Воспроизводство крупного рогатого скота

Считается, что это нарушает функцию мембранных белков, которые необходимы для структурной целостности (цитоскелет) или ионного метаболизма (ионные насосы).⁶ Основные изменения в сперматозоидах быков во время этой фазы происходят при температуре около 15–5 °C, но не происходят при температуре ниже 0 °C.⁶ Второе важное изменение в окружающей среде совпадает с образованием кристаллов льда после охлаждения раствора до температуры от –5 до –15 ° C. Высвобождение «скрытой теплоты плавления» (тепло, выделяемое при переходе из жидкой фазы в твердую или поглощаемое при переходе в обратном направлении) затем вызывает резкое нагревание образца до тех пор, пока не будет достигнута температура замерзания/таяния раствора (оставшейся незамерзшей фракции).⁶ Это приводит к самопроизвольному зарождению (нуклеации) льда, поскольку раствор переохлажден и кристаллы льда затем быстро растут во всех направлениях. Образование льда будет зависеть от скорости дальнейшего охлаждения среды, и остается так называемая незамерзшая фракция, в которой находятся все растворенные вещества. Осмоляльность этой фракции увеличивается из-за повышенной концентрации глицерина, сахаров и солей и вызывает быстрый отток воды из клеток или клеточную дегидратацию. Фактически, быстрое охлаждение на такой стадии может привести к очень внезапным изменениям размера, формы и ультраструктуры клеток, а также к структурной деформации. Сперматозоиды могут оказаться ограниченными очень узкими каналами незамерзшего раствора, зажатыми между растущими массами льда, что также может привести к механическому стрессу в клетках. По мере дальнейшего охлаждения эти процессы продолжаются до тех пор, пока вязкость незамороженной фракции не станет слишком высокой для дальнейшей кристаллизации. Двухфакторная теория объясняет влияние скорости охлаждения на сперматозоиды.^58,59 Медленные скорости охлаждения подвергают сперматозоиды влиянию "эффекта «растворения», при котором происходит увеличение концентрации соли, увеличение осмоляльности и изменение pH, тогда как высокие скорости могут не позволить внутриклеточной воде выйти, что приведет к нуклеации внутриклеточного льда. Оптимальная скорость охлаждения спермы перед замораживанием у домашних животных обычно находится в диапазоне 10–100 ° C/мин⁵⁴ и способствует хорошей выживаемости после оттаивания. У быков скорость охлаждения может составлять от 50 до 60 °C/мин, хотя Woelders и др.¹³ предложили скорость охлаждения до 100 °C/мин с оптимальными результатами. Одним из преимуществ таких высоких скоростей охлаждения может быть снижение концентрации глицерина в среде, поскольку считается, что глицерин защищает от повреждающих эффектов при медленном охлаждении. Это также поможет избежать осмотического повреждения, вызванного высокими концентрациями глицерина, которые в настоящее время используются для замораживания спермы крупного рогатого скота. Однако, существуют технические трудности в достижении такой равномерной скорости охлаждения соломинок независимо от их положения в морозильных аппаратах.¹³ В настоящее время доступны два варианта замораживания бычьей спермы: контролируемое замораживание с использованием автоматических программируемых морозильников и традиционное вейперное замораживание (непрограммируемое) путем удерживания соломинок со спермой над парами жидкого азота в определенное время и на определенном расстоянии. Коммерческие аппараты для замораживания спермы (рис. 71.3) позволяют точно контролировать температуру внутри охлаждающей камеры, а также программировать изменение температуры во времени. Однако, поскольку соломинки со спермой размещаются более чем в одном слое, это способствует значительному изменению скорости охлаждения в отдельных слоях в течение цикла замораживания, и изменение температуры внутри соломинок во времени может быть различным из-за генерации скрытой теплоты плавления.

Кроме того, программируемые морозильные камеры более дорогостоящие и не обязательно дают более удовлетворительные результаты, особенно для опытных техников и криобиологов. Традиционное замораживание паром или непрограммируемое замораживание может быть выполнено путем частичного заполнения невентилируемой коробки из пенополистирола жидким азотом и замораживания соломинок, расположенных на решетке, помещенной внутри коробки (рис. 71.4). Высота соломинок над жидким азотом определяет скорость теплообмена, при этом скорость снижения температуры составляет от 150 до 300 °C/мин. Кроме того, преимущество традиционных морозильных камер заключается в том, что все соломинки в любом заданном цикле замораживания подвергаются одинаковой скорости охлаждения, поскольку соломинки размещаются в один слой над уровнем жидкого азота. В непрограммируемых морозильных камерах кривая охлаждения (время охлаждения и замораживания) по умолчанию имеет форму, которая теоретически считается оптимальной для медленного замораживания.⁶⁰ Это приводит к относительно низким скоростям охлаждения сразу после начала образования льда и более высоким скоростям охлаждения позже. В непрограммируемых системах общую крутизну кривой замораживания можно регулировать, выбирая высоту расположения соломинок над жидким азотом, которая пропорциональна температуре пара вокруг соломинок.

Оттаивание и хранение спермы

Замороженные сперматозоиды могут быть повреждены в процессе оттаивания, так как процессы в клетках имевшие место во время замораживания происходят с точностью наоборот. Во время медленного оттаивания может происходить рекристаллизация ультрамикроскопических кристаллов льда с образованием сравнительно крупных кристаллов льда^6,13 , когда сперматозоиды проходят через критическую температурную зону от –5 до –15 °C⁶¹ , и они могут повредить сперматозоиды. Более быстрая скорость оттаивания (оптимально: 37 °C в течение как минимум 45 с) ограничивает время перекристаллизации и, таким образом, увеличивает выживаемость сперматозоидов. Однако, когда продолжительность оттаивания недостаточна для оттока избытка криопротектора из клетки, она испытывает осмотический стресс, и сперматозоиды набухают и лизируются, поскольку среда резко разбавляется за счет таяния внеклеточного льда.⁶² На скорость оттаивания могут влиять такие факторы, как температура и характер окружающей среды (воздух или вода в термостате), а также теплопроводность упаковки в зависимости от диаметра просвета упаковки (соломинки) . Более быстрая скорость оттаивания может быть достигнута за счет использования более высоких температур в течение более коротких периодов времени (например, 65 ° C в течение 5 с); но необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать перегрева спермы.

Правильное хранение соломинок со спермой и обращение с ними - решающий фактор, который может оказывать сильное влияние на успех любой программы искусственного осеменения. Сперма обычно фасуется в соломинки объемом 0,5 мл, хотя некоторые организации (особенно в Европе) предпочитают упаковку в соломинки объемом 0,25 мл. Независимо от размера процедура обработки одинакова, и соломинки обычно помещают в стаканчики, которые, в свою очередь, прикрепляют к металлической трости. Трости соответственно идентифицируются по кличке быка или идентификационному номеру и хранятся в канистрах специально разработанных резервуаров (сосудов) с жидким азотом. Хотя подробное описание конструкции резервуара с жидким азотом выходит за рамки данной главы, необходимость надлежащего ухода за ним при хранении и обращении невозможно переоценить. Хотя резервуары для спермы сконструированы прочными, они более хрупкие, чем кажутся, и требуют регулярной проверки и внимания, чтобы продлить их срок службы. Невыполнение этого требования может привести к потере или снижению оплодотворяемости из-за ухудшения качества спермы. Сосуды следует хранить в сухом, хорошо освещенном и хорошо проветриваемом помещении, вдали от прямых солнечных лучей. Их следует держать на возвышении над бетонным полом или другими влажными и плохо вентилируемыми поверхностями, поскольку коррозия внешней оболочки сокращает срок службы резервуара и может привести к выходу его из строя. Одним из основных внешних признаков неисправности резервуара является нарастание инея (особенно вокруг горловины), указывающее на потерю вакуума. Уровень жидкого азота в резервуарах необходимо регулярно контролировать и при необходимости доливать. При извлечении соломинок из сосуда канистры должны удерживаться как можно ниже, чтобы поддерживать температуру соломинок на постоянном уровне –196 °C. Если соломинку невозможно извлечь или обнаружить в канистрах менее чем за 10 с, канистру следует опустить обратно в резервуар и выдержать не менее 20 с для повторного охлаждения перед повторной попыткой.

Пошаговая процедура двухэтапного протокола

криоконсервации спермы крупного рогатого скота

Обратите внимание: если инструкции для шприца-катетера, поставляемого производителем, отличаются, рекомендуется следовать им.

1. Подготовьте фракцию A (содержащую буферы с добавлением 200 г яичного желтка) разбавителя и поместите в инкубатор перед сбором спермы. Поместите фракцию B (содержащую глицерин) разбавителя в холодильник.

2. После исследования и оценки качества и концентрации спермы медленно разбавьте сперму небольшим объемом подогретого разбавителя фракции А в 50-мл колбе. В зависимости от рассчитанного количества обрабатываемых соломинок эякулят может быть увеличен фракцией А до 50% расчетного конечного объема.

3. Разбавленную сперму можно охладить до 4 ° C, сначала выдерживая при комнатной температуре, а затем поместив в холодильник или холодное помещение. Образец следует выдержать при температуре 4 °C не менее 2-х часов. Разбавленная сперма также может быть помещена в водяную баню с той же температурой, а затем помещена для охлаждения до 4 °C. Это помогает со скоростью охлаждения.

4. Фракцию B, которая предварительно была охлаждена до 4 °C, теперь можно добавлять в разбавленную охлажденную сперму в соотношении 1:1 постепенно в течение 20 минут.

5. Сперма, достигшая конечной концентрации, должна быть снова помещена в холодное помещение или шкаф для уравновешивания (равномерного распределения разбавителя) на 4 часа. В это время маркируют соломинки, указывая соответствующую информацию (например, порода, регистрационный номер, кличка, дата). Их заполняют, запечатывают и кладут на стеллажи для замораживания и подсчета. Соломинки следует встряхнуть так, чтобы после заполнения и перед замораживанием пузырек воздуха находился в центре. Все процедуры следует проводить при температуре 4 °C в холодном помещении или холодильнике.

6. Соломинки замораживают, помещая их на решетку на расстоянии 5 см над уровнем жидкого азота в герметичном контейнере из пенополистирола. Таким образом, они выдерживаются над парами жидкого азота в течение примерно 15 минут, а затем погружаются в жидкий азот (рис. 71.5).

7. Затем соломинки загружают в трости (с информацией о быке) и переносят в канистры с жидким азотом. Следует разморозить одну соломинку, чтобы оценить ее подвижность и концентрацию. В идеале концентрация в каждой соломинке должна быть равна одной дозе осеменения (10–15 миллионов сперматозоидов). Она может быть скорректирована с учетом данных о фертильности быка, если таковые имеются.

Современные достижения в технологии

криоконсервации семени крс

За прошедшие годы появилось несколько достижений в области криобиологии, которые принесли огромную пользу индустрии ИО крупного рогатого скота. Они привели к разработке превосходных разбавителей спермы, стандартизированных оптимальных протоколов замораживания, прогнозированию оплодотворяющей способности сперматозоидов с помощью различных тестов на их жизнеспособность и лучшему пониманию патофизиологии повреждения сперматозоидов, связанного с криоконсервацией.

Современная потребность в борьбе с болезнями и отказе от применения биологических веществ животного происхождения в криозащитных средах привели к разработке разбавителей спермы на основе кокосового молока и соевого лецитина, которые, как было показано, обладают сходными с яичным желтком и обезжиренным молоком защитными свойствами. Было показано, что такие вещества, как синтетические липосомы⁶³ и нагруженные холестерином циклодекстрины⁶⁴ , обеспечивают лучшую защиту сперматозоидов во время криоконсервации и повышают выживаемость после размораживания. Также было исследовано добавление таких веществ, как антиоксиданты, к разбавителям спермы для ее защиты от активных форм кислорода и, в конечном итоге, от повреждений, связанных с перекисным окислением липидов. Куркумин (обладает антиоксидантными св-ми) , эритритол (сахарозаменитель)⁶⁵ и n-3 жирные кислоты в сочетании с α- токоферолом⁶⁶ показали многообещающие результаты касательно лучшей криовыживаемости сперматозоидов за счет изменения липидного состава мембран. Было показано, что добавление антиоксидантов, таких как метионин, карнитин и инозитол до начала процесса криоконсервации, предохраняет структуру ДНК от криоповреждений.⁶⁷

Недавние достижения в технологиях сублимационной сушки ( лиофилизации) сперматозоидов лошадей и последующее рождение живых жеребят от такого семени⁶⁸ открыли совершенно новую перспективу криоконсервации спермы. Хотя живых телят пока не поступало, лиофилизация бычьей спермы может предложить привлекательную альтернативу хранению спермы в жидком азоте. Поскольку лиофилизированная сперма может оплодотворять ооцит только с помощью таких процедур, как внутрицитоплазматическая инъекция спермы, и требует меньшего количества спермиев на дозу, количество доз, полученных на один эякулят, может буквально исчисляться сотнями тысяч. Лиофилизация спермы также может помочь преодолеть несколько недостатков, связанных с традиционным способом криоконсервации, таких как высокие затраты на техническое обслуживание, проблемы, связанные с транспортировкой замороженной спермы, а также случайные потери из-за неправильного контроля температуры.

Ссылки

1. Medeiros C, Forell F, Oliveira A, Rodrigues J. Современное состояние криоконсервации спермы: почему результаты не лучше? Theriogenology 2002;57:327–344.

2. Stewart D. Хранение сперматозоидов быка при низких температурах. Vet Rec 1951;63:65–66.

3. Bratton R, Foote R, Cruthers J. Предварительные результаты оценки оплодотворяющей способности замороженных сперматозоидов крупного рогатого скота. J Dairy Sci 1955;38:40–46.

4. Holt W. Основные аспекты хранения замороженной спермы. Anim Reprod Sci 2000;62:3–22.

5. Batellier F, Vidament M, Fauquant J и др. Достижения в технологии охлаждения спермы. Anim Reprod Sci 2001;68:181–190.

6. Watson P. Причины снижения оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы. Anim Reprod Sci 2000;60:481–492.

7. Mullen S, Critser J. Научные основы криобиологии. Cancer Treat Res 2007;138:83–109.

8. Salamon S, Maxwell W. Хранение спермы баранов. Anim Reprod Sci 2000;62:77–111.

9. Hammerstedt R, Andrews J. Поддержание метаболизма при нормотермии. В кн.: Karow A, Critser JK (ред.) Банкирование репродуктивных тканей . Сан-Диего, Калифорния: Academic Press, 1997, с. 136–166.

10. Gao D, Mazur P, Critser J. Основы криобиологии сперматозоидов млекопитающих. В кн.: Karow A, Critser JK (ред.) Банкирование репродуктивных тканей . Сан-Диего, Калифорния: Academic Press, 1997, с. 263–327.

11. Isachenko E. Витрификация сперматозоидов млекопитающих без криопротекторов: от прежних практических трудностей к нынешним успехам. Reprod BioMed Online 2003;6:191–200.

12. White I. Липиды и поглощение кальция сперматозоидами в связи с холодовым шоком и сохранением спермы: обзор. Reprod Fertil Dev 1993;5:639–658.

13. Woelders H, Mathiijs A, Engel B. Влияние трегалозы, сахарозы, осмоляльности среды для замораживания и скорости охлаждения на жизнеспособность и целостность сперматозоидов быка после замораживания и оттаивания. Cryobiology 1997;35:93–105.

14. De Leeuw F, Colenbrander B, Verkleij A. Роль повреждения мембран при холодовом шоке и повреждении вследствие замораживания. Reprod Domest Anim 1991;1:95–104.

15. Bailey J, Buhr M. Криоконсервация изменяет поток Ca2⁺ через мембрану сперматозоидов быка. Can J Anim Sci 1994;74:45–52.

16. Concannon P, Battista M. Замораживание спермы собак и искусственное осеменение. В кн.: Kirk RW, Bonagura JD (ред.) Современная ветеринарная терапия X . Филадельфия: WB Saunders, 1989, с. 1247–1258.

17. Phillips P. Сохранение спермы быков. J Biol Chem 1939;130:415.

18. Dunn H, Bratton R, Collins W. Оплодотворяющая способность и подвижность сперматозоидов быка в разбавителях на основе цельного яйца с буферными добавками. J Dairy Sci 1950;33:434–437.

19. Shannon P, Curson B. Влияние содержания яичного желтка на оплодотворяющую способность разбавленной спермы быков при хранении при температуре окружающей среды. NZ J Agric Res 1983;26:187–189.

20. Barak Y, Amit A, Lessing J, Paz G, Hommonai Z, Yogev L. Повышение частоты оплодотворения в программе экстракорпорального оплодотворения при использовании сперматозоидов, обработанных яичным желтком. Fertil Steril 1992;58:197–198.

21. De Leeuw F, De Leeuw A, Den Daas J, Colenbrander B, Verkleij A. Влияние различных криопротекторов и мембраностабилизирующих соединений на целостность мембран сперматозоидов быка после охлаждения и замораживания. Cryobiology 1993;30:32–44.

22. Pickett B, Berndtson W. Принципы и методы замораживания сперматозоидов. В кн.: Salisbury GW, VanDemark NL, Lodge JR (ред.) Физиология размножения и искусственное осеменение крупного рогатого скота , 2-е изд. Сан-Франциско: WH Freeman, 1978, с. 494–554.

23. Smith R, Berndston W, Unal M, Picket B. Влияние процентного содержания яичного желтка при охлаждении и замораживании на выживаемость сперматозоидов быка. J Dairy Sci 1979;62:1297–1303.

24. Moussa M, Martinet V, Trimeche A, Tainturier D, Anton M. Липопротеины низкой плотности, выделенные из желтка куриных яиц простым методом: криопротекторное действие при замораживании и оттаивании спермы быков. Theriogenology 2002;57:1695–1706.

25. Amirat L, Tainturier D, Jeanneau L и др. Оплодотворяющая способность спермы быков in vitro после криоконсервации с использованием липопротеинов низкой плотности яичного желтка. Сравнение с коммерческим разбавителем на основе яичного желтка Optidyl. Theriogenology 2004;61:895–907.

26. Almquist J, Flipse R, Thacker D. Разбавители спермы быков. IV. Оплодотворяющая способность сперматозоидов быка в нагретом гомогенизированном и обезжиренном молоке. J Dairy Sci 1954;37:1303–1307.

27. Chen Y, Foote RH, Tobback C, Zhang L, Hough S. Выживаемость сперматозоидов быка при замораживании с разными скоростями и предварительном внесении центров кристаллизации в разбавителях на основе яичного желтка и триса и цельного молока. J Dairy Sci 1993;76:1028–1034.

28. Foote R. Оплодотворяющая способность спермы быков при высокой степени разбавления в разбавителях с трис-буфером. J Dairy Sci 1970;53:1475–1477.

29. Quinn P, Chow P, White I. Доказательства того, что фосфолипид защищает сперматозоиды барана от холодового шока, действуя на плазматическую мембрану. J Reprod Fertil 1980;60:403–407.

30. Foulkes J. Выделение липопротеинов из яичного желтка и их влияние на подвижность и целостность сперматозоидов быка. J Reprod Fertil 1977;49:277–284.