Воспроизводство крупного рогатого скота

ЛПНП из яичного желтка, мицеллы казеина и сывороточные белки в обезжиренном молоке изолируют эти BSP, тем самым поддерживая подвижность и жизнеспособность сперматозоидов во время хранения.³⁴

Помимо яичного желтка и обезжиренного молока, разбавители, используемые для разбавления бычьей спермы, также содержат различные буферы, из которых одним из первых стал использоваться фосфат. Однако, цитрат натрия в значительной степени заменил фосфат из-за его превосходной особенности способствовать выживанию сперматозоидов при 5 °C. Цитрат также улучшает растворимость белковых фракций в яичном желтке благодаря своим хелатирующим свойствам. Многие цвиттерионные буферы, такие как трис [трис (гидроксиметил) аминометан], TES [N-трис (гидроксиметил) метил-2-аминоэтансульфоновая кислота] и титрованный трис TES (TEST), также были разработаны и испытаны в широком диапазоне pH и оказались аналогичными или превосходящими цитратные буферы. Из них разбавители на основе Трис в сочетании с яичным желтком были тщательно протестированы и повсеместно используются для увеличения объема бычьей спермы. Кроме того, считается, что белковые компоненты разбавителей с обезжиренным молоком обеспечивают их буферность. Из-за потенциального риска заражения ксенобиотиками исследования также начали сосредотачиваться на разбавителях без продуктов животного происхождения, таких как кокосовое и соевое молоко, и они имели удовлетворительные результаты. Недавнее исследование, сравнивающее трис-разбавитель с соевым молоком (SMT) с трис-разбавителем с яичным желтком (EYT), не показало значительных различий между сперматозоидами в плане подвижности после оттаивания, жизнеспособности, целостности мембран, целостности акросом и криокапацитации.³⁵

Сперматозоиды требуют энергии для движения и способны как к аэробному, так и анаэробному метаболизму.³⁶ Большинство разбавителей являются источником энергии в виде простых сахаров, таких как лактоза, манноза, фруктоза и арабиноза. Сахар также увеличивает осмотическое давление на среду и действует как криопротектор. Основным эффектом сахаров и полиолов (сахарные спирты или заменители сахара) , таких как глицерин, является их способность заменять молекулу воды в нормально гидратированных полярных группах, что помогает стабилизировать плазматическую мембрану сперматозоидов во время перехода через критические температурные зоны.¹³ Сахара, такие как глицерин, также увеличивают вязкость разбавителя и предотвращают эвтектическую кристаллизацию растворенных веществ, увеличивая склонность среды к стеклованию (переход в твердое состояние без фазы кристаллизации) - свойство, которое все чаще используется в средах для стеклования.³⁷

Большинство коммерческих разбавителей спермы крупного рогатого скота также содержат антибиотики для снижения скорости бактериального роста и его последующего пагубного воздействия на качество спермы. Бактерии присутствуют в половых органах и репродуктивном тракте быков независимо от репродуктивного статуса, и их порой трудно выявить даже при самом тщательном соблюдении гигиенических и санитарных процедур сбора и обработки. Кроме того, наличие яичного желтка и других компонентов обеспечивает хорошую питательную среду для роста этих организмов. Исторически пенициллин и стрептомицин были предпочтительными антибиотиками, используемыми в разбавителях бычьей спермы, поскольку они относительно безвредны для сперматозоидов и в комбинации подавляют широкий спектр микроорганизмов. Однако, эти антибиотики не способны контролировать рост таких микроорганизмов, как Campylobacter fetus subsp. venerealis и имеют сомнительную эффективность против Mycoplasma и Ureaplasma spp. которые могут пережить процесс замораживания. Продолжение использования этих антибиотиков также привело к развитию устойчивости бактерий. Из-за этих недостатков современные международные стандарты для разбавителей спермы отдают предпочтение протоколам, которые включают обработку спермы и разбавителя антибиотиками гентамицином, тилозином, линкомицином и спектиномицином (GTLS), поскольку они более эффективны в борьбе с микоплазмой, уреаплазмой, Campylobacter fetus, Haemophilus. somnus и Pseudomonas в сперме крупного рогатого скота.^38,39

Недавние исследования показали, что присутствие бактерий в сперме может отрицательно повлиять на целостность ДНК сперматозоидов, и скорость, с которой происходит это повреждение, положительно коррелирует с изначальной бактериальной нагрузкой и скоростью роста бактерий.⁴⁰ Присутствие комбинации антибиотиков GTLS также отрицательно сказывается на долговечности ДНК. Было показано, что использование антибиотиков класса хинолонов увеличивает долговечность ДНК сперматозоидов в образцах спермы, содержащих бактерии, и, таким образом, может представлять интерес с точки зрения продвижения альтернативных стратегий криоконсервации для улучшения репродуктивного результата.⁴¹

Роль криопротекторов в замораживании спермы крупного рогатого скота

В 1949 году Polge и др.⁴² сделали важное открытие, показав, что использование глицерина (проникающее растворенное вещество) может обеспечить защиту клеток при низких температурах. Это открытие часто называют определяющим моментом в становлении современной криобиологии спермы. Разработка протоколов криоконсервации семени быков, которые будут использоваться для искусственного осеменения в молочной промышленности, началась в 1950-х годах. Bratton и др.³ в полевых испытаниях продемонстрировали, что бычья сперма, замороженная до –79 ° C и помещенная в сухой лед, все еще может давать высокую фертильность. Открытие защитных свойств липидов яичного желтка и глицерина еще больше способствовало разработке разбавителей для криоконсервации спермы быков. Сумма этих открытий привела к разработке метода трис – яичный желток – глицерин для замораживания спермы быков, который теперь является стандартом.^28,43 Криопротекторы включаются в среду для криоконсервации для уменьшения физических и химических стрессов, возникающих при охлаждении, замораживании и оттаивании сперматозоидов,^10,44 и классифицируются как проникающие или непроникающие в зависимости от их способности проникать через мембраны. Проникающие криопротекторы (глицерин, диметилсульфоксид, этиленгликоль, пропиленгликоль) вызывают перестройку липидов и белков мембран, что приводит к увеличению текучести мембран, большему обезвоживанию при более низких температурах, снижению образования внутриклеточного льда и увеличению выживаемости в процессе криоконсервации.⁴ Они действуют как растворители и растворяют в среде сахара и соли.⁴⁴ Непроникающие криопротекторы (яичный желток, обезжиренное молоко, трегалоза, аминокислоты, декстраны, сахароза) не проникают через плазматическую мембрану и действуют внеклеточно. Они могут изменять плазматическую мембрану или действовать как растворенное вещество, понижая температуру замерзания среды и уменьшая образование внеклеточного льда.^45,46 Глицерин - проникающий криозащитный агент - является наиболее предпочтительным из криопротекторов, в основном из-за способности спермы крупного рогатого скота выдерживать гораздо более высокие уровни глицерина по сравнению с другими видами. Многочисленные исследования показали, что глицерин обеспечивает лучшую подвижность после оттаивания, меньшее повреждение мембран и наилучшую выживаемость по сравнению с другими криопротективными агентами.^47,48 После добавления глицерин легко проникает в клетку и снижает температуру замерзания среды до уровня ниже, чем у воды. Это уменьшает долю среды, которая замораживается одномоментно (at any one time), уменьшая влияние низкой температуры на концентрацию растворенных веществ и, следовательно, на разницу осмотического давления.^1,49,50 Он также обеспечивает каналы незамерзшей среды между кристаллами льда, в которых могут существовать сперматозоиды при низких температурах, и действует как солевой буферный агент.

Считается, что в целом криозащитные агенты действуют за счет увеличения осмотического давления внеклеточной жидкости и, следовательно, вытягивают воду из сперматозоидов, тем самым снижая риск образования кристаллов льда и, следовательно, физического повреждения. Однако, они не облегчают, а могут даже усугублять проблему обезвоживания и увеличения концентрации растворенных веществ. Глицерин и диметилсульфоксид могут вызывать осмотический стресс и токсическое воздействие на сперматозоиды, степень которого варьируется в зависимости от вида и от их концентрации в растворе разбавителя.⁴⁴ Концентрация глицерина в разбавителе для оптимального криосохранения спермы быков колеблется от 6% до 9%, при этом верхние уровни вызывают повреждение сперматозоидов и снижают их выживаемость после оттаивания. При разработке разбавителей для спермы глицерин может быть добавлен сразу или позже в виде отдельной фракции после охлаждения спермы. В первой ситуации, также известной как одноэтапный метод, весь разбавитель вместе с глицерином объединяется после сбора спермы. Во второй ситуации или двухэтапном методе сначала присоединяется фракция разбавителя без глицерина. Затем следует охлаждение, после которого глицеринфракция добавляется непосредственно перед замораживанием спермы.⁵¹ Используемые протоколы ввода криопротекторов и замораживания в конечном итоге представляют собой компромисс между преимуществами и вредными последствиями их включения и могут варьироваться между отдельными племенными быками для получения оптимальных результатов.

Этапы криоконсервации спермы крупного рогатого скота

Процедуры криоконсервации спермы развивались в течение последних 50 лет. Однако, несмотря на постоянный прогресс в разработке новых наполнителей и криопротекторов, подвижность бычьей спермы после оттаивания остается на уровне около 50%. Это связано с тем, что криоконсервация спермы включает несколько общих этапов, из которых разбавление, криозащита, охлаждение и замораживание, хранение и оттаивание могут повлиять на структуру и функцию сперматозоидов.⁵² Считается, что сперма крупного рогатого скота относительно более устойчива к более высоким концентрациям криозащитных агентов и процессу замораживания.

Тем не менее, для оптимизации показателей подвижности после оттаивания и стабильности мембран, собранная сперма должна быть высокого качества, и следует уделять более пристальное внимание методам оценки качества семени, а не методам, которые выполняются во время рутинной оценки племенной устойчивости (BSE, по сути оценка фертильности на основе внешних параметров быка и его семени) . Также можно наблюдать индивидуальные различия, основанные на чувствительности спермы к разбавителям и методам замораживания у быков. Таким образом, необходимо делать поправки, упаковывая соломинки с большим количеством сперматозоидов или регулируя протоколы замораживания для отдельных быков.⁵³ Certified Semen Services Inc. (CSS), дочерняя компания, находящаяся в полной собственности Национальной ассоциации животноводов (NAAB), была создана для обеспечения стандартов и подлинности спермопродукции. Она также отвечает за распространение информации, касающейся обработки и обращения со спермой. В настоящее время существуют два стандартных протокола, одобренных CSS для коммерческого замораживания спермы крупного рогатого скота. Стандартный протокол CSS или двухэтапный метод является наиболее распространенным методом, используемым в Соединенных Штатах, тогда как одноэтапный метод (также известный как альтернативный протокол CSS) более популярен в Европе. Мы обычно используем двухэтапный метод замораживания спермы крупного рогатого скота, который будет описан позже более подробно.

Разбавление, начальное охлаждение и упаковка

После сбора и оценки сперму следует довести до соответствующего разведения / концентрации с использованием различных наполнителей / разбавителей. Стадия разбавления выполняется для минимизации любых потенциальных токсических эффектов семенной плазмы, для затормаживания сперматозоидов в замораживающем разбавителе и для увеличения объема семенной жидкости с целью максимального использования.⁵⁴ В успешных протоколах замораживания использовался широкий спектр разбавителей различного состава, но во всех случаях были одинаковые основные требования. Разбавитель должен поддерживать осмоляльность, pH и ионную силу (мера интенсивности электрического поля, создаваемого ионами в растворе) , обеспечивать энергетический субстрат, содержать криозащитный агент и, как правило, должен содержать антимикробные агенты. Ряд имеющихся в продаже разбавителей для спермы крупного рогатого скота, по-видимому, полностью удовлетворяют этим требованиям (таблица 71.1).

Таблица 71.1 Некоторые распространенные доступные разбавители для криоконсервации бычьей спермы и их компоненты.

a Яичный желток и вода должны быть включены перед добавлением спермы.

b Комбинация гентамицина сульфата, тилозина тартрата, линкомицина и спектиномицина. c Нет: одноэтапные разбавители требуют дополнительных количеств антибиотиков GTLS, обычно поставляемых производителем.

Наиболее часто используемые разбавители содержат трис-яичный желток / молоко-глицерин в качестве буферов и криозащитных агентов, хотя в настоящее время на рынке доступны несколько разбавителей, которые не содержат продукты животного происхождения, а вместо этого содержат фосфолипиды. Они были произведены с учетом текущей потребности в контроле болезней и, следовательно, не содержат биологически полученных веществ. Разбавители обычно доступны в виде смеси буферов и антибиотиков, к которым яичный желток добавляется во время разбавления семенной жидкости. Точно так же, в зависимости от процесса (одноэтапый или двухэтапный метод), глицериновая фракция разбавителя добавляется до или после рефрижерации и охлаждения разбавленной спермы. Используемый чаще двухэтапный протокол дает конечную концентрацию 20% яичного желтка, 7% глицерина, 50 мкг тилозина, 250 мкг гентамицина, 150 мкг линкомицина и 300 мкг спектиномицина в каждом миллилитре разбавленной замороженной спермы. Одноэтапный протокол дает концентрацию антибиотика в два раза больше, чем при двухэтапной процедуре. Степень разведения спермы крупного рогатого скота может варьироваться в зависимости от концентрации сперматозоидов в эякуляте. В целом, высокой степени разбавления (обычно 1: 5 сперма / разбавитель) как правило достаточно, поскольку дозы осеменения, используемые для оплодотворения крупного рогатого скота, на удивление низкие (обычно 10-15 миллионов) по сравнению с дозами, необходимыми для других видов, таких как лошади и свиньи. Однако, следует быть внимательным, чтобы соблюсти соответствующие объем и концентрацию разбавителя, поскольку чрезмерное разбавление может фактически привести к потере подвижности и усилению прижизненного окрашивания (метод окрашивания организмов или живых препаратов их тканей для повышения контраста при наблюдении под микроскопом) .⁵⁵ Это явление известно как «эффект разбавления» и представляет собой потерю жизнеспособности клеток, вероятно, из-за вымывания структурных компонентов клеточной мембраны.⁵⁶ Количественная разница в соотношении спермы к разбавителю между видами является важным фактором, определяющим фертильность криоконсервированной спермы.⁴ У видов, у которых для зачатия требуется большое количество сперматозоидов, степени разбавления соответственно низкие, что означает, что сперматозоиды более плотно расфасованы, что приводит к снижению устойчивости к процессу криоконсервации и к низкой выживаемости.

Разбавленную таким образом сперму затем медленно охлаждают до 4 ° C в течение 2-х часов. Это помогает значительно снизить скорость метаболизма сперматозоидов и минимизировать повреждения от холодового шока, возникающие, когда сперма охлаждается ниже 15°C.⁵⁴ Считается, что скорость метаболизма удваивается с повышением температуры на каждые 10 °C; следовательно, охлаждение спермы с температуры тела (около 39 °C) до температуры холодильника (4 °C) снижает скорость метаболизма примерно до одной десятой по сравнению со скоростью метаболизма при температуре тела. Хотя сперматозоиды быков чувствительны к охлаждению до низких температур, фосфолипидные компоненты, присутствующие в яичном желтке и сывороточные белки в обезжиренном молоке, играют важную роль в уменьшении повреждений, а также обеспечивают более быстрое охлаждение. Как только частично разбавленная сперма достигает температуры выдержки - 4 °C, ее разбавляют до конечной желаемой концентрации путем добавления фракции глицерина, если соблюдается двухэтапный протокол криоконсервации. (Обратите внимание, что в одноэтапном протоколе сперма доводится до желаемой концентрации и включает добавление глицерина перед процессом охлаждения.) Этап, связанный с добавлением глицерина, иногда ошибочно называют периодом уравновешивания глицерина (равномерное его распределение) . Поскольку глицерин обладает способностью довольно быстро проникать через клеточную мембрану при 5 °C, его можно добавить в любое время в течение периода охлаждения.^21,57 Считается, что период уравновешивания включает процесс стабилизации мембраны.

Таким образом, сперма, доведенная до соответствующей концентрации, содержит около 7% глицерина, и ее дополнительно выдерживают при 4 °C в течение нескольких часов. В течение этого периода выдержки сперма может быть расфасована, упакована и запечатана в поливиниловые соломинки 0,25 или 0,5 мл (стандартный размер, используемый в США) для дальнейшей обработки (рис. 71.1). Все процедуры, связанные с обращением с охлажденной спермой, выполняются в холодильном шкафу, чтобы поддерживать температуру уравновешивания спермы (рис. 71.2).

Скорость охлаждения и замораживания

В процессе замораживания и оттаивания сперматозоиды подвергаются повреждениям, вызванным быстрыми и резкими изменениями физикохимических условий, происходящих во время охлаждения и образования льда. Степень повреждения, вызванного этими резкими изменениями, сильно зависит от скорости охлаждения и состава криозащитной среды. Скорость охлаждения при криоконсервации спермы была определена для разных домашних животных и людей, иногда вместе с концентрацией криопротектора. Оптимальная скорость в идеале должна быть ни слишком быстрой, ни слишком медленной. В процессе охлаждения и замораживания первое изменение, с которым должны справиться сперматозоиды, - это снижение температуры до точки, близкой к точке замерзания воды.^1,6 Во время медленного охлаждения спермы (0,5–1 °C / мин) снижение температуры вызывает напряжение на мембранах, вероятно, связанное с фазовыми изменениями в липидных бислоях и изменением функционального состояния мембран.⁶