Воспроизводство крупного рогатого скота

У растущего плода появляются примордиальные половые клетки, которые мигрируют к генитальному гребню, претерпевая митотическое деление. В этот период их ДНК подвергается полному деметилированию. DNMT3A, 3B и 3L являются de novo метилтрансферазами, которые функционируют для установления полоспецифичных паттернов метилирования локусов импринтированных генов во время гаметогенеза.^168,174,212

Материнские импринты (или отпечатки - специфическая память родительского происхождения хромосом) приобретаются постнатально во время фолликулогенеза, что совпадает с ростом глобального метилирования ДНК, которое достигает своего максимума перед овуляцией в полностью выросших ооцитах, которые задерживаются на стадии диктиата (GV) (или стадии покоя, когда первичные ооциты перестают делиться) .^213,214 Напротив, отцовские импринты устанавливаются еще до рождения в половых клетках развивающегося самца.¹⁷⁶ В зиготе отцовский геном подвергается активному деметилированию ДНК, которое происходит быстро после оплодотворения.^176,212 Для сравнения, деметилирование материнского генома происходит пассивно из-за исключения DNMT1 из ядра во время ранних делений расщепления.¹⁷⁶ DNMT1 отвечает за поддержание паттернов метилирования во время репликации ДНК.²¹⁵ В то время как глобальное деметилирование ДНК происходит в родительских геномах ранней зиготы, следы полоспецифического метилирования сохраняются. Считается, что у мышей материнский и отцовский импринты поддерживаются в зиготе с помощью ооцит-специфической изоформы DNMT1, обозначенной как DNMT1o.²¹⁶ Однако, у крупного рогатого скота эта изоформа ооцита не была идентифицирована.^217,218 У мышей протеин DNMT1 присутствует в фолликулах на ранних стадиях, а затем переходит в цитоплазму на более поздних этапах дифференцировки ооцитов и раннего эмбриогенеза.^219,220 Считается, что деметилирование родительского генома происходит в результате исключения DNMT1 из ядра во время ранних делений дробления.¹⁷⁵ У крупного рогатого скота новообразованный эмбриональный геном реметилируется по мере перехода к стадии бластоцисты под действием метилтрансфераз de novo DNMT3A, 3B и 3 L.^{168, 174, 176, 212}

У эмбрионов, продуцируемых in vivo, активное деметилирование отцовского генома и пассивное деметилирование материнского генома приводит к гипометилированию в период раннего дробления.^175,221 Когда эмбрион достигает стадии бластоцисты, метилирование de novo совпадает с дифференцировкой клеток, участвующих в формировании внутренней клеточной массы и трофэктодермы. Таким образом, устанавливаются тканевые и временно-специфические паттерны метилирования, которые будут передаваться на протяжении всего развития.^212,222,223 Поскольку DNMT отвечают за стирание, приобретение и поддержание импринтов метилирования в гаметах, а также за создание и поддержание паттернов метилирования ДНК во время эпигенетического репрограммирования эмбриона, было высказано предположение, что аномалии, связанные с AOS после переноса эмбрионов IVP или SCNT могут быть результатом аномальной экспрессии или функции DNMT.^224–226 Измененная экспрессия мРНК DNMT1 и DNMT3a наблюдалась у эмбрионов IVP и SCNT перед имплантацией⁶³ , что еще раз подтверждает гипотезу о том, что нарушение регуляции DNMT приводит к каскаду аберрантной экспрессии импринтированных генов и последующим аномалиям развития.⁶³ Дополнительные нарушения могут возникать из-за изменений структуры хроматина и модификаций гистонов, которые могут способствовать нарушению доступа DNMT к геному во время развития.⁵⁹

Эмбрионы SCNT крупного рогатого скота демонстрируют гиперметилированную ДНК по сравнению с эмбрионами in vivo - ситуация, которая напоминает статус метилирования соматической донорской клетки.^{187,224,227,228}

У SCNT-эмбрионов крупного рогатого скота деметилирование ДНК не происходит после 2-клеточной стадии.¹⁷⁵ Таким образом, некоторые сбои в развитии беременностей с SCNT могут возникать из-за неправильного деметилирования ДНК с последующим поддержанием гиперметилированного состояния клеток линии трофэктодермы, что приводит к аберрантной экспрессии генов и аномалиям плаценты.^{223,224,229,230} Действительно, экспрессия мРНК DNMT1 и уровни метилирования ДНК были значительно выше на всех предимплантационных этапах у SCNT-эмбрионов по сравнению с контрольными IVP-эмбрионами.²²³ Когда уровень транскриптов DNMT1 снизился за счет встраивания siRNA для DNMT1, метилирование уменьшилось, и количество эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, значительно увеличилось.²²³ В аналогичном исследовании SCNT-эмбрионы с пониженным уровнем siRNA DNMT1 показали рост до стадии бластоцисты, хотя не было никаких различий в их развитии до доношенного срока.²¹⁷

Ооцит-зависимые эпигенетические аномалии

Аберрантные эпигенетические модификации, ведущие к аномалиям у эмбрионов, плодов и плаценты после переноса эмбрионов IVP или SCNT, могут первоначально возникать в гаметах. Больше внимания уделяется оценке потенциальных аберраций импринтингового статуса генов в ооците, а не в сперматозоидах, поскольку ооциты млекопитающих начинают приобретать свои материнские отпечатки (импринты) во время фолликулогенеза и завершают во время созревания ооцитов, происходящего непосредственно перед овуляцией.²³¹ Для сравнения, сперматозоиды приобретают отцовские отпечатки in vivo во время сперматогенеза, и их ДНК упакована в очень защищенном виде. Однако, сперматозоиды, подвергнутые замораживанию и оттаиванию, а также процедурам разделения по полу, также могут подвергаться эпигеномным изменениям, поскольку они демонстрируют низкие темпы развития бластоцист во время производства эмбрионов IVP и низкие показатели стельности после ИО.^232–236 При анализе двух специфических импринтированных генов, IGF2 и его рецептора IGF2R, не было обнаружено различий в паттернах метилирования ДНК в регуляторных, дифференциально метилированных участках этих генов между размороженными, несортированными и отсортированными по полу спермиями быков породы Нелоре.²³⁶ Кроме того, не было обнаружено различий в импринтах метилирования ДНК этих генов между неразделенными сперматозоидами и разделенными по полу X-несущими или Y- несущими сперматозоидами.²³⁶ Эти наблюдения подтверждают предположение, что импринты метилирования ДНК на отцовском геноме не повреждены до момента оплодотворения in vitro. Низкие параметры бластоцист и низкий процент наступления беременности после осеменения спермой, отсортированной по полу, могут быть результатом фрагментации ДНК, изменения процесса упаковки хроматина и эпигенетических дефектов метилирования ДНК внутри чередующихся повторов (последовательности нуклеотидных повторов идут не сразу одна за другой, а рассредоточены по всему геному и не являются смежными) или модификаций гистонов.^236,237.

У млекопитающих материнские отпечатки приобретаются во время фолликулогенеза, и поэтому незрелые фолликулы, которые аспирируют и подвергают процедуре IVM, могут иметь измененные материнские отпечатки по сравнению с ооцитами, полностью созревшими и овулированными in vivo. Таким образом, использование систем IVM может быть фактором, способствующим аберрантной экспрессии импринтированных генов и аномалиям, связанным с возникновением AOS.

В ооцитах крупного рогатого скота существуют существенные различия в развитии и физиологии между кумулюс–ооцитными комплексами, созревшими in vitro, и комплексами, созревшими in vivo. Например, 50–80% созревших ооцитов in vivo развиваются до стадии бластоцисты, тогда как только 15–40% ооцитов IVM достигают стадии бластоцисты.^71–74 Несколько ранних исследований стремились связать IVM-ооциты с фенотипом избыточного роста. Например, ооциты овцы, которые были подвергнуты IVM и оплодотворению in vitro с последующим культивированием in vivo в течение 6,5 дней перед последующим переносом самкам-реципиентам, привели к появлению ягнят, которые были тяжелее при рождении, чем ягнята, полученные из ооцитов, которые созрели, были оплодотворены и культивированы in vivo.²³⁸ Фенотип избыточного роста плода также наблюдался у трансгенных телят, полученных из ооцитов IVM, по сравнению с таковыми, полученными из ооцитов, созревших in vivo.⁷⁹ Интересно, что когда для создания SCNT-концептов использовались незрелые фолликулы (1–3 мм), было замечено, что они обладают меньшими внеэмбриональными мембранами по сравнению с таковыми из более зрелых фолликулов (6–12 мм).⁵⁷ Однако, не было явных различий по размеру плода, аллантоидной васкуляризации, частоте наступления беременности или выживаемости до срока между SCNTбеременностями после переноса незрелых или зрелых ооцитов.⁵⁷ Недавние исследования были сосредоточены на оценке эпигенетических профилей в ооцитах и влиянии IVM на экспрессию мРНК и последующее эмбриональное развитие. Например, экспрессия мРНК ооцитов для ферментов, необходимых для установления или поддержания метилирования ДНК и модификации гистонов, включая G9A, SUV39H1 и DNMT1, в значительной степени зависела от размера фолликула.²³⁹ Кроме того, было обнаружено, что мРНК генов, участвующих в цикле трикарбоновых кислот и в путях окислительного фосфорилирования, аберрантно (аномально) экспрессируются в метафазе II ооцитов крупного рогатого скота, созревших in vitro.²⁴⁰ Кроме того, важные для развития импринтированные гены, включая IGF2R, PEG3 и SNRPN, также были аномально экспрессированы, что позволяет предположить, что ошибки в установлении или поддержании паттернов метилирования ДНК ооцитов произошли во время IVM.²⁴⁰

Отпечатки метилирования материнской ДНК для SNRPN, MEST, IGF2R, PEG10 и PLGAL1 были проанализированы в ооцитах крупного рогатого скота, которые были сгруппированы на группы с малым (101– 110 мкм) или большим (> 120 мкм) диаметром.¹⁷⁴ Дифференциально метилированные участки (DMR) у этих импринтированных генов в малых ооцитах были гипометилированы. Напротив, в больших ооцитах эти DMR были гиперметилированы. Эти наблюдения подтверждают предположение, что приобретение материнских отпечатков коррелирует с размером ооцита.

Fagundes и соавт.²⁴¹ оценили отпечаток метилирования гена IGF2 у ооцитов, аспирированных из малых (<3 мм) и больших (>8 мм) фолликулов и подвергнутых IVM. IGF2 импринтируется по отцовской линии и становится гипометилированным в зрелых преовуляторных ооцитах.²⁴¹ Ооциты, взятые из мелких или крупных фолликулов, после IVM подразделялись на зрелые и незрелые. Созревшие ооциты были идентифицированы по наличию второго полярного тельца при прекращении культивирования.²⁴¹ Интересно, что созревшие ооциты из крупных фолликулов демонстрируют большую степень гипометилирования по сравнению со зрелыми ооцитами, полученными из маленьких фолликулов.²⁴¹ Эти результаты согласуются с предпосылкой, что отпечатки метилирования для IGF2 устанавливаются правильно во время IVM у ооцитов, которые получены из крупных фолликулов и созрели in vitro. Кроме того, оценка импринтов IGF2 может быть потенциально полезной в качестве маркера способности ооцитов к развитию.²⁴¹

Эти результаты также подтверждают предположение о том, что когда ооциты получают из более мелких фолликулов, материнские импринты могут быть неправильно установлены во время IVM, несмотря на тот факт, что ооциты успешно достигают метафазы II мейоза во время культивирования. Такие неправильно установленные импринты могут способствовать возникновению аномалий в развитии после оплодотворения.

Хотя отпечатки метилирования ДНК, по-видимому, правильно устанавливаются в ооцитах из крупных фолликулов, созревших in vitro, следует отметить, что в исследованиях, обсужденных выше, анализировались пулы ооцитов, а не единичные ооциты. Используя анализ паттернов метилирования в отдельных созревших ооцитах с использованием бисульфатного секвенирования с ограниченным разведением, El Hajj и др.²⁴² обнаружили, что паттерны метилирования ДНК для H19, SNRPN и PEG3 были правильно установлены в семи из восьми ооцитах, а один из восьми показал обратный импринтинг для H19 и SNRPN.²⁴² Таким образом, можно исследовать паттерн метилирования нескольких генов из отдельных клеток и, что более важно, IVM может привести к аберрантному установлению эпигенетических паттернов в подмножестве ооцитов крупного рогатого скота до оплодотворения.²⁴²

Во время созревания ооцитов метилирование ДНК регуляторных CpG-островков не всегда коррелирует с подавлением экспрессии мРНК соответствующего гена. Например, метилирование ДНК CpGостровков в генах PEG3, H19 и SNRPN не отличалось или отличалось лишь незначительно между созревшими ооцитами in vivo и созревшими ооцитами in vitro.²⁴³ Однако, экспрессия мРНК для H19 и PEG3 была значительно выше в ооцитах, созревших in vitro, по сравнению с ооцитами, созревшими in vivo, и была аналогична уровням экспрессии, обнаруженным в незрелых ооцитах.²⁴³ Таким образом, хотя паттерны метилирования ДНК, повидимому, и были установлены правильно, некоторые импринтированные гены сохраняют паттерны экспрессии, характерные для незрелых ооцитов, даже после того, как они подвергаются воздействию среды IVM.²⁴³ Разумно ожидать, что существуют дополнительные уровни регуляции помимо статуса метилирования CpG-островков в пределах регуляторных областей генов, и на них неблагоприятно влияют условия IVM-среды.

Ссылки

1. Elsden R, Hasler J, Seidel G. Безоперационное извлечение яйцеклеток крупного рогатого скота. Theriogenology 1976;6:523–532.

2. Боуэн Дж., Элсден Р., Сейдел Г. Нехирургическая пересадка эмбрионов у коров. Theriogenology 1978;10:89–95.

3. Сейдел Г. Суперовуляция и пересадка эмбрионов у крупного рогатого скота. Science 1981;211:351–358.

4. Тибье М. Статистика пересадки эмбрионов в мире. IETS Newsletter 1998;16. http://www.iets.org/pdf/comm_data/ декабря1998.pdf, онлайн.

5. Тибье М. Неоднозначный год для мировой отрасли пересадки эмбрионов животных: отчёт Комитета IETS по сбору данных. IETS Newsletter 2002;20:13–19.

6. Страуд Б. Мировая статистика пересадки эмбрионов сельскохозяйственных животных за 2011 год. IETS Newsletter 2012;30:16–26.

7. Блок Дж., Дрост М., Монсон Р. и др. Использование инсулиноподобного фактора роста I при культивировании эмбрионов и обработка коров-реципиентов гонадотропин-рилизинг-гормоном для повышения частоты наступления стельности после переноса эмбрионов, полученных in vitro , лактирующим коровам, подвергшимся тепловому стрессу. J Anim Sci 2003;81:1590–1602.

8. Хансен П., Блок Дж. На пути к миру, в центре которого — эмбрион: современное и потенциальное применение эмбриональных технологий в молочном животноводстве. Reprod Fertil Dev 2004;16:1–14.

1. Хансен П. Реализация потенциала ЭКО у крупного рогатого скота: обзор. Theriogenology 2006;65:119–125.

2. Уолл Р., Керр Д., Бондиоли К. Трансгенный молочный крупный рогатый скот: генная инженерия в крупных масштабах. J Dairy Sci 1997;80: 2213–2224.

3. Кифер К. Получение биопродуктов с использованием трансгенных животных-моделей. Anim Reprod Sci 2004;82–83:5–12.

4. ван Беркел П., Веллинг М., Гертс М. и др. Крупномасштабное производство рекомбинантного человеческого лактоферрина в молоке трансгенных коров. Nat Biotechnol 2002;20:484–487.

5. Брофи Б., Смоленски Г., Уилер Т., Уэллс Д., L’Юилье П., Лайбл Г. Клонированный трансгенный крупный рогатый скот даёт молоко с повышенным содержанием бета-казеина и каппа-казеина. Nat Biotechnol 2003;21:157–162.

6. Ван Дж., Ян П., Тан Б. и др. Экспрессия и характеристика биологически активного рекомбинантного человеческого альфа-лактальбумина в молоке клонированных трансгенных коров. J Dairy Sci 2008;91:4466–4476.

7. Эдвардс Дж., Шрик Ф., Маккракен М. и др. Клонирование взрослых сельскохозяйственных животных: обзор возможностей и проблем, связанных с переносом ядер соматических клеток. Am J Reprod Immunol 2003; 50:113–123.

8. Соммер Дж., Джексон L, Симпсон С., Коллинз Э., Пьедраита Дж., Петтерс Р. Трансгенные свиньи Stra8–EYFP: модель для разработки технологий работы с мужскими половыми клетками. Transgenic Res 2012;21:383–392.

9. Соммер Дж., Эстрада Дж., Коллинз Э. и др. Получение трансгенных свиней ELOVL4: модель макулярной дегенерации по типу болезни Штаргардта на крупном животном. Br J Ophthalmol 2011;95:1749–1754.

10. Нарбонн П., Миямото К., Гёрдон Дж. Репрограммирование и развитие эмбрионов, полученных путём переноса ядер, и в межвидовых системах. Curr Opin Genet Dev 2012;22:450–458.

11. Пратер Р. Геномика свиньи для биомедицины. Nat Biotechnol 2013; 31:122–124.

12. Уэллс Д., Мисика П., Тервит Х., Виванко У. Перенос ядра взрослой соматической клетки использован для сохранения последней выжившей коровы породы острова Эндерби. Reprod Fertil Dev 1998;10:369–378.

13. Гомес М., Поуп К., Рикс Д., Лайонс Дж., Дюма К., Дрессер Б. Клонирование исчезающих видов кошачьих с использованием донорских ооцитов другого вида и межвидовой пересадки эмбрионов. Reprod Fertil Dev 2009;21: 76–82.

14. Кинг К., Сейдел Г., Элсден Р. Стельность после пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. I. Частота абортов и характеристики телят. J Anim Sci 1985;61:747–757.

15. Нагасима Х., Мацуи К., Савасаки Т., Кано Ю. Получение монозиготных близнецов мышей из морул, разделённых пополам микрохирургическим способом. J Reprod Fertil 1984;70:357–362.

16. Сурани М., Бартон С., Норрис М. Экспериментальная реконструкция яйцеклеток и эмбрионов мышей: анализ развития млекопитающих. Biol Reprod 1987;36:1–16.

17. Willadsen S. Перенос ядер в эмбрионах овец. Nature 1986;320:63–65.

18. Willadsen S. Клонирование эмбрионов овец и коров. Genome 1989; 31:956–962.

19. Baker R, Shea B. Коммерческое разделение эмбрионов крупного рогатого скота. Theriogenology 1985;23:3–12.

20. Heyman Y. Факторы, влияющие на выживаемость целых и разделённых пополам эмбрионов после переноса крупному рогатому скоту. Theriogenology 1985;23:63–75.

21. Warfield S, Seidel G, Elsden R. Перенос половинных эмбрионов крупного рогатого скота с прозрачной оболочкой и без неё. J Anim Sci 1987;65:756–761.

22. Lopes R, Forell F, Oliveira A, Rodrigues J. Разделение эмбрионов крупного рогатого скота и взятие биопсии для определения их пола в полевых условиях. Theriogenology 2001;56:1383–1392.

23. Willadsen S, Janzen R, McAlister R, Shea B, Hamilton G, McDermand D. Жизнеспособность поздних морул и бластоцист, полученных путём переноса ядер у крупного рогатого скота. Theriogenology 1991;35:161–170.

24. Keefer C, Stice S, Matthews D. Клетки внутренней клеточной массы эмбрионов крупного рогатого скота как доноры ядер при получении эмбрионов и телят методом переноса ядер. Biol Reprod 1994;50:935–939.

25. Wilson J, Williams J, Bondioli K, Looney C, Westhusin M, McCalla D. Сравнение массы тела при рождении и особенностей роста телят крупного рогатого скота,

26. полученных путём переноса ядер (клонирования), переноса эмбрионов и естественного спаривания. Anim Reprod Sci 1995;38:73–83.

27. Brackett B, Bousquet D, Boice M, Donawick W, Evans J, Dressel M. Нормальное развитие после in vitro оплодотворения у коров. Biol Reprod 1982;27:147–158.

28. Brackett B. In vitro созревание и оплодотворение ооцитов. J Anim Sci 1985;61(доп. вып. 3):14–24.

29. Younis A, Brackett B, FayrerHosken R. Влияние сыворотки и гормонов на созревание и оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота in vitro . Gamete Res 1989;23:189–201.

30. Wright R, Bondioli K. Некоторые аспекты in vitro оплодотворения и культивирования эмбрионов домашних животных. J Anim Sci 1981;53:702–729.

31. Sirard M, Parrish J, Ware C, LeibfriedRutledge M, First N. Культивирование ооцитов крупного рогатого скота для получения эмбрионов, способных к развитию. Biol Reprod 1988;39:546–552.

32. Eyestone W, First N. Совместное культивирование ранних эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты с тканью яйцевода или в кондиционированной среде. J Reprod Fertil 1989;85:715–720.

33. Saeki K, Hoshi M, LeibfriedRutledge M, First N. In vitro оплодотворение и развитие ооцитов крупного рогатого скота, созревших в среде без сыворотки. Biol Reprod 1991;44:256–260.

34. Keskintepe L, Burnley C, Brackett B. Получение жизнеспособных бластоцист крупного рогатого скота в среде определённого состава in vitro. Biol Reprod 1995;52:1410–1417.

35. Keskintepe L, Brackett B. В условиях in vitro способность к развитию созревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота, оплодотворённых и культивируемых в средах полностью определённого состава. Biol Reprod 1996;55:333–339.

36. Walker S, Heard T, Seamark R. In vitro культивирование эмбрионов овец без совместного культивирования: достижения и перспективы. Theriogenology 1992;37:111–126.

37. Behboodi E, Anderson G, BonDurant R и др. Рождение крупных телят, развившихся из полученные in vitro эмбрионы крупного рогатого скота. Theriogenology 1995;44:227–232.

38. Farin P, Farin C. Перенос эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo или in vitro: выживаемость и развитие плода. Biol Reprod 1995; 52:676–682.

39. Sinclair K. Полученные in vitro эмбрионы как средство достижения беременности и повышения продуктивности мясных коров. Anim Sci J 1995;60:55–64.

40. Walker S, Hartwich K, Seamark R. Рождение необычно крупного потомства после манипуляций с эмбрионами: представления и проблемы. Theriogenology 1996;45:111–120.

41. ChavattePalmer P, Remy D, Cordonnier N и др. Состояние здоровья клонированного крупного рогатого скота в разном возрасте. Cloning Stem Cells 2004;6:94–100.

42. Panarace M, Aguero JI, Garrote M и др. Насколько здоровы клоны и их потомство: 5 лет практического опыта. Theriogenology 2007;67:142–151.

43. Miles J, Farin C, Rodriguez K, Alexander J, Farin P. Ангиогенез и морфометрические показатели плацент крупного рогатого скота на поздних сроках беременности при использовании эмбрионов, полученных in vivo или in vitro . Biol Reprod 2004;71: 1919–1926.

44. Miles J, Farin C, Rodriguez K, Alexander J, Farin P. Влияние культивирования эмбрионов на ангиогенез и морфометрические показатели плацент крупного рогатого скота на ранних сроках беременности. Biol Reprod 2005;73:663–671.

45. ChavattePalmer P, Heyman Y, Richard C и др. Клинические, гормональные и гематологические характеристики телят, полученных с использованием ядер соматических клеток. Biol Reprod 2002;66:1596–1603.

46. Farin P, Crosier A, Farin C. Влияние систем in vitro на выживаемость эмбрионов и развитие плода у крупного рогатого скота. Theriogenology 2001;55:151–170.

47. Hasler J, Henderson W, Hurtgen P и др. Получение, замораживание и перенос эмбрионов крупного рогатого скота, полученных методом экстракорпорального оплодотворения, и последующие результаты отёлов. Theriogenology 1995;43:141–152.

48. Kruip T, den Daas J. Полученные in vitro и клонированные эмбрионы: влияние на беременность, роды и потомство. Theriogenology 1997;47:43–52.

49. van Wagtendonkde Leeuw AM, Mullaart E, de Roos A и др. Влияние различных методов воспроизводства — AI, MOET и IVP —