Воспроизводство крупного рогатого скота

Точно так же потеря SCNT-беременности на более поздних сроках была связана с рядом факторов, включая уменьшение числа котиледонов или плацентом, гидроллантоис, отек плаценты и анасарку плода.¹⁵ Неправильное развитие аллантоиса часто является основной причиной гибели эмбрионов после 30 дня беременности, поскольку аллантоис необходим для формирования хориоаллантоисной плаценты. Плацентомы начинают формироваться примерно с 30 дня.¹⁵⁴ Эмбрионы SCNT могут иметь нарушенное формирование котиледонов или другие проблемы, которые препятствуют правильному развитию структуры и количества плацентом.¹⁵⁰ Количество плацентом более вариабельно при беременностях с SCNT по сравнению с контрольной группой ИО^62,150 , и существует высокая вероятность выкидыша к 90-му дню беременности, если количество плацентом очень низкое.^59,62,150

На более поздних сроках беременности плаценты при IVP- или SCNTбеременностях могут иметь другие морфологические или функциональные аномалии. На 222-й день гестации плаценты, полученные от беременных IVP-плодами, имели увеличенный пропорциональный объем кровеносных сосудов в материнских карункулах по сравнению с контролем in vivo.⁵⁰ Кроме того, плаценты из группы IVP имели повышенное соотношение объема ткани, занимаемого кровеносными сосудами, к площади поверхности плацентом, что указывает на потенциально повышенную васкуляризацию по сравнению с контролем. Напротив, не было выявлено различий в объемной плотности ворсинок плода на 70-й день между группами IVP и in vivo, что позволяет предположить, что нарушения в формировании ворсинок, вероятно, возникают на более поздних сроках беременности.⁵¹ Точно так же не было разницы в массе плаценты на 70-й день беременности, тогда как на 222-й день плаценты от IVP-плодов были тяжелее, чем контрольные in vivo.⁵⁰ Эти результаты также подтверждают предположение о том, что отклонения в росте плаценты, связанные с IVP-беременностью, происходят на более поздних сроках.⁵¹ Избыточный рост плода, связанный с in vitroпроцедурой его получения, вероятно, приводит к повышенной потребности в питательных веществах и газообмене, а плаценты от IVPбеременных могут развивать компенсаторные механизмы в сосудистой системе для решения проблемы уменьшенной площади поверхности, доступной для контакта плода и матери.⁵⁰ Заболеваемость гидраллантоисом среди IVP-беременных составляет примерно 1 из 200 беременностей, что значительно выше, чем 1 из 7500 случаев, зарегистрированных при нормальной беременности.⁵⁴

Во второй половине гестации в SCNT-плаценте могут наблюдаться плацентомегалия и гидраллантоис, при этом отек плода и тканей плаценты является основной причиной гибели плода при беременности с SCNT.¹⁵⁰ Кроме того, диаметр пуповины, как правило, больше, а ее просвет увеличен из-за отсутствия складок в просвете при SCNTбеременностях по сравнению с контрольными беременностями ИО.^150,151 Избыточный рост плаценты при SCNT-беременностях может быть вызван врожденными дефектами плаценты, а не чрезмерным ростом плода, и может охватывать до 50% поздне-гестационных SCNTбеременностей.¹⁵¹ Разрастание плаценты происходило до избыточного роста плода, и соотношение веса плода к весу плацентом было ниже при беременностях с SCNT по сравнению с контрольной группой ИО и in vitro.¹⁵¹

Плаценты от беременностей IVP или SCNT демонстрируют различия в экспрессии генов или продукции белка. Например, карункулярные уровни PPARγ - транскрипционного фактора, участвующего в экспрессии VEGF и развитии сосудов, - были увеличены на 222-й день у плацент при IVP-беременности по сравнению с контролем in vivo.⁵⁰ Различия в экспрессии генов плацентом между беременностями в группах SCNT, IVP и ИО, взятых между 174-м днем беременности и доношенным сроком, оценивались с помощью микрочипового анализа.¹⁴⁹

В общей сложности между плацентомами IVP и SCNT были идентифицированы 162 дифференциально экспрессируемых гена (DEG), а между плацентомами ИО и SCNT были идентифицированы 276 DEG.¹⁴⁹ Некоторые DEG были общими для плацентомов IVP и SCNT, что свидетельствует о влиянии системы культивирования на транскриптом плацентома. Плаценты SCNT имели сильно измененные уровни экспрессии генов, независимо от наличия нормальной или аномальной морфологии. Более того, авторы исследования предположили, что неспособность компенсировать плацентарную дисфункцию приводит к гибели плода и другим аномалиям, связанным с АОS.¹⁴⁹ Это также согласуется с предположением о том, что голодание плода из-за плацентарной недостаточности может быть основной причиной потери SCNT-беременностей после 50го дня.⁶² Весьма вероятно, что недостаточность обмена питательными веществами между плодом и матерью и выведения продуктов обмена является основной причиной потери беременности в интервале от середины до позднего гестационного срока в сочетании с AOS типа III.

Астон и др.¹⁵⁵ использовали массив генома крупного рогатого скота Affymetrix GeneChip для исследования экспрессии генов между SCNT-котиледонами на 70-е сутки и ИО-плацентой и сообщили о 19 DEGs между группами. Однако, ни один из их DEG не совпадал с таковыми в исследовании Everts и др.¹⁴⁹ Вероятно, это связано с взятием образцов разных тканей в разные моменты времени. Недавно тот же самый Affymetrix GeneChip был использован для исследования глобального транскриптома плаценты на 50-й день, полученной при беременностях ИО, IVP и SCNT.¹⁵⁶ Всего между плацентами групп SCNT и ИО было идентифицировано 1196 DEG, из которых 9% были вызваны ошибкой транскрипционного репрограммирования.¹⁵⁶ Плаценты из группы IVP имели только 72 DEG по сравнению с группой ИО, причем 58 из этих DEG также были общими для SCNT-плацент. DEG в группах SCNT и IVP участвовали в развитии органов, развитии кровеносных сосудов, организации внеклеточного матрикса и иммунной системы.¹⁵⁶ Интересно, что 96% DEG в группе SCNT не отличались по регуляции от группы IVP, указывая на то, что эти плаценты испытывают уникальное нарушение экспрессии генов. Кроме того, более высокий уровень дисрегуляции транскриптома в плаценте SCNT согласуется с более высокой степенью морфологической дисрегуляции, сообщаемой при беременностях SCNT. Средние концентрации глюкозы в жидкости плода не различались между беременностями SCNT и ИО на ранних сроках; тем не менее, уровни глюкозы в плодной жидкости были ниже при прерывании SCNT-беременности с наличием увеличенной плаценты или уменьшенного количества плацентом.¹⁵⁷ Скорость роста плаценты при SCNT-беременностях не снижалась, как при ИО-беременностях, и есть доказательства того, что экспрессия транспортера глюкозы GLUT3 была повышена в SCNT-плаценте, что указывает на увеличение поглощения глюкозы плацентой при SCNT-беременности.^158,159 Плацента крупного рогатого скота также является основным источником эстрона, а эстрогены, полученные из плаценты, играют роль в проницаемости сосудов и распределении внеклеточной жидкости.¹⁵⁰ Повышенные уровни эстрадиола были зарегистрированы при SCNT-беременности, начиная с 80-го дня, и они могут способствовать часто наблюдаемому отеку плаценты и плода.¹⁵⁰ Нарушенные уровни эстрогена при SCNTбеременности также могут быть причиной недостаточного развития молочных желез, наблюдаемого непосредственно перед отелом, и недостаточной подготовки к родам.¹³¹

Аномально высокие концентрации связанных с беременностью гликопротеинов (PAG) на 50-й день стельности коррелировали с гибелью плода при SCNT-беременности.¹³¹ На основании данных, полученных с использованием глобального протеомного подхода (исследование белков) для изучения дифференциальной экспрессии белков в плаценте, взятой либо после отела с SCNT-плодами, закончившегося постнатальной смертью, либо после родов с нормальной беременностью ИО,¹⁶⁰ было идентифицировано 60 дифференциально экспрессируемых белков. Эти белки связаны с репарацией (восстановлением) белков, цитоскелетом, передачей сигналов, иммунной системой и метаболизмом.¹⁶⁰ Эти исследователи подтвердили аномальные уровни экспрессии нескольких предполагаемых дифференциально экспрессируемых белков, включая TIMP2, в SCNT-плаценте, которые, как известно, играют важную роль в развитии плаценты.

Долгосрочное влияние на жизнеспособность телят

Телята, полученные в результате переноса эмбрионов IVP или SCNT, дожившие до родов, могут по-прежнему демонстрировать ухудшение здоровья. У этих телят могут быть врожденные проблемы, такие как гипоплазия мозжечка, респираторная недостаточность и увеличение сердца.⁵⁹ Несмотря на различия в массе тела при рождении между телятами, полученными в результате переноса IVP и in vivo эмбрионов, на скорость постнатального роста и массу годовалых телят не влиял источник эмбриона или масса при рождении.^33,139

Клонированные телята также могут проявлять аномалии в течение первых нескольких месяцев жизни. Средний объем эритроцитов у клонированных телят был выше при рождении, а в течение первой недели после рождения температура тела и концентрации лептина в плазме были выше, а уровни тироксина ниже у клонированных телят по сравнению с контрольной группой.⁵² Интересно, что в этом исследовании повышенная температура тела наблюдалась, по крайней мере, до 50 дней после родов. Другие зарегистрированные различия у клонированных телят включают различную длину теломер (концевых участков хромосом) у клонированных телят, связанную с разными типами донорских ядер клеток¹⁶¹ , и более позднее начало полового созревания у клонированных телок по сравнению с контрольными животными от ИО.¹⁶² У быков, полученных в результате переноса эмбрионов IVP, которые были слишком крупными при рождении, было зарегистрировано увеличение веса сердца на килограмм веса тела при убое.¹³⁹ Таким образом, несмотря на то, что они выглядят здоровыми, эти данные свидетельствуют о том, что по крайней мере часть телят, полученных в результате переноса эмбрионов IVP и SCNT, не является физиологически нормальными в течение первых нескольких месяцев жизни.

Хотя АОS наблюдается при большом количестве клонированных беременностей, некоторые особи рожают нормально и после родов не требуют особой ветеринарной помощи. Несмотря на различие в весе при рождении в 24% между телятами, полученными от эмбрионов SCNT и контрольной группы in vivo, ускоренный рост и вариабельность веса не продолжались во время постнатального развития и составляли менее 5% в возрасте 1 года.³³ Те клоны, которые доживают до зрелого возраста, по-видимому, имеют нормальную репродуктивную функцию и потомство. Клонированные телки, использованные в программе эмбриотрансфера, имели уровни производства эмбрионов, аналогичные контрольным, а также нормальные показатели воспроизводства и отела.⁴⁹ Аналогичным образом было обнаружено, что клоны взрослых самцов дают сперму хорошего качества с нормальной фертильностью при ИО. Кроме того, потомство нескольких клонированных взрослых особей в этом исследовании также показало нормальные репродуктивные показатели и молочную продуктивность.⁴⁹

Ряд исследований практически не выявили различий в скорости роста, продолжительности эстрального цикла, гормональных профилях, включая лютеинизирующий гормон (ЛГ), ФСГ, E2, P4, IGF1 и гормон роста, а также в характеристиках лактации и общей репродуктивной способности клонов по сравнению с неклонированными телятами того же возраста.^15,33,52,163 Кроме того, было обнаружено, что производство молока и мяса клонированным рогатым скотом было таким же, как и у крупного рогатого скота, полученного путем ИО.^164-166 Таким образом, хотя перенос IVP- или SCNTэмбрионов может быть связан с широким спектром аномалий во время беременности и даже после родов, телята, дожившие до взрослого возраста, могут вести здоровую продуктивную жизнь.

Механизмы, лежащие в основе AOS

Изначально предполагалось, что аномалии, наблюдаемые у эмбрионов, плодов, плаценты и потомства крс, полученного путем переноса эмбрионов IVP или SCNT, являются результатом эпигенетической дисрегуляции и последующей аберрантной экспрессии мРНК важных для развития импринтированных генов.^{63,105,167,168} Импринтированные гены экспрессируются моноаллельно, в зависимости от того, от какого родителя поступили аллели, в результате эпигенетических модификаций.¹⁶⁹ Эпигенетические модификации - это химические изменения ДНК или гистоновых белков, которые изменяют структуру хроматина без изменения нуклеотидной последовательности.¹⁷⁰ Эмбрионы, полученные из IVP и SCNT, подвергаются воздействию среды IVC, которая, как считается, нарушает приобретение или поддержание эпигенетических паттернов, регулирующих экспрессию импринтированных генов.^{115, 171, 172} В дополнение к повреждениям под действием среды IVC, SCNT-эмбрионы также должны преодолеть разрыв зоны, потерю материнской цитоплазмы и цитоскелета, электрическое или химическое слияние и активацию энуклеированного ооцита с донорской клеткой, а также эпигенетическое перепрограммирование донорского ядра в тотипотентное состояние (способность одной клетки делиться и производить все дифференцированные клетки в организме. Полностью дифференцированная клетка может вернуться в состояние тотипотентности, что и происходит при клонировании) .¹⁷³ Другой источник эпигенетической дисрегуляции, способствующий аномальным фенотипам, связанным с AOS, может возникать в результате аспирации и IVM ( дозревание in vitro) ооцитов крупного рогатого скота перед манипуляциями IVP или SCNT. Приобретение материнских эпигенетических модификаций, которые регулируют экспрессию импринтированных генов, происходит на последних стадиях развития фолликулов, в период, когда кумулюсооцитные комплексы аспирируются и могут также изменяться во время IVM.¹⁷⁴ Интересно, что многие импринтированные гены регулируют экспрессию не импринтированных генов. Следовательно, аномальные фенотипы могут возникать из-за аберрантной экспрессии неимпринтированных генов, возникающей вследствие эпигенетической дисрегуляции импринтированных генов.⁵⁹ Кроме того среда IVC и протоколы SCNT могут оказывать неблагоприятное влияние на модификации ДНК, регулирующие экспрессию неимпринтированных генов, независимо от геномного импринтинга.⁵⁹ Сложность потенциальных механизмов, лежащих в основе AOS, усугубляется наблюдением, что протоколы IVC и SCNT также негативно влияют на экспрессию генов, которые регулируют приобретение и поддержание эпигенетических модификаций, необходимых для соответствующей экспрессии импринтированных генов.

Эпигенетическая дисрегуляция импринтированных генов

Предполагается, что аномалии, наблюдаемые у эмбрионов, плодов, плаценты и потомства, полученного в результате переноса эмбрионов IVP или SCNT, являются результатом неадекватных условий IVC или неправильного эпигенетического репрограммирования во время процедур SCNT, ведущих к неправильному установлению или поддержанию эпигенетических паттернов, регулирующих экспрессию импринтированного гена в критические периоды доимплантационного развития.^{59,168,175,176}

Многочисленные эксперименты на крупном рогатом скоте и овцах, изучающие аберрантную экспрессию импринтированных генов после переноса эмбрионов IVP или SCNT, подтверждают эту гипотезу.^{146,172,177–} 183 Недавно однонуклеотидные полиморфизмы в модели Bos taurus × Bos indicus были использованы для исследования экспрессии импринтированных генов для концептов in vivo, IVP и SCNT на 17-й

день гестации и для плодов и плаценты на 45-й день.¹⁷¹ Моноаллельная экспрессия исследованных импринтированных генов не поддерживалась в полной мере в исследуемых тканях, а в некоторых случаях релаксация импринтов метилирования ДНК была связана с несоответствующей двуаллельной экспрессией.¹⁷¹ Дополнительные исследования по изучению отпечатков метилирования ДНК, важных для развития импринтированных генов, также подтверждают гипотезу о том, что эпигенетическая дисрегуляция является ключевым фактором, который, вероятно, способствует возникновению аномалий, связанных с AOS.^175, 177, 182, 184–186

Дальнейшее подтверждение этой гипотезе было предоставлено исследованиями других известных эпигенетических изменений, таких как ковалентные модификации гистонов.^187–193 Предполагается, что модификации гистонов, включая ацетилирование и метилирование, играют роль в регуляции экспрессии импринтированных генов посредством замалчивания РНК ( подавление экспрессии генов)^194,195 или активации моноаллельной экспрессии.¹⁹⁶

В настоящее время известно более 140 импринтированных генов у мышей и людей.¹⁷⁰ Однако, до сих пор исследования на крупном рогатом скоте были сосредоточены только на небольшом подмножестве импринтированных генов. Известно, что доимплантационный эмбрион крупного рогатого скота чувствителен к измененным эпигенетическим модификациям, производимым системой IVC или протоколами SCNT на основе результирующей аберрантной экспрессии импринтированных генов.^{63,101, 197} Наблюдение за тем, что некоторые импринтированные гены обладают способностью регулировать экспрессию неимпринтированных генов, предполагает, что начальная эпигенетическая дисрегуляция, вызванная IVC и SCNT, может усугубляться этим последующим влиянием на экспрессию неимпринтированных генов.^59,198,199

Эпигенетическая дисрегуляция неимпринтированных генов

Среда для IVC (культивирования эмбрионов) и протоколы SCNT могут влиять на экспрессию неимпринтированных генов посредством последующих эффектов аберрантно экспрессируемых импринтированных генов и эпигенетической дисрегуляции самих неимпринтированных генов. В раковых клетках человека аберрантная экспрессия импринтированного гена p73 подавляла экспрессию VEGF - не импринтированного гена, который является важным плацентарным ангиогенным фактором.^198,199 Разумно ожидать, что аналогичные эффекты на не импринтированные нижестоящие регуляторы могут также возникать у бычьих эмбрионов и плодов, созданных в таких условиях, как при IVC и SCNT, которые вызывают аберрантную экспрессию импринтированных генов. Альтернативно, аберрантная экспрессия неимпринтированных генов может происходить в результате гиперметилирования на CpG-островках, окружающих промоторы неимпринтированных генов.²⁰⁰ В этом случае такие эпигенетические ошибки не будут зависеть от механизмов импринтинга. Например, в хорионе SCNT-беременных коров промотор эпидермального гена цитокератина и повторяющиеся элементы сателлита-1 были гиперметилированы по сравнению с таковыми у контрольных животных in vivo.^59,201 Хотя точные механизмы, которые регулируют экспрессию неимпринтированных генов, остаются неясными, очевидно, что протоколы IVC и SCNT могут отрицательно влиять на экспрессию неимпринтированных генов и, в свою очередь, способствовать аномалиям, связанным с AOS.^{51,63,135,202–204}

Измененная экспрессия мРНК, кодируемых неимпринтированными генами, включая миостатин и GAPDH, была связана с повышенным соотношением типов вторичных мышечных волокон к первичным мышечным волокнам у IVP-плодов.¹³⁵ Аналогичным образом, измененная экспрессия мРНК или белков VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) , PPARγ (рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами) , лептина, лактогена бычьей плаценты, трансформирующего фактора роста TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, рецепторов TGFβ (TGFβ - трансформирующий фактора роста бета - белок (представитель цитокинов), который контролирует пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток) и основных антигенов класса I гистосовместимости были обнаружены в плаценте от беременностей IVP или SCNT.^{50,51,202–204} Эти более тонкие изменения в развитии плода или плаценты после процедур IVP или SCNT, которые не подпадают под классическое определение синдрома «крупноплодия», могут, тем не менее, отражать возникновение эпигенетической дисрегуляции, характерной для AOS.⁵⁹

Исследование паттернов экспрессии генов у эмбрионов, плодов и плаценты крупного рогатого скота, овец и мышей, полученных с помощью IVC или прошедших процедуры SCNT, продемонстрировало измененную экспрессию импринтированных,^{63,104,146,177,205} X-сцепленных,^63,201,206 и не импринтированных^{51,63,135,203,204} генов. Изменения в паттернах метилирования эмбрионов и глобальных уровнях метилирования были связаны с изменением доимплантационного развития^207,208 и неблагоприятными исходами беременности с SCNT-плодами.²⁰⁹ Эти эффекты могут быть лишь вторичными ответными реакциями, которые являются результатом начального влияния измененного эпигенетического статуса импринтированных генов на ранней стадии доимплантационного или периимплантационного развития. С другой стороны, они могут указывать на то, что IVC и обработка могут влиять на паттерны метилирования, которые могут участвовать в регуляции экспрессии неимпринтированных генов, как это было предложено для других систем^200,210 и наблюдалось при беременностях с SCNT.²⁰¹ Таким образом, вероятно, что гиперметилирование промоторов, содержащих CpG-островки, при SCNT-беременностях может приводить к изменениям в экспрессии генов независимо от импринтинга. В совокупности эти наблюдения подтверждают предположение, что глобальные эпигенетические модификации, влияющие на экспрессию неимпринтированных генов, могут играть важную роль в возникновении AOS.

В исследованиях тканей плаценты человека была признана важность как импринтированных, так и не импринтированных генов в контроле роста плода и функции плаценты. Например, была выявлена взаимосвязь между нарушением регуляции импринтированных генов и возникновением задержки внутриутробного развития у человека, синдрома, который влияет как на функцию плаценты, так и на рост плода.²¹¹ Интересно, что в то время как эпигенетическая дисрегуляция у таких видов, как крупный рогатый скот и овцы, приводит к чрезмерному росту плода, аналогичная дисрегуляция приводит к противоположному фенотипу у людей. Эти наблюдения подтверждают необходимость изменения номенклатуры с синдрома «крупноплодия» на более точный и широко применимый термин AOS.⁵⁹

Нарушение эпигенетических регуляторов

У млекопитающих в период раннего эмбрионального развития паттерны метилирования ДНК, которые регулируют экспрессию генов, приобретаются и поддерживаются семейством ферментов, называемых ДНК-метилтрансферазами (DNMT).^168,170,212