Воспроизводство крупного рогатого скота

Таблица 72.1 Разница в среднем содержании ДНК (%) в сперматозоидах разных пород с X- и Y-хромосомами.

Голштинская 4.98
Джерсейская 4.24
Ангус 4.05
Герефорд 4.05
Брахман 3.73

Лазер
Цвет окрашивания капель
Электрическое поле + –
– +
Y-содержащие X-содержащие
спермии спермии
Мертвые/не сортируемые спермии
Детектор
Компьютер

Рис. 72.1 Схема проточной цитометрии для сортировки X- и Y-несущей спермы крупного рогатого скота.

Коммерциализация бычьего сексированного семени

Достижения в области сортировки сперматозоидов по признаку пола позволили включить ее в коммерческое управление воспроизводством. В настоящее время семя, выбранное по гендерному принципу, более применимо в крупномасштабном производстве в молочной промышленности, чем в мясной. Сперма, разделенная по полу будет способствовать повышению рентабельности молочного и мясного скотоводства несколькими способами. Ее можно использовать для получения потомства желаемого пола от определенного спаривания, чтобы воспользоваться различиями в ценности самцов и самок для конкретных маркетинговых целей. Молочные стада больше заинтересованы в производстве ремонтных телок, поскольку молочные бычки по своей природе менее ценны. Преимущества заключаются в выращивании большего количества ремонтных телок, что расширяет возможности для отбора и способствует более быстрому генетическому росту.¹⁰ Кроме того, это дает возможность для увеличения размера стада, продажи большего количества самок и одновременного увеличения надоев и снижения цен на молоко (последнее является преимуществом для потребителей).

Кроме того, как только потребность в ремонтных телках будет удовлетворена, производители молока смогут также использовать разделенную по полу сперму для получения кроссбредных быков от остального поголовья коров. Производители племенного скота получают доход от продажи генетически превосходных животных в дополнение к продаже молока. Их цель - максимизировать генетические качества племенного скота по экономически важным производственным признакам экономически эффективным способом. Сексированная сперма будет выгодна селекционерам племпредприятий, если она позволит им ускорить селекцию стада или снизит стоимость достижения генетических изменений. Для получения генетически высококлассных ремонтных телок с использованием сексированной спермы коммерческие молочные фермы должны сначала ранжировать своих коров в соответствии с предполагаемыми генетическими и экономическими достоинствами по значимым для молочного производства параметрам, а затем использовать семя, несущее Х-хромосомы от генетически превосходных быков для осеменения достаточного количества коров из высшей части ранжировочного списка для производства необходимого количества ремонтных телок. Выбирая только лучших коров для производства ремонтных телок, фермеры увеличивают давление отбора по значимым для молочного производства признакам. Обсуждались методы оценки экономического влияния через усиление селекционного давления среди коммерческого поголовья маток при использовании семени с увеличенной долей сперматозоидов, несущих Х-хромосому.¹¹ Сообщалось, что прогнозируемое влияние на ежегодный генетический прогресс технологии разделения по полу на 9% 12% или 15%¹³ выше по сравнению с осеменением традиционным семенем. Фермер, занимающийся промышленным мясным скотоводством, производит телят для последующей продажи на убой и для ремонта стада.

В зависимости от запланированной роли теленка, самцы и самки имеют совершенно разную ценность, поэтому семя, разделенное по полу потенциально является мощной технологией, влияющей на генетическую и экономическую эффективность. В случае с мясным скотом ценность соотношения пола телят в пользу быков или телок зависит от генетики стада и маркетинговых планов. Для производителей семени мясного скота продажа быков товарным производителям крупного рогатого скота часто является основным источником дохода. Ремонтные телки также важны для генетического улучшения стада. Для товарных производителей мясного скота, которые зависят от продажи бычков и нуждаются в меньшем количестве ремонтных телок, также целесообразно использование спермы с Y-хромосомой. Бычки обычно имеют больший вес при отъеме и более ценны, чем телки. Поэтому, для коммерческих производителей крупного рогатого скота, которые продают телят на откорм, использование спермы с Y-хромосомой приведет к увеличению количества бычков, что может компенсировать более высокую стоимость спермы. Кроме того, если оставить телок в качестве замены (ремонта) , можно было бы проводить индивидуальное осеменение отобранных особей, чтобы получить телок от большего количества лучших маток и бычков от конечных помесей. Также следует отметить, что в некоторых программах мясного скотоводства телки более ценны, чем их сверстники бычки.

Искусственное осеменение

Технология сексированного семени стала осуществимой с рождением живого потомства предполагаемого пола.¹⁴ Последующие исследования подтвердили способность потоковой сортировки постоянно производить примерно 90% потомков выбранного пола, и способствовали ее возможной коммерческой адаптации.^15,16 Эта технология была введена в коммерческое использование в Соединенном Королевстве в 2000 году. В настоящее время несколько американских центров по искусственному осеменению обладают этой технологией и продают сексированное семя быков по всему миру.

Показатели оплодотворяемости у крупного рогатого скота зависят от отца, обработки спермы, дозировки спермы, времени и номера осеменения. Несмотря на успехи, инвазивный характер процедуры сортировки по полу пагубно сказывается на жизнеспособности и качестве сперматозоидов.^17,18 Кроме того, по экономическим причинам количество сперматозоидов в отсортированных пробах сокращается примерно до 2 миллионов сперматозоидов на дозу.¹⁸ В программах воспроизводства, в которых используется обычная сперма, некоторые факторы, вызывающие разницу в фертильности, способны подавляться за счет увеличения количества сперматозоидов в дозе осеменения (компенсируемая), тогда как другие - нет (не подлежат компенсации).¹⁹ Обширные испытания с целью определения оптимальной дозировки для оплодотворения привели к выводу, что компенсируемый компонент в основном удовлетворяется при общих дозах сперматозоидов приблизительно 4,0 миллиона; однако, учитывая различия между быками-производителями, диапазон составляет 1–11 миллионов сперматозоидов на дозу. Seidel¹⁸ и Schenk и др.¹⁶ предсказали, что коммерческое применение доз в 2,1 миллиона отсортированных по полу сперматозоидов у телок голштинской породы даст примерно 75–80% от уровня оплодотворяемости, получаемого с использованием обычного семени, что согласуется с результатами полевых исследований в Соединенных Штатах.²⁰ Увеличение числа сперматозоидов в дозе для осеменения кажется вероятным решением для повышения фертильности. В недавнем исследовании сравнивали показатели оплодотворяемости при 2,1 и 10 миллионов доз сперматозоидов, отсортированных по полу или обычных сперматозоидов, соответственно.²¹ В разных стадах и у разных быков коэффициенты оплодотворения по комбинациям типов спермы составили 38 и 44% для доз в 2,1 и 10 миллионов сперматозоидов, отсортированных по полу, и 55 и 60% для доз в 2,1 и 10 миллионов обычного семени, соответственно.

Незначительное улучшение уровня оплодотворяемости наблюдалось при использовании 10 миллионов сперматоцитов в дозе для некоторых производителей, что позволяет предположить, что отчасти снижение оплодотворяемости при использовании сексированной спермы может быть компенсировано. Однако, тот факт, что показатели зачатия, достигнутые с использованием 10 миллионов сперматозоидов, разделенных по полу, не сопоставимы ни с одной дозой традиционного семени в этом исследовании, означает, что часть снижения фертильности спермы, отсортированной по полу, вызвана процедурой окрашивания и/или сортировки. Поскольку метод сортировки стандартизирован, разбавление спермы у некоторых быков может способствовать снижению фертильности независимо от стресса из-за сортировки,²² но это остается недоказанным, поскольку в опыте осеменение дозами с большим количеством разделенных по полу сперматозоидов (10 миллионов) привело к снижению оплодотворяемости по сравнению с осеменением несортированной спермой в уменьшенной дозе (2,1 миллиона).²¹ Кроме того, снижение дозы отсортированной спермы до 20% для достижения увеличения частоты зачатия на 6% является плохим использованием генетического потенциала.²¹

Текущие рекомендации по использованию спермы с сортировкой

по полу в коммерческих целях заключаются в следующем.

1. Используйте только в стадах, где процент оплодотворяемости по традиционному семени составляет 60% и более.

2. Выбирайте здоровых циклирующих самок с нормальной упитанностью, предпочтительно телок.

3. Осеменяйте только животных, проявляющих рефлекс неподвижности. При использовании ИО с фиксированным временем убедитесь, что у подавляющего процента животных была течка до этого.

4. Оплодотворите телок спермой, отсортированной по полу, один раз, а затем - обычной спермой, если они не зачали.

5. Будьте предельно осторожны при оттаивании и обращении со спермой.

6. Осеменатор должен иметь опыт и быть известным для достижения хороших показателей беременности.

В настоящее время сексированное семя рекомендуется использовать только на самках, проявляющих охоту.²³ Однако, его применение в сочетании с синхронизацией охоты и осеменением по фиксированному времени имеет огромную коммерческую привлекательность. Кроме того, схемы синхронизации представляют особую ценность в случае осеменения спермой, отсортированной по полу, так как очень важно точное время осеменения. В настоящее время основное внимание уделяется разработке оптимального протокола синхронизации для осеменения сексированной спермой. Осеменение ближе к овуляции^16,24,25 и осеменение самок с крупными фолликулами на момент ИО²³ повышали вероятность беременности. Кроме того, введение семени в рог матки может улучшить процент зачатия при использовании сперматозоидов, отсортированных по полу.^15,26,27 Однако, введение отсортированных по полу сперматозоидов глубже в матку не увеличивало частоту наступления беременности по сравнению с синхронизированным ИО.²³

Множественная овуляция и эмбриотрансфер

В нескольких исследованиях сообщалось о получении эмбрионов in vivo от суперовулированных коров и телок после осеменения спермой, отсортированной по полу. Во многих из этих исследований наблюдалось снижение частоты оплодотворения и увеличение процента дегенерированных эмбрионов от сексированной спермы что привело к уменьшению количества извлеченных для пересадки эмбрионов.^28-30 Неоптимальное качество спермы и неправильное время проведения искусственного осеменения считались основными факторами, способствовавшими уменьшению количества вымываемых эмбрионов.^28,29

В отличие от обычного осеменения коров с овуляцией одной яйцеклетки, считается, что при множественной овуляции необходимо многократное осеменение, чтобы охватить весь овуляционный период.³¹ Поскольку количество разделенных по полу сперматозоидов на дозу осеменения ограничено из-за высокой стоимости спермы, было принято решение о многократном осеменении отсортированной спермой с низким содержанием спермиев в дозе (2 миллиона ).^29,30 В одном исследовании, когда доноры были оплодотворены сексированной спермой через 12 и 24 часа после выявления охоты, количество трансферабельных (пригодных к пересадке) эмбрионов увеличилось по сравнению с донорами, осемененными только одной дозой сексированной спермы²⁹ , что указывает на то, что двукратное осеменение более эффективно для получения эмбрионов с характеристиками аналогичными характеристикам по обычному семени, чем однократное. Однако, в другом исследовании утверждалось, что у суперстимулированных коров-доноров, осемененных четырехкратно, было меньше эмбрионов 1 класса и больше неоплодотворенных яйцеклеток при использовании сексированной спермы по сравнению с обычной спермой.³² Кроме того, когда разделенная по полу сперма вводилась в разное время после выявления охоты³⁰ , количество трансферабельных эмбрионов уменьшалось по сравнению с донорами, осемененными обычной спермой.

Для суперовулированных коров, как правило, требуется больше сперматозоидов. Успешное использование разделенных по полу сперматозоидов в схемах суперовуляции и переноса эмбрионов крупного рогатого скота (MOET) в решающей степени зависит от дозы семени. Доза отсортированной по полу спермы, которая используется для обычного (без суперовуляции) осеменения - 2 миллиона сперматозоидов, недостаточна.²⁹ Успех применения более высоких доз (10–20 миллионов сперматозоидов), по-видимому, зависит от быка-производителя или условий MOET. Кроме того, увеличение дозировки до 20 миллионов сперматозоидов, отсортированных по полу, снизило частоту оплодотворения по сравнению с контрольной группой.²⁹ Суперстимулированные телки, осемененные сексированным семенем с 5 миллионами сперматоцитов (X-сортировка; n = 5) и несексированным (n = 5) размороженным семенем от одного быка через 12 и 24 часа после выявления охоты, не показали существенной разницы в количестве трансферабельных эмбрионов эмбрионов (53,4% против 68,1%).³³ Кроме того, частота дегенеративных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток между сексированными и несексированными спермиями составляла 24,8% против 26,6% и 21,8% против 5,3% соответственно.³³ Получение большего количества пригодных к пересадке эмбрионов хорошего качества и улучшение показателей наступления беременности после пересадки имеет большой потенциал, сильно влияющий на эффективность использования сексированного семени.

Плановое скрещивание элитных производителей с самками по программе MOET, значительно увеличивают вероятность получения желаемого потомства даже без разделения спермы по полу. Предположим, что в результате процедуры MOET были получены три эмбриона, которые дали жизнеспособное потомство. При использовании обычного семени вероятность того, что хотя бы один из телят имеет желаемый пол, будет 0,879 (1 минус вероятность того, что все потомки другого пола). При чистоте 90% вероятность получения по крайней мере одного теленка желаемого пола будет 0,999. Для четырех жизнеспособных потомков вероятность будет 0,934 и 0,999 соответственно. Таким образом, следует отметить, что, хотя разделение по полу спермы увеличивает вероятность получения по крайней мере одного потомка желаемого пола в результате запланированного спаривания, это увеличение незначительно.

Целью большинства программ эмбриотрансфера является получение генетической выгоды как от матери, так и от отца. Использование сексированного семени должно дать генетический рост равный или больший, чем у обычного семени. Исследование показало, что генетическая тенденция во всей популяции улучшилась на 3,0%, когда семя, содержащее Х-хромосому, использовалось на всех полученных телках без использования MOET в основном стаде, и на 2,2%, когда MOET проводилось на всех быках и матках.³⁴

Когда сексированное семя использовали совместно с программой MOET на племенном ядре, эффект от использования разделенной по полу спермы был минимальным, за исключением случаев применения маркер-вспомогательной селекции (отбор по геному) .³⁵ Несмотря на небольшой генетический рост, в недавнем исследовании сообщалось о положительном влиянии на уровень инбридинга за счет использования сексированной спермы в схеме разведения.³⁶

Оплодотворение in vitro

ЭКО требует небольшого количества сперматозоидов для производства эмбрионов. Поэтому использование отсортированных по полу сперматозоидов при ЭКО представляется выгодным. Скорость расщепления была такой же, как при использовании несортированной спермы, но выход бластоцист от сексированного семени составил примерно 70% от контрольной выборки, полученной с несортированной спермой.³⁷ Кроме того, при осеменении ооцитов сексированной спермой по сравнению с несортированной спермой наблюдалась задержка эмбрионального развития на 0,5–1 день.³⁷ Аналогично, в других исследованиях показатели расщепления после ЭКО с использованием сексированных сперматозоидов были на 30% ниже, чем с использованием несортированной спермы из того же эякулята; образование бластоцист на 8-е сутки было на 30-40% ниже, чем в контроле, и количество клеточных циклов было снижено.^38,39 Было высказано предположение, что влияние сортировки на молекулярные аспекты функции сперматозоидов, включая капацитацию, акросомную реакцию, зону связывания и эмбриональное развитие, являются причинами снижения продукции бластоцист. Тем не менее, в последующих отчетах указывалось на отрицательное влияние сортировки на целостность сперматозоидов, но центрифугирование сперматозоидов в градиенте плотности Перколла ( метод отделения наиболее плотных и подвижных сперматозоидов из нативного эякулята) не влияло ни на расщепление, ни на количество бластоцист. Кроме того, на результаты ЭКО также влияет концентрация сперматозоидов, которая должна быть выше, чем при ЭКО с несортированной спермой, и гидродинамическое давление, используемое при сортировке.⁴¹ Также, наблюдалась положительная корреляция между процентом отсортированных сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением и развитием бластоцисты.⁴²

Что касается различий в экспрессии генов, необходимых для развития, у ЭКО-эмбрионов крупного рогатого скота, полученных от сексированного семени наблюдалось снижение относительной концентрации транспортера глюкозы 3 (Glut3) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) по сравнению с эмбрионами, полученными от традиционного семени, что может иметь негативные последствия для развития эмбрионов.⁴³ Кроме того, интересно отметить, что существуют значительные половые различия (X- и Y-несущие сперматозоиды) в бластоцистах на 7-й день для нескольких генов, а именно глутатион-S-трансферазы M3 (GSTM3), ДНК (цитозин-5) - метилтрансферазы 3A (DNMT3A) и мембранного компонента рецептора прогестерона 1 (PGRMC1), что, вероятно, способствует отсроченному началу первого расщепления.^38,44 Кроме того, у бластоцист, полученных из сперматозоидов, отсортированных по полу, наблюдаются незрелые митохондрии и грубый эндоплазматический ретикулум, а также сниженное процентное содержание интактных мембран ядерной оболочки, чем в несортированном контроле.⁴² Хотя процесс сортировки оказывает значительное влияние на жизнеспособность сперматозоидов, и очевидно влияние отдельных быков, повреждение ДНК не влияет на снижение фертильности, поскольку большинство нежизнеспособных сперматозоидов и сперматозоидов с фрагментированной ДНК отсеиваются во время сортировки. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы выявить этот феномен, поскольку существует связанное со временем повреждение ДНК сперматозоидов, разделенных по полу, по сравнению с неразделенными.

Обратная сортировка

Обратная сортировка - это разделение по полу сперматозоидов из ранее замороженных образцов и повторное замораживание этих образцов после разделения.