристик связана с эпигенетическими изменениями генома в результате манипуляций с эмбрионом in vitro, признание того, что AOS встречается у различных видов млекопитающих, а не только у крупного рогатого скота и овец, поможет в дальнейшем определении всех аспектов этого синдрома.

Гестационный период Неонатальный Теленок
период
Потеря Компенсация при
беременности при АОС типа IV и
AOS типа I до 42 дня Потеря выживание телят
беременности при
AOS типа II на 42–
280 день AOS типа III на
поздних сроках
беременности или
неонатальные потери

Рисунок 67.2 Классификация подтипов синдрома аномального потомства (AOS).

Признаки, связанные с AOS у крупного рогатого скота, были распределены на четыре типа⁵⁹ (рис. 67.2). При AOS I типа аномалии проявляются при установлении беременности. У крупного рогатого скота это происходит в период между 0 и 42 днями беременности, когда происходит органогенез. При AOS типа II возникают аномалии, которые связаны с неспособностью поддерживать фетоплацентарную единицу, что приводит к аборту в период после органогенеза до доношенного срока, а именно между 42 и 280 днями беременности у крупного рогатого скота. При AOS III типа в фетоплацентарной единице может возникнуть ряд аномалий, которые менее серьезны или допускают компенчацию плодом и плацентой, что позволяет беременности дойти до срока; однако, во время родов или в неонатальном периоде плод не выживает, что приводит к неонатальным потерям. Эти невыжившие потомки демонстрируют измененные клинические, гематологические или биохимические параметры. При AOS IV типа в фетоплацентарном развитии так же может возникнуть ряд аномалий, которые либо менее серьезны, либо допускают компенсацию за счет плода и плаценты. В этом случае беременность удается доносить, а новорожденный теленок выживает; однако потомство может все еще демонстрировать отличия в анатомии, физиологии или метаболизме по сравнению с животными от эмбрионов без вмешательства.

Производство эмбрионов in vitro связано с более высокой частотой потерь в раннем и среднем гестационного возрасте.^45,59 Эти случаи представляют собой AOS типа II, при этом потери беременности обычно происходят между 40 и 90 днями гестации.⁴⁵ Точно так же большинство беременностей SCNT прерываются между 40 и 90 днями гестации^15,62 и также могут быть классифицированы как AOS типа II. В этом случае потери обычно связаны с неправильным развитием плаценты.⁶² Когда беременность с SCNT действительно сохраняется, у 65–70% новорожденных обнаруживается какая-либо форма AOS, и их состояние классифицируется как AOS типа III или IV. В некоторых случаях для поддержки выживания новорожденного требуется интенсивная терапия, без которой новорожденный, как правило, не выживает (тип III AOS), тогда как в других случаях требуется небольшая помощь или не требуется вовсе (тип IV AOS).⁵⁷

Характеристики, связанные с AOS в период

развития крупного рогатого скота

У крупного рогатого скота выраженность аномалий, связанных с АОС, может варьироваться от изменений экспрессии генов в эмбрионах на доимплантационной стадии⁶³ до умеренных изменений с незначительными очевидными фенотипическими проявлениями⁵⁷ и серьезных изменений фенотипа, сопровождающихся абортом или неонатальной смертью^59,62,64 (рис. 67.3).

На экспрессию AOS влияют условия культивирования,^58,65,66 вид животного,⁶¹ степень манипуляции с эмбрионом,^15,67 и даже уровни материнских питательных веществ.⁶⁸ На любой конкретной стадии развития каждый эмбрион, плод или теленок не проявляет единообразного набора характеристик AOS. Поэтому мы стремились собрать данные наблюдений об изменении характеристик, связанных с манипуляциями с эмбрионами крупного рогатого скота in vitro, на различных стадиях развития. Однако, в каждом случае не всегда было установлено прямое соответствие между типом манипуляции, измененной характеристикой и возникновением AOS.

Гаметы

Сперматозоиды

Существует ограниченное количество сообщений, в которых предполагается, что изменения в среде для обработки сперматозоидов in vitro до оплодотворения могут быть связаны с аномалиями в последующем развитии эмбриона.^69,70 Например, воздействие на сперму быка поливинилпирролидона (ПВП), агента, обычно включаемого в среду для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов,⁷⁰ увеличивало частоту акросомной реакции сперматозоидов после 30 или 60 минут воздействия ПВП и уменьшало долю ооцитов, оплодотворенных ПВП-обработанной спермой, после совместной инкубации с ооцитами, созревшими in vitro.⁶⁹ Однако неясно, оказало ли воздействие ПВП на сперматозоиды до оплодотворения какое-либо влияние на последующее развитие образующихся зигот с точки зрения морфологии, времени расщепления, времени образования бластоцелей или внутренней клеточной массы и количества клеток трофобласта.

Ооциты

Ооциты на стадии метафазы II мейоза выходят из преовуляторных фолликулов, которые у крупного рогатого скота обычно составляют от 18 до 22 мм в диаметре. В отличие от многоплодных видов, таких как свиньи, у крупного рогатого скота технически сложно получить большое количество созревших in vivo ооцитов для лабораторных манипуляций. Следовательно, ооциты крупного рогатого скота, используемые как для процедур IVP, так и для SCNT, созревают in vitro. Ооциты коров, используемые для систем продуцирования in vitro, как правило получают из фолликулов диаметром 2–10 мм, и восстанавливают на стадии диктиотены (форма диплотены профазы I деления мейоза, характеризующаяся большей продолжительностью (до нескольких месяцев и даже лет) в связи с прохождением этапа вителлогенеза - накопления желтка) в профазе I мейоза.

Эмбрион Концепт Плод
Выживаемости эмбриона Выживаемости концепта Смертности плода
Общего числа клеток Вырождение/ фрагментация Массы тела
Аномальная плоидность Изменение длины трофобласта Измененное развитие органов
Измененная экспрессия Измененная экспрессия генов Измененный метаболизм
генов Измененная экспрессия генов
Плацента Теленок Реципиент
Масса плаценты Перинатальной смертности Абортов
Аномальные плацентомы Веса при рождении Продолжит. беременности
Аномальная сосудистая сеть Врожденных дефектов Дистоции/кесарева сечения
Водянка Респираторных проблем Измененная экспрессия
Гидроаллантоис Измененное соотношение эндометриального гена
Измененная экспрессия генов полов

Рисунок 67.3 Выявление аномалий, обычно связанных с синдромом аномального потомства (AOS). В отдельных случаях каждая из перечисленных аномалий может присутствовать или отсутствовать.

Эти диктиатные ооциты должны быть подвергнуты созреванию in vitro (IVM) на протяжении 20–24 часов, в течение которых они достигают стадии метафазы II мейоза и становятся готовыми к оплодотворению. В то время как 50–80% созревших in vivo ооцитов развиваются до стадии бластоцисты после оплодотворения, только 15-40% созревших in vitro ооцитов достигают стадии бластоцисты в стандартных системах продуцирования in vitro.^71–75 Более того, бластоцисты из ооцитов, созревших in vitro, имеют меньшеее количество клеток на эмбрион⁷⁵ и во внутренней клеточной массе^76– 78, чем бластоцисты из ооцитов, созревших in vivo. Таким образом, развитие трансгенных бластоцист было больше из ооцитов, созревших in vivo, по сравнению с ооцитами, созревшими in vitro.⁷⁹ У овец больше беременностей было произведено из бластоцист SCNT, полученных из созревших in vivo цитопластов ооцитов, по сравнению с бластоцистами SCNT из цитопластов ооцитов, созревших in vitro.

Напротив, не было разницы в частоте наступления беременности после переноса трансгенных эмбрионов на стадиях морулы или бластоцисты в зависимости от того, были ли они из условий созревания in vivo или in vitro.⁷⁹ Но для трансгенных бластоцист, полученных из ооцитов крупного рогатого скота, созревших in vivo, по сравнению с ооцитами, созревшими in vitro, наблюдалась разница в соотношении полов у телят, с более высоким процентом самцов, рожденных в группе созревших in vitro по сравнению с группой, оплодотворенной in vivo.⁷⁹ Интересно, что средний вес при рождении самцов или самок трансгенных телят в результате переноса бластоцист, полученных из ооцитов, созревших in vitro, был значительно выше, чем у телят самцов или самок из бластоцист, полученных из ооцитов, созревших in vivo.⁷⁹ Кроме того, 48% телят из ооцитов, созревших in vitro, имели при рождении 45 кг или более, тогда как только 19% телят из ооцитов, продуцированных in vivo, имели при рождении 45 кг или более. Наконец, телята-самки, полученные из ооцитов, созревших in vitro, были значительно тяжелее телят-самцов, полученных из ооцитов, созревших in vivo. В совокупности наблюдения как по крупному рогатому скоту, так и по овцам подтверждают вывод о том, что различия между условиями созревания ооцитов in vitro и in vivo играют важную роль в определении возникновения, по крайней мере, IV типа AOS, а также, возможно, других подтипов AOS.

К другим факторам, которые могут повлиять на нормальное развитие ооцитов, относятся балл упитанности и кормление.⁸¹ Ооциты, полученные от телок в умеренной кондиции, которые получали рацион с высоким уровнем обменной энергии, показали снижение выхода бластоцист IVP, в то время как ооциты телок, которые находились в низкой кондиции при таком же высоком уровне пищевой энергии, показали улучшенное развитие бластоцист in vitro.⁸¹ Ооциты телок на рационах, предназначенных для выработки повышенных уровней аммиака в плазме, продемонстрировали снижение компетентности (способности) к развитию in vitro (от стадии расщепления на 2 клетки до стадии бластоцисты) по сравнению с контрольной группой.⁸² У овец эмбрионы, полученные in vitro из ооцитов, подвергшихся in vivo воздействию повышенного содержания кормового азота мочевины, продемонстрировали снижение частоты наступления беременности после переноса.⁶⁸ Взятые вместе, эти наблюдения дают представление о возможных механизмах, объясняющих ранние наблюдения того, что диеты с высоким содержанием белка связаны со снижением плодовитости молочного скота⁸³ , а также дают представление о потенциальных механизмах, способствующих возникновению АОС типа I.

Преимплантационное развитие

У крупного рогатого скота эмбрионы обычно переносятся на 7-й день беременности на стадии развития бластоцисты. Наибольшая потеря стельности у крупного рогатого скота происходит в течение первых 2–3 недель беременности, при этом большая часть потерь приходится на 8–16-й день.⁸⁴ По сравнению с ИО или переносом эмбрионов, произведенных in vivo, эмбрионы IVP могут демонстрировать даже более высокие показатели ранней эмбриональной гибели; однако, это может зависеть от качества перенесенного эмбриона. Например, коэффициенты выживаемости для эмбрионов крупного рогатого скота 1 степени качества были одинаковыми независимо от того, получены ли они in vivo или in vitro; но для эмбрионов 2-го уровня качества выживаемость была ниже, если они были получены из систем производства in vitro.⁴⁵ Процент стельностей и процент отелов после переноса эмбрионов IVP различаются как между лабораториями, так и внутри них, хотя они могут быть ниже, чем те, которые наблюдаются после ИО или переноса эмбрионов, полученных in vivo.^{54,55,85–88}