В этом исследовании концепты, полученные из IVP-эмбрионов и извлеченные на 16-й день беременности, имели меньшие эмбриональные диски и, как правило, имели более короткую длину трофобласта по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo. Различия в длине концепцов между исследованиями можно объяснить различиями в условиях in vitro, используемых при получении эмбрионов, а также временем восстановления относительно признания беременности матерью.
По сравнению с концептами, полученными в результате переноса IVP-эмбрионов, среди эмбрионов SCNT на 20% меньше концептов имели эмбриональный диск при имплантации на 17-й день.121 Скорость имплантации обычно выше, если эмбриональный диск обнаружен без признаков дегенерации концепта.119 Условия культивирования могут влиять на присутствие эмбрионального диска в развивающихся концептах; в одном исследовании сообщается о более высоком проценте присутствия эмбриональных дисков при использовании среды KSOM (72%) по сравнению со средой SOF (46%).
119
Периимплантационные концепты, полученные из IVP- или SCNTэмбрионов, могут иметь разные онтогенетические и ультраструктурные свойства.118 И IVP, и SCNT концепты имели задержку в развитии на 14-й и 21-й день по сравнению с ожидаемым графиком развития, описанным для концептов in vivo.118 При сравнении концептов от эмбрионов, происходящих от IVP и SCNT-эмбрионов, концепты SCNT на 14-й и 21й дни беременности были короче по длине и демонстрировали больше ультраструктурных дефектов в обоих временных точках по сравнению с IVP-концептами.118 Например, SCNT-концепты демонстрируют более частое возникновение апоптоза, больше вакуолей, меньше митохондрий в гипобласте, разрушение базальной мембраны между гипобластом и эпибластом, менее выраженные межклеточные контакты между клетками трофэктодермы, меньшее количество десмосом и меньшее количество полирибосом.
Между концептами, полученными в результате переноса IVP- или in vivo-эмбрионов, наблюдались различия в экспрессии генов.104 Например, контрольные эмбрионы in vivo показали временное снижение транскрипционной активности с 7 по 16 день, чего не наблюдалось в этот период у эмбрионов IVP. Более того, на 16-й день беременности концепты от эмбрионов, полученных из IVP, имели более высокую экспрессию транскрипта мРНК IGF1R по сравнению с in vivoконтролем.104 В то время как бластоцисты IVP на 7 день имели более низкий относительный уровень транскрипта IFN-t au по сравнению с контрольными in vivo бластцистами, концепты IVP на 16 день с задержкой развития имели большее содержание мРНК IFN-t au.104
По сравнению с концептами IVP, концепты, полученные в результате переноса SCNT-эмбрионов, не обладали экспрессией NANOG и FGF4 и сверхэкспрессировали мРНК IFN-tau на 17-й день гестации.121 Используя индивидуальный микрочип, было идентифицировано 47 генов, которые по-разному экспрессируются на 17-й день между концептами из эмбрионов SCNT и IVP. Кроме того, экспрессия генов, участвующих в пролиферации трофобластов (Mash2), дифференцировке (Hand1) и функции трофобластов (PAG9), была изменена в концептах SCNT на 17й день по сравнению с концептами из IVP или ИО.122 На 25-й день беременности концепты, полученные из IVP или NT-эмбрионов, имели более высокую экспрессию мРНК IGF1 по сравнению с контрольнями, полученными посредством ИО. Кроме того, концепты, полученные из эмбрионов SCNT, имели более высокую экспрессию мРНК IGF2, чем концепты, полученные из IVP.120 Интересно отметить, что профили экспрессии генов эндометрия матки при вынашивании эмбрионов SCNT и IVP, различаются.123 Эти наблюдения подтверждают предположение о том, что во время периимплантационного периода аномальная связь эмбриона с матерью может быть ответственной за измененный фенотип у клонированных животных.123
Фактически, изменения в экспрессии генов, жизненно важных для нормальной дифференцировки трофобластов и последующего развития плаценты, связанные с IVP и SCNT, могут быть фактором, способствующим увеличению потерь беременности и другим аномалиям, наблюдаемым на более позднем этапе развития.
Развитие плода
Развитие плода после переноса эмбрионов IVP или SCNT связано с повышенной смертностью и множеством аномалий. После периода эмбриональных потерь у крупного рогатого скота плоды, полученные из эмбрионов IVP или SCNT, испытывают более высокие показатели гестационных потерь по сравнению с плодами, полученными in vivo (Рисунок 67.4). Крупномасштабное исследование, анализирующее результаты более 30 наборов данных по IVP и SCNT, показало, что после поправки на такие эффекты, как время года, родство и пол теленка, потери плода были выше для эмбрионов IVP и SCNT по сравнению с беременностями от ИО или переноса эмбрионов.55 Кроме того, у телят IVP и SCNT наблюдался более длительный срок гестации и более высокий вес при рождении, а также повышенная частота дистоции и перинатальных потерь по сравнению с телятами, полученными путем искусственного осеменения или трансплантации эмбрионов.
Более высокий уровень невынашивания беременности после переноса IVP-эмбрионов наблюдается в позднем эмбриональном периоде (30-й день) и раннем плодном периоде до 90-го дня беременности по сравнению с контролем in vivo.59 В то время как частота выкидышей на сроке примерно от 2 месяцев беременности до доношенного срока составляет менее 10% у реципиентов, несущих in vivo-продуцированные эмбрионы,124–126 эти потери могут быть в два-три раза больше у реципиентов, несущих эмбрионы IVP.7,54,127,128 Беременности IVP сопровождаются гибелью эмбриона и плода, особенно между 30 и 65 днями гестации, при этом большая часть потерь происходит между 30 и 44 днями.128 Для сравнения, беременность, полученная от эмбрионов in vivo, имела более низкие показатели смертности, которые распределялись более равномерно между 30 и 90 днями.128 Кроме того, процент стельных на 60-й день гестации был на 42% ниже среди реципиентов с IVP-эмбрионами 1 степени развития по сравнению с таковыми у реципиентов с эмбрионами 1 степени, полученными in vivо.45 Частота сохранения беременности на 50-60-й день гестации после переноса свежих эмбрионов IVP степени 1 (59%) была значительно ниже по сравнению с таковой у свежих in vivoпродуцированных эмбрионов 1 степени (76%).
In vivo
IVP
SCNT
День 7 День 30 День 60 День 90 Срок
Дни гестации
Уровень стельностей
Рисунок 67.4 Относительный период гестационных потерь после переноса эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo, in vitro (IVP) или путем переноса ядра соматических клеток (SCNT).
Однако, согласно данным крупномасштабного исследования, частота сохранения беременности между 90 и 150 днями гестации была одинаковой как для свежих, так и для замороженных IVPэмбрионов (43,5%).129
Возникновение ранней смертности плода происходит еще чаще после переноса клонированных (NT и SCNT) эмбрионов. Потери от 50 до 100% беременностей при использовании клонированных эмбрионов могут происходить между 30 и 60 днями гестации, по сравнению с 2-10% потерей беременностей, полученных естественным путем, которые обычно происходят в этот период.15, 20, 62, 130 Второй период высокого уровня потерь наступает во втором триместре беременности в случае клонированных эмбрионов.15,62,131 Во многих из этих случаев у абортированных плодов отмечают мало грубых аномалий, в то время как плаценты часто имеют серьезные аномалии.15,62,131 Клонированные беременности также могут подвергаться большим потерям в течение третьего триместра, часто характеризующимся плацентарными аномалиями, включая гидраллантоис, сокращенное количество плацентом и отек плацентарных оболочек.15,62 Согласно результатам общенационального исследования выживаемости эмбрионов и телят, полученных с помощью SCNT с 1998 по 2007 г., проведенного в Японии, выживаемость SCNT-эмбрионов и телят не улучшилась за этот 10-летний период.132 Уровень подтвержденных стельностей на 30-й день после переноса эмбрионов SCNT варьировался от 21,6% до 32,9% и был ниже по сравнению с уровнем стельностей после переноса эмбрионов, полученных in vivo (50–52%) и эмбрионов IVP (37–46%).132
Помимо увеличения частоты внутриутробной смертности, плоды, полученные из эмбрионов IVP и SCNT, демонстрируют множество морфологических аномалий на ранних сроках беременности. По сравнению с контрольной группой ИО, у плодов SCNT и IVP на 80-й день беременности была увеличена масса тела, масса печени и окружность грудной клетки.133 Более того, эти исследователи обнаружили, что отношение копчико-теменной длины темени к окружности грудной клетки является определяющей морфологической характеристикой фенотипа непропорционального чрезмерного роста плода. У клонированных плодов уменьшение копчико-теменной длины и/или сердцебиение плода были предиктивными ультразвуковыми маркерами гибели плода, которая произошла примерно у 27% клонов, умерших до 90 дня беременности.49 Эти исследователи отметили, что на основе ультразвуковых исследований после 100-го дня беременности факторы риска потери плодов, полученных из SCNT, включали отек плаценты, водянку и увеличение окружности живота.
Частота врожденных пороков развития, включая гидраллантоис и аномалии конечностей, повышена у телят от эмбрионов IVP (3,2%) по сравнению с контрольной группой ИО (0,7%).129 На 90-й день гестации IVP-беременности были связаны с увеличением копчико-теменной длины плода и веса органов по сравнению с контролем in vivo.134 На 180-й день гестации IVP-беременность была связана с бо'льшим весом матки, плаценты и плода по сравнению с контролем in vivo. Вес плода, его печени, сердца и вес плацентомы - все коррелировали и были значительно выше при IVP-беременностях.134 На 222-й день гестации плоды от IVP-эмбрионов были на 17% крупнее, чем в контрольной группе, произведенной в естественных условиях, и демонстрировали значительное увеличение массы тела плода, размера сердца, веса сердца и длины длинных костей.45 Кроме того, у плодов из IVPэмбрионов не наблюдалось разницы в общей массе висцеральных органов, но показатели скелетных мышц на килограмм массы тела были меньше по сравнению с плодами из группы in vivo, что позволяет предположить, что развитие плодов IVP непропорционально их массе тела.
Гистологически плоды IVP на 222-й день гестации демонстрировали значительно большее соотношение числа вторичных и первичных волокон скелетных мышц, чем в контрольной in vivo группе. Также пропорциональный объем ткани, присутствующей между миофибриллами, был больше в мышцах IVP-плодов по сравнению с контролем.135 Экспрессия мРНК миостатина была снижена в скелетных мышцах плодов из группы IVP, в то время как экспрессия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) имела тенденцию к увеличению по сравнению с группой, полученной in vivo. Эти наблюдения согласуются с наблюдаемыми изменениями в соотношении мышечных волокон, поскольку миостатин является ингибитором развития мышечных волокон, а GAPDH является ключевым ферментом в гликолизе - пути, который активно используется вторичными мышечными волокнами.135
Показатели перинатальной смертности 8,6–15,6% среди IVP- телят при рождении или вскоре после рождения были зарегистрированы у телок-реципиентов и достигали 17,9% у коров-реципиентов.7,54,129 Напротив, уровень перинатальной смертности телят от ИО составлял приблизительно 6,2–9,0% для беременностей с переносом эмбрионов in vivo.22,129 В одних исследованиях сообщалось об увеличении срока беременности для IVP-плодов129 , в то время как в других - нет.44 Частота мертворождений и перинатальной смертности в течение первых 48 часов после отела была увеличена у IVP-телят по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo, но не из-за изменения продолжительности беременности.136 Мертворождение и послеродовая смертность также увеличивались при беременностях с SCNT. Только около 70% клонированных плодов крс выживают в перинатальном периоде, и эти потери, как правило, распространяются на первую неделю постнатальной жизни (см. ссылку 48). По данным национального опроса 2012 года, проведенного Министерством сельского хозяйства Японии, из 594 клонированных телят, родившихся в Японии в период с 1998 по 2007 год, 14,8% были мертворожденными, а 95% умерли в течение 24 часов после родов.137 Частота отелов при SCNT-беременностях (5,1–12,6%) также была ниже, чем при переносе эмбрионов in vivo (23,9–34,8%) и IVP (20,2–22,3%).132 По данным 5- летней практики коммерческого клонирования в США, Аргентине и Бразилии,49 из 3374 перенесенных эмбрионов SCNT, 41% были живы на 30-й день беременности, но только 9% от общего числа перенесенных эмбрионов привели к живорождению. Из этих 388 живых SCNT-телят около 42% умерли в период между родами и 150 днем жизни.49 Эффективность клеточных линий для успешного получения жизнеспособных беременностей SCNT варьировалась от 0 до 45%, при этом около 24% клеточных линий не давали живых телят.49
Наиболее заметными аномалиями, наблюдаемыми в перинатальном периоде после переноса эмбрионов IVP, являются появление телят с большой массой тела при рождении в сочетании с более широким распределением показателей массы тела при рождении по сравнению с контрольной группой in vivo. Высокий уровень перинатальных потерь, ассоциированный с IVP-беременностью, в значительной степени может быть связан с дистоцией, возникающей в результате крупноплодия.44,59 Дистоция может иметь долгосрочные последствия для здоровья, продуктивности и будущей репродуктивной способности животных-реципиентов.59 Высокий вес при рождении, связанный с пересадкой IVP-эмбрионов был зарегистрирован среди нескольких пород Bos taurus, включая голштинскую, ангусскую, симментальскую и японскую черную.55,129,136,138,139 Перенос IVP-продуцированных эмбрионов у индийского крупного рогатого скота породы Гир также привел к более высокому весу при рождении, чем в контрольной группе от ИО, особенно выраженном среди бычков.140 Интересно, что IVP-телята показали не только более высокий вес при рождении, но и повышенные концентрации фруктозы в плазме после рождения по сравнению с контрольной группой in vivo.134 Эти факторы, повидимому, связаны с метаболическим расстройством у IVP-телят.
Общие морфологические аномалии, о которых сообщалось после переноса эмбрионов SCNT, включали увеличенную пуповину, респираторные проблемы, длительное лежачее положение и контрактуру сухожилий сгибателей.49 Кроме того, клонированные телята демонстрировали другие аномалии при рождении, включающие гипотермию, гипогликемию, тяжелый метаболический ацидоз и гипоксию, хотя эти параметры не имели достоверной корреляции с массой тела при рождении. Поскольку концентрации инсулина в плазме были значительно повышены, а концентрация глюкагона в плазме коррелировала с массой тела при рождении, аберрантная доступность энергии и ее использование в утробе матери могут вызывать состояния, аналогичные тем, которые наблюдаются при гестационном диабете у человека.141 При рождении у клонированных телят часто наблюдается респираторный дистресс-синдром142 , а в некоторых случаях наблюдается левосторонняя кардиопатия с расширением желудочков и легочной гипертензией.142 Кроме того, при рождении телят, которые выглядели аномальными, также наблюдался отек плаценты.142 В других исследованиях сообщалось об увеличении пупочных сосудов и различной степени отека, а также о таких заболеваниях, как руменит, абомазит и кокцидиоз при рождении.15,20,52,64,143 Среднее количество плацентом также было ниже, а средний вес плацентом выше в плаценте клонированных телят по сравнению с контрольной группой IVP.52
Плоды и телята от эмбрионов IVP или SCNT демонстрируют правостороннее распределение веса по сравнению с ИО или in vivo полученными контролями.52,54,55,144 Клонированные телята при рождении были на 20% крупнее по сравнению с телятами, полученными в результате переноса in vivo эмбрионов или ИО-телят, и имели более значительные различия в весе при рождении.33 Интересно, что клонированные телята, полученные из ооцитов, созревших in vitro, имели значительно более высокий вес при рождении, чем клонированные телята, полученные из ооцитов, созревших in vivo. Фактически, средний вес при рождении телят-самок, полученных in vitro, был значительно выше, чем у in vivo полученных телят-самцов.79 Сообщалось, что доля потомства мужского пола, полученного в результате переноса эмбрионов IVP, увеличилась по сравнению с ожидаемым соотношением 1:1 по сравнению с контрольной группой ИО, где сохранялось нормальное соотношение полов.104,129,140 Напротив, в других исследованиях не сообщалось о различиях в доле самцов, рожденных после переноса эмбрионов IVP.45,54,145
Плоды, полученные из IVP-эмбрионов, также могут отличаться по экспрессии генов и белков по сравнению с плодами, полученными in vivo. На 90-й день гестации IVP-беременности были связаны с более низкими концентрациями глюкозы у плода, чем в контроле in vivo.128 Экспрессия мРНК IGF2 была вдвое выше в ткани печени на 63-й день, но уменьшилась в ткани скелетных мышц плодов, полученных из эмбрионов IVP, по сравнению с таковой в контрольной группе, полученной in vivo.146 Кроме того, скелетная мышечная ткань IVPплодов на 222-й день гестации имела более низкую экспрессию мРНК миостатина и имела тенденцию к повышению экспрессии мРНК GAPDH по сравнению с контролем in vivo.147 Напротив, несмотря на различия в морфологии плода и плаценты на 90-й или 180-й день гестации между беременностями, полученными переносом IVP- или in vivo-эмбрионов, не было обнаружено значительных различий в уровнях экспрессии мРНК в печени плодов и тканях плаценты при этих беременностях, когда для анализа использовалось 13000 олигонуклеотидных микрочипов.148 Поскольку эти результаты противоречили данным более ранних исследований, Jiang и др.148 предположили, что аномальная экспрессия генов может быть специфичной для стадии развития и ткани. С другой стороны, ограниченное количество наблюдений, используемых в каждой подгруппе обработка/стадия в сочетании с ограниченным размером массива экспрессии могло препятствовать идентификации различий в экспрессии мРНК.
Развитие плаценты
Помимо аномалий плода, получение телят путем переноса эмбрионов IVP или SCNT связано с дефектами развития плаценты и кровообращения. Плаценты при беременностях IVP или SCNT плодами могут отличаться морфологией, функцией, экспрессией генов, выработкой гормонов или белка по сравнению с плацентами при пересадке in vivo эмбрионов или беременности от ИО.15,51,52,59,62,149 Нарушения плацентации и функции плаценты могут повлиять на рост и развитие этих плодов, полученных с помощью методов in vitro. Аномалии развития плаценты еще более выражены при беременности с эмбрионами SCNT; фактически, большинство случаев невынашивания беременности при SCNT связано с плацентарной недостаточностью.62, 142 Напротив, при нормальных беременностях (полученных in vivo) большая часть потерь происходит из-за аномалий развития плода.54
Потеря IVP-беременностей на ранних сроках может быть связана с аномалиями и сбоями в развитии плаценты. Общие морфологические аномалии, зафиксированные в плаценте IVP, включают увеличение размера (плацентомегалия), увеличение объема плацентарной жидкости (гидроллантоис) и уменьшение площади поверхности плацентом (см. Ссылку 59). При анализе плаценты на 70-й день беременности от эмбрионов, полученных in vitro с использованием либо полуопределенной ( полусинтетической) культуральной среды (mSOF), либо неопределенной (натуральной) среды с добавлением сыворотки (M199), и в сравнении с in vivo продуцированными контролями, 51 из плацент от эмбрионов, полученных в среде mSOF, были тяжелее, имели пониженную производительность, меньшее количество плацентом и меньшее количество плацентарной жидкости по сравнению с таковыми в группе М199 или с контрольными группами in vivo. Кроме того, плаценты из группы mSOF имели пониженную плотность кровеносных сосудов и уровни мРНК фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в котиледонах, что свидетельствует о нарушении развития сосудов. Кроме того, наблюдалась повышенная плотность пикнотических клеток (клетки со сморщенным ядром из-за потери воды) плода в плацентомах из группы mSOF по сравнению с контрольными группами M199 и in vivo, что указывает на повышенную гибель клеток в ворсинах плода.51 Другие аномалии плаценты, которые наблюдались при беременностях с IVP на ранних сроках, включают различия в распределении размеров плацентом, их весе и площади поверхности на 90-й и 180-й дни гестации.128,134 Более того, плацентомы, непосредственно окружающие плод, были длиннее и тоньше в течение первого триместра IVP-беременностей по сравнению с контрольной группой. На 180-й день беременности увеличение площади поверхности плацентом и их веса было связано с повышенным накоплением глюкозы и фруктозы в плазме и жидкостях плода.134 Несмотря на то, что плаценты у IVP-беременных коров имели значительно меньшее количество котиледонов, чем плаценты от контрольных животных in vivo, они имели большую площадь поверхности котиледонов. Была выдвинута гипотеза, что повышенное использование питательных веществ у более крупных IVP-плодов может быть ответственным за более высокий вес плода, наблюдаемый в этой экспериментальной группе.128, 134
Плаценты первого триместра у беременных с SCNT-плодами могут не иметь надлежащей васкуляризации и демонстрировать аномалии, включая гипоплазию и отставание котиледонарного развития.62,150–153
