Воспроизводство крупного рогатого скота

Этот метод выгодно применять для быков, которые находятся на большом расстоянии от места сортировки или умерли и, следовательно, не могут предоставить свежие эякуляты для разделения по полу. Метод «обратной сортировки» решает проблемы окрашивания⁴⁵ путем промывки замороженной спермы с помощью градиента плотности, что позволяет удалить мертвые сперматозоиды, глицерин и яичный желток, которые могут мешать окрашиванию или отрицательно влиять на оставшиеся жизнеспособные сперматозоиды.^46,47

Первое предварительно разделенное по полу потомство, полученное из обратно отсортированных сперматозоидов, было получено у овец после ЭКО и переноса эмбрионов⁴⁸ и несколькими годами позже с использованием ИО.⁴⁹ Обратно отсортированная сперма быков имеет более низкую подвижность и жизнеспособность in vitro по сравнению с замороженно-размороженными контрольными сперматозоидами.⁵⁰ Несмотря на то, что в результате искусственного осеменения бычьей спермой, прошедшей обратную сортировку, были рождены телята с предварительно определенным полом, фертильность этого семени очень низкая, с увеличенным количеством эмбриональных потерь.^51,52 Больших успехов достигло использование обратно сортированной бычьей спермы в ЭКО, где расщепление и образование бластоцист с отсортированной по полу замороженной спермой и несортированными замороженными контрольными сперматозоидами были сопоставимы.⁵³ Было очевидно, что у отдельных овец была разница в показателях после применения семени обратной сортировки. Хотя причина такого различия между видами является источником некоторых разногласий,⁵⁴ дальнейшие исследования, вероятно, улучшат фертильность отсортированной и обратно отсортированной спермы быков.

Влияние процедуры сортировки по полу на структурные и функциональные параметры

спермы

Во время процедуры сортировки сперма проходит несколько этапов обработки, включая: 1) высокое рабочее давление во время гидродинамической фокусировки и прохождения через инжекционное сопло; 2) окрашивание ДНК флуоресцентным красителем бисбензимидом (Hoechst 33342); 3) воздействие на сперму волн ультрафиолетового спектра; 4) многократное воздействие на ДНК сперматозоидов электрических токов и полей; и 5) последующее прохождение через поле электростатического отклонения, которое может вызвать стресс у сперматозоидов, разделенных по полу.^55,56 Дальнейшее влияние на качество спермы может оказывать хранение окрашенной спермы при низкой температуре до осеменения. Кроме того, на подвижность, жизнеспособность и функциональную целостность отсортированных сперматозоидов может влиять разбавление спермы после удаления семенной плазмы. Возможно, основной причиной снижения выживаемости отсортированных сперматозоидов является производство активных форм кислорода (АФК) на некоторых этапах процесса сортировки. Добавление пирувата натрия и каталазы в буферную среду и замораживающие разбавители оказало положительное влияние на подвижность, морфологию, акросомный статус и жизнеспособность размороженных сексированных сперматозоидов, подтверждая пагубное воздействие АФК в процессе сортировки.⁵⁷ Hoechst 33342 (бис-бензимид) подходит для мечения ДНК сперматозоидов, поскольку он предпочтительно связывается с малой бороздкой спирали ДНК (см. Обзор в ссылке 58). Однако, известно, что этот краситель мутагенен для клеток и может вызывать нарушения в развитии эмбриона. Более того, судьба этого красителя, транспортируемого сперматозоидом в ооцит и, таким образом, в эмбрион и потомство, является областью, требующей дальнейшего изучения.⁵⁹ Оценка фрагментации ДНК несортированных и отсортированных по полу образцов сперматозоидов во время 72-часовой инкубации при 37 ° C выявила снижение долговечности ДНК в отсортированных по полу замороженноразмороженных сперматозоидах, при этом повреждение ДНК сперматозоидов проявлялось в период между 24 и 48 часами.⁶⁰

Хотя исходный уровень фрагментации ДНК был выше в размороженных образцах традиционной спермы, чем в размороженных образцах спермы, отсортированной по полу,^60,61 примерно через 30 часов инкубации наблюдалась перекрестная тенденция к фрагментации ДНК как для традиционных, так и для отсортированных по полу образцов спермы, с более высокой фрагментацией ДНК у образцов, разделенных по полу.⁶⁰ Кроме того, был сделан вывод, что хроматин сперматозоидов более устойчив к внешним стрессорам, влияющим на сперматозоиды после сортировки.⁶⁰

Стоимость и прибыль

Для последующей оценки репродуктивных показателей и здоровья, продуктивности и оплодотворяемости по первому осеменению проводилось сравнение телок, осемененных сексированным или обычным семенем (в обеих группах все повторные осеменения проводились традиционным семенем) (подробные экономические результаты см. в ссылке 62). Вкратце, возраст телок при первом осеменении составлял 13,1 ± 0,1 в группе, осемененной сексированной спермой (далее ХХ-телки) и 13,8 ± 0,1 месяцев в группе, осемененной стандартной спермой (далее ХУ-телки) . Затраты на выращивание от первого искусственного осеменения до отела были выше для ХХ-телок, чем для обычных телок (775,3 ± 6,7 долларов по сравнению с 750,0 ± 5,9 долларов). Однако, доход от телят, полученных от сексированного семени, как правило, был выше (142,0 ± 7,2 долл. против 126,7 ± 6,4 долл.), а затраты на каждую полученную телку были меньше для группы ХХ-телок, чем для ХУ-телок (–809,4 ± 10,8 долл. против - 1249,7 ± 10,9). Не наблюдалось различий в трудности отела, доли нетелей, нуждающихся в родовспоможении, а также в частоте задержек плодных оболочек или метрита. Среди телок, ставших стельными от первого осеменения, те, которые были оплодотворены сексированной спермой, с большей вероятностью пали в течение 30 дней (3,3 против 1,6%) и, как правило, с большей вероятностью пали в течение 60 дней (5,5 против 3,4%) по сравнению с телками, осемененными обычной спермой, но общая стоимость ремонта не изменилась (136,8 ± 13,4 долл. США). Общий удой (9245,5 ± 84,7 кг) и стоимость кормодня (отличается от нашего "кормодня", дословно "прибыль после вычета расходов на корма", измеряется в долларах на дойную корову в день) (554,7 ± 5,1 долл. США) не различались. Общая экономическая отдача была выше для телок, осемененных сексированной спермой, чем для телок, покрытых обычной спермой (- 83,7 ± 36,7 долл. против - 175,3 ± 33,4 долл.). Использование отсортированной по полу спермы для первого осеменения телок снизило затраты на получение одного теленка женского пола и увеличило экономическую отдачу во время первой лактации. Соотношение полов между самцами и самками составляло 0,86: 0,14 и 0,48:0,52 для спермы с сортировкой по полу и стандартной спермы, соответственно. Телки, осемененные сексированной спермой, с большей вероятностью родили мертвого теленка (8,8 против 3,4%), и, таким образом, пропорционально разница в получении живых телочек была ниже, чем сообщалось (сексированное семя - 79,1%; стандартное - 47,2%).

Используя семя, отсортированное по полу в молочных стадах, можно устранить 70% коров, используемых в качестве ремонтных маток с третьим и более отелом, сохраняя при этом уровень рождаемости телок, эквивалентный показателям обычного семени.⁶³ Исключение более старых коров-маток снижает возраст ремонтных маток и увеличивает генетическую ценность маток примерно на 23 доллара. Это увеличение удваивает генетические изменения в каждом году на линии мать – дочь по сравнению с обычным семенем, в первую очередь из-за более коротких интервалов между поколениями.⁶³ Существует расчетная экономическая стоимость программ по использованию сексированного семени для молочных и мясных телок.^64,65

Мертворождаемость

У телок, осемененных обычным семенем или спермой, отсортированной по полу частота мертворождения была одинаковой.^20,66 Кроме того, не было различий между породами в частоте мертворождений среди голштинских, джерсейских и датских красных телок, осемененных спермой от одних и тех же быков с сортировкой по полу или традиционной.⁶⁷ В другом исследовании сообщалось о более высокой частоте мертворождений после оплодотворения спермой, отсортированной по полу.⁶² Через 3 года использования сексированной спермы общий процент мертворождений не зависел от того, сексированная сперма или обычная (10,4 против 11,8%).²⁰ Мертворождение телят от разделенной по полу спермы (9,2%) аналогично или немного ниже, чем от традиционного семени. Тем не менее, частота мертворожденных телят мужского пола от спермы, отсортированной по полу (19,9%) намного выше, чем от обычной спермы (12,9%). Несмотря на то, что у нетелей, родивших бычков, процент мертворождений был выше, только 10% рожденных телят были самцами. Однако, это может стать проблемой, если необходимо более высокое соотношение полов в сторону самцов. Было высказано предположение, что повышенная частота мертворождений от сперматозоидов, несущих Y-хромосому, происходит из-за того, что эти сперматозоиды ошибочно идентифицируются как несущие X-хромосомы во время процесса сортировки из-за наличия анеуплоидии (большее или меньшее число хромосом в ядре клетки, чем должно быть в норме) , приводящей к большему содержанию ДНК и увеличению риска возникновения пороков развития.²⁰ В этом случае следует отметить, что когда при сортировке происходит целенаправленный отбор Y-несущих сперматозоидов, имеющих меньшую ДНК, то Y-несущие сперматозоиды с анеуплоидизмом и с большей ДНК не будут смешиваться с этой Y-несущей популяцией сперматозоидов, поскольку они просто не будут распознаны и отобраны. Следовательно, когда происходит отбор мужской спермы, частота мертворождений будет аналогична обычному семени.

Заключение

Несмотря на ключевые технологические разработки за более чем три десятилетия, большинство коммерческих предприятий, в которых используется отсортированная сперма, - это молочные стада. Исследования по улучшению технологии определения пола сперматозоидов были в основном сосредоточены на повышении пропускной способности образцов за счет увеличения скорости, с которой сперматозоиды поступают в сортировщик, и на улучшении разрешающей способности измерения, что привело к увеличению доли сперматозоидов, которые можно достоверно измерить и отсортировать. Хотя скорость сортировки значительно увеличилась, все еще остается потребность в индивидуальной оценке и сортировке сперматоцитов. Как следствие, использование более низких доз сперматозоидов для ИО привело к снижению фертильности (по сравнению с обычным семенем) и в значительной степени способствовало ограниченному коммерческому использованию этого продукта. Кроме того, более половины спермы выбрасывается. Недавнее внедрение некоторых улучшений сделало сортировку более эффективной и менее вредной для спермы. Модификация технологии безвредным методом сортировки имеет большие перспективы для увеличения продолжительности жизни и оплодотворяющей способности отсортированных сперматозоидов. С дальнейшим улучшением скорости и точности сортировки стоимость этого процесса будет снижена, особенно для ценных образцов. В будущем акцент может сместиться на другие аспекты общего процесса, такие как улучшение качества спермы после сортировки, чтобы уменьшить различия между быками и увеличить поставки спермы от быков с высоким спросом. Кроме того, важно, чтобы по мере роста коммерциализации собиралось больше данных о фертильности, эмбриональных потерях, мертворождении и здоровье телок. Такая информация поможет правильно оценить технологию для практического использования.

Заключительное слово

В наше время коммерческое применение разделенной по полу спермы у крупного рогатого скота, оленей и овец стало реальностью и приближается к такому же масштабу у некоторых других видов, в частности свиней, лошадей и собак. Консервация сексированной спермы также стала обычным явлением для животных зоопарков и других диких животных, некоторые из которых находятся под угрозой исчезновения.⁶⁸

Но есть один аспект, который оставался неизменным до недавнего времени и, возможно, вызывает наибольшее беспокойство, - это фертильность. Считалось, что у крупного рогатого скота и, возможно, у других видов фертильность разделенного по полу семени снижается примерно на 10% из-за неизвестного механизма, который, по-видимому, не может быть компенсирован увеличением количества сперматозоидов в дозе осеменения.⁶⁹ Sexing Technologies вложила значительные средства в исследования и разработки в области модификации обрабатывающих сред, а также в биохимическое изменение всего процесса сортировки (Vish Vishwanath и Juan Moreno, личное сообщение). Недавно завершенные Select Sires испытания указывают на значительное увеличение фертильности, что сократило разрыв между обычной спермой и спермой, разделенной по полу, до 3-5%. Не исключено, что этот разрыв можно еще больше сократить, тем самым сделав сексированную сперму почти столь же фертильной, как и традиционная сперма. Некоторые отчеты действительно показывают, что у овец разделенная по полу сперма превосходит обычную сперму с точки зрения фертильности.⁵⁴ Причины этого разнообразны, но процесс сортировки действительно удаляет много мертвых и поврежденных сперматозоидов, и если условия правильные и время осеменения точно совпадает с овуляцией, то есть реальная возможность улучшить фертильность.

Ссылки

1. Foote R, Miller P. Что может означать регулирование соотношения полов в животном мире? В кн.: Kiddy CA, Hafs HD (ред.) Соотношение полов при рождении: перспективы регулирования . Шампейн, штат Иллинойс: Американское общество зоотехнии, 1971, с. 1–9.

2. Johnson L, Welch G. Предварительный выбор пола: высокоскоростная сортировка сперматозоидов с X- и Y-хромосомами методом проточной цитометрии для достижения максимальной эффективности. Theriogenology 1999;52:1134–1323.

3. Johnson L. Определение пола сперматозоидов млекопитающих для получения потомства: современное состояние технологии. Anim Reprod Sci 2000;60–61:93–107.

4. Moruzzi J. Выбор вида млекопитающих для определения сперматозоидов, несущих X- и Y-хромосомы. J Reprod Fertil 1979;57:319–323.

5. Garner D, Gledhill B, Pinkel D и др. Количественное определение сперматозоидов домашних животных, несущих X- и Y-хромосомы, методом проточной цитометрии. Biol Reprod 1983;28:312–321.

6. Garner D. Сортировка сперматозоидов млекопитающих по полу: от концепции до применения в животноводстве. J Androl 2001;22:519–526.

7. Garner D. Определение пола сперматозоидов млекопитающих методом проточной цитометрии. Theriogenology 2006;65:943–957.

8. Johnson L, Flook J, Look M. Проточная цитометрия сперматозоидов, несущих X- и Y-хромосомы, по содержанию ДНК с использованием усовершенствованного метода подготовки и окрашивания красителем Hoechst 33342. Gamete Res 1987;17:203–212.

9. Johnson L, Welch G, Rens W. Белтсвиллская технология сортировки сперматозоидов по полу: высокоскоростная сортировка повышает выход сперматозоидов для оплодотворения in vitro и искусственного осеменения. J Anim Sci 1999;77 (прил. 2):213–220.

1. Weigel K, Barlass K. Результаты опроса производителей о скрещивании пород на молочных фермах США. J Dairy Sci 2003;86:4148–4154.

2. Van Vleck L, Everett R. Генетическая ценность спермы, сортированной по полу, для получения тёлок молочных пород. J Dairy Sci 1976;59:1802–1807.

3. Dematawewa C, Berger P. Безубыточная стоимость клонирования при генетическом улучшении молочного скота. J Dairy Sci 1998;81:1136–1147.

4. Van Vleck L. Потенциальное генетическое влияние искусственного осеменения, отбора по полу, переноса эмбрионов, клонирования и самооплодотворения у молочного скота. В кн.: Brackett B, Seidel G, Seidel S (ред.) Новые технологии в разведении животных . Нью-Йорк: Academic Press, 1981, с. 222–242.

5. Johnson L, Flook J, Hawk H. Предварительный выбор пола у кроликов: рождение живых крольчат от сперматозоидов с X- и Y-хромосомами, разделённых по содержанию ДНК методом сортировки клеток. Biol Reprod 1989;41:199–203.

6. Seidel G Jr, Schenk J, Herickhoff L и др. Осеменение тёлок сперматозоидами, отсортированными по полу. Theriogenology 1999;52:1407–1420.

7. Schenk J, Cran D, Everett R, Seidel G Jr. Частота наступления стельности у тёлок и коров при использовании криоконсервированных сперматозоидов, отсортированных по полу: влияние количества сперматозоидов в дозе для осеменения, давления при сортировке и хранения спермы до сортировки. Theriogenology 2009;71:717–728.

8. Seidel G Jr, Garner D. Современное состояние сортировки сперматозоидов млекопитающих по полу. Reproduction 2002;124:733–743.

9. Seidel G Jr. Обзор сортировки сперматозоидов по полу. Theriogenology 2007;68:443–446.

10. Saacke R, Dalton J, Nadir S, Nebel R, Bame J. Связь характеристик спермы и времени осеменения с частотой оплодотворения и качеством эмбрионов. Anim Reprod Sci 2000;60–61:663–677.

11. DeJarnette J, Nebel R, Marshall C. Оценка эффективности применения спермы, отсортированной по полу, в молочных стадах США на основе записей, ведущихся в хозяйствах. Theriogenology 2009;71:49–58.

12. DeJarnette J, Leach M, Nebel R, Marshall C, McCleary C, Moreno J. Влияние сортировки сперматозоидов по полу и дозы спермы на частоту зачатия у тёлок голштинской породы: можно ли ожидать сопоставимой оплодотворяющей способности отсортированной по полу и обычной спермы? J Dairy Sci 2011;94:3477–3483.

13. Den Daas J, De Jong G, Lansbergen L, Van Wagtendonk-De Leeuw A. Связь между количеством сперматозоидов в дозе для осеменения и воспроизводительной эффективностью отдельных быков молочных пород. J Dairy Sci 1998;81:1714–1723.

14. Sá Filho M, Girotto R, Abe E и др. Оптимизация использования сперматозоидов, отсортированных по полу, в программах искусственного осеменения по заданному времени для мясных коров, выкармливающих телят. J Anim Sci 2012;90:1816–1823.

15. Sá Filho M, Ayres H, Ferreira R и др. Способы повышения частоты наступления стельности на одно осеменение при использовании спермы, отсортированной по полу, у молочных тёлок, у которых выявлена охота. Theriogenology 2010;74:1636–1642.

16. Sales J, Neves K, Souza A и др. Время осеменения и оплодотворяемость молочного и мясного крупного рогатого скота при искусственном осеменении по заданному времени с использованием сперматозоидов, отсортированных по полу. Theriogenology 2011;76:427–435.

17. Seidel Jr G, Allen C, Johnson L, Holland M, Brink Z, Welch G. Осеменение тёлок в рог матки с использованием очень малого количества незамороженных сперматозоидов и сперматозоидов, отсортированных по полу. Theriogenology 1997;48:1255–1264.

18. Kurykin J, Jaakma U, Jalakas M, Aidnik M, Waldmann A, Majas L. Частота наступления стельности после введения сперматозоидов, отсортированных по полу, в разные участки матки у тёлок с синхронизированной охотой. Theriogenology 2007;67:754–759.

19. Sartori R, Souza A, Guenther J и др. Частота оплодотворения и качество эмбрионов у тёлок голштинской породы после суперовуляции и искусственного осеменения сперматозоидами, отсортированными по X-хромосоме, или несортированными сперматозоидами. Anim Reprod 2004;1:86–90.

20. Schenk J, Suh T, Seidel Jr G. Получение эмбрионов от крупного рогатого скота после суперовуляции и осеменения сперматозоидами, отсортированными по полу. Theriogenology 2006;65:299–307.

21. Peippo J, Vartia K, Kananen-Anttila K и др. Получение эмбрионов от тёлок и коров голштино-фризской молочной породы после суперовуляции и осеменения замороженными и оттаянными сперматозоидами, отсортированными по X-хромосоме, или несортированной спермой. Anim Reprod Sci 2008;111:80–92.

22. Dalton J, Nadir S, Bame J, Noftsinger M, Saacke R. Влияние времени искусственного осеменения на состояние оплодотворения и качество эмбрионов у коров после суперовуляции. J Anim Sci 2000;78:2081–2085.

23. Larson J, Lamb G, Funnell B, Bird S, Martins A, Rodgers J. Получение эмбрионов от коров ангусской породы после суперовуляции и четырёхкратного осеменения сперматозоидами, отсортированными по полу, или обычной замороженной и оттаянной спермой. Theriogenology 2010;73:698–703.

24. Hayakawa H, Hirai T, Takimoto A, Ideta A, Aoyagi Y. Суперовуляция и перенос эмбрионов у крупного рогатого скота голштинской породы при использовании сперматозоидов, отсортированных по полу. Theriogenology 2009;71:68–73.

25. Sørensen M, Voergaard J, Pedersen L, Buch L, Berg P, Sørensen A. Использование спермы, отсортированной по полу, в коммерческих стадах повышает генетический прогресс в популяциях молочного скота. J Anim Breed Genet 2011;128:267–275.

26. Abdel-Azim G, Schnell S. Генетические последствия использования спермы, отсортированной для получения самок, в коммерческих и племенных ядровых стадах. J Dairy Sci 2007;90:1554–1563.

27. Pedersen L, Kargo M, Berg P, Voergaard J, Buch L, Sørensen A. Стратегии геномной селекции в программах разведения молочного скота: сперма, отсортированная по полу, не может заменить многократную овуляцию и перенос эмбрионов как более эффективную репродуктивную технологию. J Anim Breed Genet 2012;129:152–163.

28. Lu K, Cran D, Seidel G Jr. Оплодотворение in vitro сперматозоидами крупного рогатого скота, отсортированными методом проточной цитометрии. Theriogenology 1999;52:1393–1405.

29. Bermejo-Alvarez P, Rizos D, Rath D, Lonergan P, Gutierrez-Adan A. Способны ли ооциты крупного рогатого скота, созревшие in vitro, по-разному избирательно обрабатывать сперматозоиды, отсортированные по X- или Y-хромосоме? Biol Reprod 2008;79:594–597.

30. Beyhan Z, Johnson L, First N. Половой диморфизм эмбрионов крупного рогатого скота, полученных методом IVM-IVF с использованием сперматозоидов, несущих X- и Y-хромосомы и отсортированных методом высокоскоростной проточной цитометрии. Theriogenology 1999;52:35–48.

31. Carvalho J, Sartori R, Machado G, Mourão G, Dode M. Оценка качества криоконсервированных сперматозоидов крупного рогатого скота после сортировки по полу методом проточной цитометрии и их использования для получения эмбрионов in vitro. Theriogenology 2010;74:1521–1530.

32. Barcelo-Fimbres M, Campos-Chillon L, Seidel G Jr. Оплодотворение in vitro с использованием несортированных и сортированных по полу сперматозоидов крупного рогатого скота: влияние концентрации сперматозоидов, давления в сортировщике и производителя. Reprod Domest Anim 2011;46:495–502.

33. Palma G, Olivier N, Neumuller C, Sinowatz F. Влияние сортированных по полу 985 сперматозоидов на эффективность оплодотворения in vitro и ультраструктуру 986 бластоцист крупного рогатого скота, полученных in vitro. Anat Histol Embryol 2008;37:67–73.

34. Morton K, Herrmann D, Sieg B и др. Изменение характера экспрессии мРНК в бластоцистах крупного рогатого скота после оплодотворения in vitro сперматозоидами, отсортированными по полу методом проточной цитометрии. Mol Reprod Dev 2007;74:931–940.

35. Bermejo-Alvarez P, Lonergan P, Rath D, Gutierrez-Adan A, Rizos D. Динамика развития и экспрессия генов в мужских и женских эмбрионах крупного рогатого скота, полученных in vitro с использованием сортированных по полу сперматозоидов. Reprod Fertil Dev 2010;22:426–436.

36. Stap J, Hoebe R, Merton J, Haring R, Bakker P, Aten J. Повышение разрешения при анализе криоконсервированных сперматозоидов, несущих X- и Y-хромосомы, методом проточной цитометрии с окрашиванием ДНК путем добавления Percoll для подавления флуоресценции мертвых сперматозоидов. J Anim Sci 1998;76:1896–1902.

37. O’Brien J, Hollinshead F, Evans K, Evans G, Maxwell W. Сортировка замороженных и оттаянных сперматозоидов овец и нечеловекообразных приматов методом проточной цитометрии. Reprod Fert Dev 2003;15:367–375.

38. Underwood S, Bathgate R, Maxwell W, Evans G. Разработка методик сортировки по полу замороженных и оттаянных сперматозоидов крупного рогатого скота. Reprod Domest Anim 2009;44:460–466.

39. Hollinshead F, Evans G, Evans K, Catt S, Maxwell W, O’Brien J. Рождение ягнят заранее определенного пола после получения эмбрионов in vitro с использованием замороженных, оттаянных, сортированных по полу, повторно замороженных и оттаянных сперматозоидов барана. Reproduction 2004;127:557–568.

40. de Graaf S, Evans G, Maxwell W, Cran D, O’Brien J. Рождение потомства заранее определенного пола после искусственного осеменения сперматозоидами барана, замороженными, оттаянными, сортированными по полу, повторно замороженными и оттаянными. Theriogenology 2007;67:391–398.

41. Underwood S, Bathgate R, Maxwell W, Evans G. Характеристики замороженных, оттаянных и сортированных по полу сперматозоидов быка in vitro после повторного замораживания или инкубации при 15 или 37 °C. Theriogenology 2009;72:1001–1008.