Воспроизводство крупного рогатого скота

Гестационный период Неонатальный Теленок
период
Потеря Компенсация при
беременности при АОС типа IV и
AOS типа I до 42 дня Потеря выживание телят
беременности при
AOS типа II на 42–
280 день AOS типа III на
поздних сроках
беременности или
неонатальные потери

Рисунок 67.2 Классификация подтипов синдрома аномального потомства (AOS).

Признаки, связанные с AOS у крупного рогатого скота, были распределены на четыре типа⁵⁹ (рис. 67.2). При AOS I типа аномалии проявляются при установлении беременности. У крупного рогатого скота это происходит в период между 0 и 42 днями беременности, когда происходит органогенез. При AOS типа II возникают аномалии, которые связаны с неспособностью поддерживать фетоплацентарную единицу, что приводит к аборту в период после органогенеза до доношенного срока, а именно между 42 и 280 днями беременности у крупного рогатого скота. При AOS III типа в фетоплацентарной единице может возникнуть ряд аномалий, которые менее серьезны или допускают компенчацию плодом и плацентой, что позволяет беременности дойти до срока; однако, во время родов или в неонатальном периоде плод не выживает, что приводит к неонатальным потерям. Эти невыжившие потомки демонстрируют измененные клинические, гематологические или биохимические параметры. При AOS IV типа в фетоплацентарном развитии так же может возникнуть ряд аномалий, которые либо менее серьезны, либо допускают компенсацию за счет плода и плаценты. В этом случае беременность удается доносить, а новорожденный теленок выживает; однако потомство может все еще демонстрировать отличия в анатомии, физиологии или метаболизме по сравнению с животными от эмбрионов без вмешательства.

Производство эмбрионов in vitro связано с более высокой частотой потерь в раннем и среднем гестационного возрасте.^45,59 Эти случаи представляют собой AOS типа II, при этом потери беременности обычно происходят между 40 и 90 днями гестации.⁴⁵ Точно так же большинство беременностей SCNT прерываются между 40 и 90 днями гестации^15,62 и также могут быть классифицированы как AOS типа II. В этом случае потери обычно связаны с неправильным развитием плаценты.⁶² Когда беременность с SCNT действительно сохраняется, у 65–70% новорожденных обнаруживается какая-либо форма AOS, и их состояние классифицируется как AOS типа III или IV. В некоторых случаях для поддержки выживания новорожденного требуется интенсивная терапия, без которой новорожденный, как правило, не выживает (тип III AOS), тогда как в других случаях требуется небольшая помощь или не требуется вовсе (тип IV AOS).⁵⁷

Характеристики, связанные с AOS в период

развития крупного рогатого скота

У крупного рогатого скота выраженность аномалий, связанных с АОС, может варьироваться от изменений экспрессии генов в эмбрионах на доимплантационной стадии⁶³ до умеренных изменений с незначительными очевидными фенотипическими проявлениями⁵⁷ и серьезных изменений фенотипа, сопровождающихся абортом или неонатальной смертью^59,62,64 (рис. 67.3).

На экспрессию AOS влияют условия культивирования,^58,65,66 вид животного,⁶¹ степень манипуляции с эмбрионом,^15,67 и даже уровни материнских питательных веществ.⁶⁸ На любой конкретной стадии развития каждый эмбрион, плод или теленок не проявляет единообразного набора характеристик AOS. Поэтому мы стремились собрать данные наблюдений об изменении характеристик, связанных с манипуляциями с эмбрионами крупного рогатого скота in vitro, на различных стадиях развития. Однако, в каждом случае не всегда было установлено прямое соответствие между типом манипуляции, измененной характеристикой и возникновением AOS.

Гаметы

Сперматозоиды

Существует ограниченное количество сообщений, в которых предполагается, что изменения в среде для обработки сперматозоидов in vitro до оплодотворения могут быть связаны с аномалиями в последующем развитии эмбриона.^69,70 Например, воздействие на сперму быка поливинилпирролидона (ПВП), агента, обычно включаемого в среду для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов,⁷⁰ увеличивало частоту акросомной реакции сперматозоидов после 30 или 60 минут воздействия ПВП и уменьшало долю ооцитов, оплодотворенных ПВП-обработанной спермой, после совместной инкубации с ооцитами, созревшими in vitro.⁶⁹ Однако неясно, оказало ли воздействие ПВП на сперматозоиды до оплодотворения какое-либо влияние на последующее развитие образующихся зигот с точки зрения морфологии, времени расщепления, времени образования бластоцелей или внутренней клеточной массы и количества клеток трофобласта.

Ооциты

Ооциты на стадии метафазы II мейоза выходят из преовуляторных фолликулов, которые у крупного рогатого скота обычно составляют от 18 до 22 мм в диаметре. В отличие от многоплодных видов, таких как свиньи, у крупного рогатого скота технически сложно получить большое количество созревших in vivo ооцитов для лабораторных манипуляций. Следовательно, ооциты крупного рогатого скота, используемые как для процедур IVP, так и для SCNT, созревают in vitro. Ооциты коров, используемые для систем продуцирования in vitro, как правило получают из фолликулов диаметром 2–10 мм, и восстанавливают на стадии диктиотены (форма диплотены профазы I деления мейоза, характеризующаяся большей продолжительностью (до нескольких месяцев и даже лет) в связи с прохождением этапа вителлогенеза - накопления желтка) в профазе I мейоза.

Эмбрион Концепт Плод
Выживаемости эмбриона Выживаемости концепта Смертности плода
Общего числа клеток Вырождение/ фрагментация Массы тела
Аномальная плоидность Изменение длины трофобласта Измененное развитие органов
Измененная экспрессия Измененная экспрессия генов Измененный метаболизм
генов Измененная экспрессия генов
Плацента Теленок Реципиент
Масса плаценты Перинатальной смертности Абортов
Аномальные плацентомы Веса при рождении Продолжит. беременности
Аномальная сосудистая сеть Врожденных дефектов Дистоции/кесарева сечения
Водянка Респираторных проблем Измененная экспрессия
Гидроаллантоис Измененное соотношение эндометриального гена
Измененная экспрессия генов полов

Рисунок 67.3 Выявление аномалий, обычно связанных с синдромом аномального потомства (AOS). В отдельных случаях каждая из перечисленных аномалий может присутствовать или отсутствовать.

Эти диктиатные ооциты должны быть подвергнуты созреванию in vitro (IVM) на протяжении 20–24 часов, в течение которых они достигают стадии метафазы II мейоза и становятся готовыми к оплодотворению. В то время как 50–80% созревших in vivo ооцитов развиваются до стадии бластоцисты после оплодотворения, только 15-40% созревших in vitro ооцитов достигают стадии бластоцисты в стандартных системах продуцирования in vitro.^71–75 Более того, бластоцисты из ооцитов, созревших in vitro, имеют меньшеее количество клеток на эмбрион⁷⁵ и во внутренней клеточной массе^76– 78, чем бластоцисты из ооцитов, созревших in vivo. Таким образом, развитие трансгенных бластоцист было больше из ооцитов, созревших in vivo, по сравнению с ооцитами, созревшими in vitro.⁷⁹ У овец больше беременностей было произведено из бластоцист SCNT, полученных из созревших in vivo цитопластов ооцитов, по сравнению с бластоцистами SCNT из цитопластов ооцитов, созревших in vitro.

Напротив, не было разницы в частоте наступления беременности после переноса трансгенных эмбрионов на стадиях морулы или бластоцисты в зависимости от того, были ли они из условий созревания in vivo или in vitro.⁷⁹ Но для трансгенных бластоцист, полученных из ооцитов крупного рогатого скота, созревших in vivo, по сравнению с ооцитами, созревшими in vitro, наблюдалась разница в соотношении полов у телят, с более высоким процентом самцов, рожденных в группе созревших in vitro по сравнению с группой, оплодотворенной in vivo.⁷⁹ Интересно, что средний вес при рождении самцов или самок трансгенных телят в результате переноса бластоцист, полученных из ооцитов, созревших in vitro, был значительно выше, чем у телят самцов или самок из бластоцист, полученных из ооцитов, созревших in vivo.⁷⁹ Кроме того, 48% телят из ооцитов, созревших in vitro, имели при рождении 45 кг или более, тогда как только 19% телят из ооцитов, продуцированных in vivo, имели при рождении 45 кг или более. Наконец, телята-самки, полученные из ооцитов, созревших in vitro, были значительно тяжелее телят-самцов, полученных из ооцитов, созревших in vivo. В совокупности наблюдения как по крупному рогатому скоту, так и по овцам подтверждают вывод о том, что различия между условиями созревания ооцитов in vitro и in vivo играют важную роль в определении возникновения, по крайней мере, IV типа AOS, а также, возможно, других подтипов AOS.

К другим факторам, которые могут повлиять на нормальное развитие ооцитов, относятся балл упитанности и кормление.⁸¹ Ооциты, полученные от телок в умеренной кондиции, которые получали рацион с высоким уровнем обменной энергии, показали снижение выхода бластоцист IVP, в то время как ооциты телок, которые находились в низкой кондиции при таком же высоком уровне пищевой энергии, показали улучшенное развитие бластоцист in vitro.⁸¹ Ооциты телок на рационах, предназначенных для выработки повышенных уровней аммиака в плазме, продемонстрировали снижение компетентности (способности) к развитию in vitro (от стадии расщепления на 2 клетки до стадии бластоцисты) по сравнению с контрольной группой.⁸² У овец эмбрионы, полученные in vitro из ооцитов, подвергшихся in vivo воздействию повышенного содержания кормового азота мочевины, продемонстрировали снижение частоты наступления беременности после переноса.⁶⁸ Взятые вместе, эти наблюдения дают представление о возможных механизмах, объясняющих ранние наблюдения того, что диеты с высоким содержанием белка связаны со снижением плодовитости молочного скота⁸³ , а также дают представление о потенциальных механизмах, способствующих возникновению АОС типа I.

Преимплантационное развитие

У крупного рогатого скота эмбрионы обычно переносятся на 7-й день беременности на стадии развития бластоцисты. Наибольшая потеря стельности у крупного рогатого скота происходит в течение первых 2–3 недель беременности, при этом большая часть потерь приходится на 8–16-й день.⁸⁴ По сравнению с ИО или переносом эмбрионов, произведенных in vivo, эмбрионы IVP могут демонстрировать даже более высокие показатели ранней эмбриональной гибели; однако, это может зависеть от качества перенесенного эмбриона. Например, коэффициенты выживаемости для эмбрионов крупного рогатого скота 1 степени качества были одинаковыми независимо от того, получены ли они in vivo или in vitro; но для эмбрионов 2-го уровня качества выживаемость была ниже, если они были получены из систем производства in vitro.⁴⁵ Процент стельностей и процент отелов после переноса эмбрионов IVP различаются как между лабораториями, так и внутри них, хотя они могут быть ниже, чем те, которые наблюдаются после ИО или переноса эмбрионов, полученных in vivo.^{54,55,85–88}

Другие факторы, такие как оценщик эмбрионов⁸⁹ и характеристики реципиента⁸⁶ , также могут влиять на успешное установление и поддержание беременности после переноса незамороженных in vivo и IVP эмбрионов крупного рогатого скота.

Эмбрионы крупного рогатого скота на предимплантационной стадии, полученные in vitro, отличаются по морфологии по сравнению с эмбрионами, полученными in vivo. При выращивании в среде, содержащей сыворотку, эмбрионы крс выглядят более темными, имеют менее организованную внутреннюю клеточную массу и менее компактны.^76,78 Эмбрионы IVP, независимо от того, производятся ли они в среде с сывороткой или без нее, имеют большее количество липидных капель, больше незрелых митохондрий и не демонстрируют сопоставимого увеличения плотности митохондрий при переходе от стадии морулы к стадии бластоцисты по сравнению с эмбрионами in vivo.^53,90–94

Общее количество клеток на бластоцист и распределение бластомеров во внутренней клеточной массе бластоцист также различаются между системами продуцирования in vitro и in vivo. Бластоцисты IVP демонстрируют меньшее число клеток и меньшую долю клеток, относящихся к внутренней клеточной массе.^94,95 Также существуют различия в степени аномальной плоидности (числа хромосом) среди бластомеров эмбрионов, полученных in vivo, по сравнению с их аналогами in vitro.⁹⁶ В то время как только 20-25% бластоцист из систем продуцирования in vivo демонстрируют миксоплоидию, приблизительно 45-70% бластоцист IVP были определены как миксоплоидные с частотой, зависящей от метода, используемого для определения числа хромосом.^97,98 Хотя эмбрионы, несущие повышенную долю миксоплоидии, могут успешно вынашиваться и поддерживать беременность,⁹⁶ резкое увеличение числа миксоплоидных бластомеров не способствует выживанию эмбрионов.⁹⁹

Ранние сравнения экспрессии генов предимплантационных эмбрионов крс, полученных in vivo и in vitro, продемонстрировали, что на экспрессию как импринтированных (активны только аллели от одного родителя) , так и не импринтированных генов может влиять продукция эмбрионов in vitro.^100–109 Дополнительное подтверждение гипотезе о том, что способность бластоцист устанавливать беременность связана с экспрессией определенных наборов генов, было предоставлено исследователями, которые проанализировали экспрессию мРНК из биопсийных образцов бластоцист, взятых до переноса эмбриона, и сопоставили ее с последующими событиями после переноса. Было обнаружено, что бластоцисты, которым не суждено установить беременность, экспрессируют повышенные уровни ингибитора имплантации CD9, а также воспалительных цитокинов фактора некроза опухоли (TNF) и мРНК, связанных с метаболизмом углеводов.¹¹⁰ Напротив, бластоцисты, перенос которых завершился рождением теленка, продемонстрировали повышенную экспрессию ряда специфических мРНК, в том числе некоторых, связанных с имплантацией (COX2, CDX2, PLAC8) и дифференцировкой (BMP15). Эти наблюдения согласуются с более ранним отчетом о корреляции профилей экспрессии мРНК с успешностью посттрансферной беременности пар демиэмбрионов (полуэмбрионы после разделения исходного эмбриона) , полученных путем расщепления бластоцист, полученных от суперовулированных коров-доноров.¹¹¹ Эти исследователи также отметили повышенную экспрессию PLAC8 у демиэмбрионов, чья двойная демибластоциста была связана с рождением теленка после переноса. Чтобы ответить на вопрос, когда профили мРНК, предсказывающие компетентность (способность к) в развитии, могут быть определены во время развития, Held et al.¹¹² оценили характер экспрессии мРНК у изолированных бластомеров из двухклеточных IVP-эмбрионов крупного рогатого скота с компетентностью в развитии их сестринских бластомеров.

Эти исследователи определили, что сестринские бластомеры, которым суждено развиться до стадии бластоцисты, экспрессировали повышенные уровни мРНК, связанные с реакциями на окислительный стресс, антиоксидантной активностью и окислительным фосфорилированием.¹¹² В совокупности эти наблюдения подтверждают, что сигнатуры мРНК эмбрионов на различных стадиях развития могут быть связаны как с исходом развития до, так и после переноса. Более того, они согласуются с гипотезой о том, что в будущем также могут быть идентифицированы специфические сигнатуры мРНК у эмбрионов, предназначенных для демонстрации определенных подтипов AOS после переноса эмбриона. Это, в свою очередь, поддержит разработку процедур скрининга эмбрионов перед переносом или усовершенствование методов получения эмбрионов in vitro для устранения возникновения АОС. Например, было продемонстрировано, что включение в среду, используемую для производства эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, специальных добавок, включая инсулиноподобный фактор роста (IGF)-1, колонистимулирующий фактор (CSF)-2 и гиалуронан, увеличивает процент стельностей после переноса.¹¹³ Интересно, что добавление CSF2 в культуральную среду устраняет возможность потери эмбриона до 35 дня беременности (тип I AOS); однако, количество наблюдений в этом исследовании было несколько ограниченным.¹¹³

Пери-имплантационное развитие

Подсчитано, что у молочных коров со средней продуктивностью наблюдается около 40% эмбриональной и плодной смертности; около 70–80% этих потерь приходится на период с 8 по 16 день стельности.¹¹⁴ Материнское распознавание беременности у крупного рогатого скота происходит примерно на 15-16 день беременности и требует адекватной экспрессии тау-интерферона (IFN) в развивающемся концептусе для предотвращения лютеолитического каскада.^115,116 Более высокий уровень потерь наблюдаются в периимплантационном периоде среди концептов после переноса IVP-эмбрионов.^{53,105,117,118} Сходным образом значительная потеря эмбрионов была зарегистрирована в течение 2-х недель после переноса IVP- и SCNT- эмбрионов, хотя часть этих потерь может быть связана с трудностями в восстановлении этих концептов. Например, после переноса IVP-эмбрионов наблюдалось 51,2% выживляемость на 12-й день и 33–38% на 14-й день.^105,119 На 14-й день было потеряно 75% перенесенных эмбрионов IVP по сравнению с 85– 93% эмбрионов SCNT.¹¹⁸ На 25-й день беременности было обнаружено только 19% и 15% концептов, полученных из IVP и клонированных эмбрионов, соответственно, по сравнению с 67% концептов, полученных с помощью ИО.¹²⁰

В дополнение к более низким показателям выживаемости концептов, полученных из IVP-эмбрионов, также обнаруживают некоторые морфологические отличия от таковых, полученных in vivo. У концептов, полученных из эмбрионов IVP, извлеченных на 17й день гестации, наблюдалась повышенная частота фрагментации и/ или дегенерации по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo.⁴⁵ Кроме того, концепты IVP также длиннее, чем концепты, полученные in vivo, как на 12-й, так и на 17-й день гестации.^105,117 Напротив, другие исследователи не обнаружили статистической разницы в уровне выживаемости интактных концептов на 16-й день между IVP и in vivo группами; тем не менее, они сообщили, что было больше целых структур или дегенерированных невылупившихся эмбрионов, извлеченных в группе IVP по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo.¹⁰⁴