Воспроизводство крупного рогатого скота

1. Underwood S, Bathgate R, Maxwell W, Evans G. Рождение потомства после искусственного осеменения телок сперматозоидами быка, замороженными, оттаянными, сортированными по полу, повторно замороженными и оттаянными. Anim Reprod Sci 2010;118:171–175.

2. Underwood S, Bathgate R, Ebsworth M, Maxwell W, Evans G. Потеря стельности у телок после искусственного осеменения сперматозоидами молочного быка, замороженными, оттаянными, сортированными по полу, повторно замороженными и оттаянными. Anim Reprod Sci 2010;118:7–12.

3. Underwood S, Bathgate R, Pereira D и др. Получение эмбрионов после оплодотворения in vitro сперматозоидами быка, замороженными, оттаянными, сортированными по полу, повторно замороженными и оттаянными. Theriogenology 2010;73:97–102.

4. De Graaf SP, Beilby K, Underwood S, Evans G, Maxwell W. Сортировка сперматозоидов по полу у овец и крупного рогатого скота: исключение и правило. Theriogenology 2009;71:89–97.

5. Maxwell W, Long C, Johnson L, Dobrinsky J, Welch G. Связь состояния мембраны с оплодотворяющей способностью сперматозоидов хряка после сортировки методом проточной цитометрии в присутствии семенной плазмы или без нее. Reprod Fertil Dev 1998;10:433–440.

6. Maxwell W, Parrilla I, Caballero I и др. Сохранение функциональной целостности сперматозоидов быка после двукратного замораживания и оттаивания с применением центрифугирования в градиенте плотности Puresperm. Reprod Domest Anim 2007;42:489–494.

7. Klinc P, Rath D. Снижение окислительного стресса в сперматозоидах крупного рогатого скота при сортировке методом проточной цитометрии. Reprod Domest Anim 2007;42:63–67.

8. Rath D, Johnson L. Применение и коммерциализация спермы, отсортированной по полу методом проточной цитометрии 1010. Reprod Domest Anim 2008;43(доп. 2):338–346.

9. Gosálvez J, Ramirez M, López-Fernández C и др. Сортированные по полу сперматозоиды крупного рогатого скота и повреждение ДНК. II. Динамические характеристики. Theriogenology 2011;75:206–211.

10. Gosálvez J, Ramirez M, López-Fernández C и др. Сортированные по полу сперматозоиды крупного рогатого скота и повреждение ДНК. I. Статические характеристики. Theriogenology 2011;75:197–205.

11. Chebel R, Guagnini F, Santos J, Fetrow J, Lima J. Сортированная по полу сперма для телок молочных пород: влияние на показатели воспроизводства и лактации. J Dairy Sci 2010;93:2496–2507.

12. Cassell B. Значение использования сортированной по полу спермы быков молочных пород для генетических изменений. J Anim Sci 2010;88(электронное доп. 2):783 (аннотация).

13. Cabrera V. Экономическая ценность программ использования сексированного семени для молочных тёлок. http://www.sexingtechnologies.com/articles/ economic_aids

14. http://www.sexingtechnologies.com/articles/economic_aids

15. Tubman L, Brink Z, Suh T, Seidel G Jr. Характеристики телят, полученных с использованием сперматозоидов, разделённых по полу методом проточной цитометрии и сортировки клеток. J Anim Sci 2004;82:1029–1036.

16. Borchersen S, Peacock M. Данные полевых исследований использования сексированного семени при искусственном осеменении в Дании. Theriogenology 2009;71:59–63.

17. O’Brien J, Steinman K, Robeck T. Применение сортировки сперматозоидов и связанных с ней технологий для управления популяциями диких животных и их сохранения. Theriogenology 2009;71:98–107.

18. DeJarnette J, Leach M, Nebel R, Marshall C, McCleary C, Moreno J. Влияние разделения сперматозоидов по полу и дозы спермы на частоту зачатия у тёлок голштинской породы: возможна ли сопоставимая фертильность сексированного и обычного семени? J Dairy Sci 2011;94:3455–3483.

19. Garner D. Hoechst 33342: краситель, позволивший различать живые сперматозоиды млекопитающих, несущие X- и Y-хромосомы. Theriogenology 2009;71:11–21.

Глава 73

Контроль патогенов, передаваемых через сперму

Rory Meyer

Alta Genetics, Уотертаун, Висконсин, США

Введение

Контроль за патогенными микроорганизмами, передаваемыми через сперму крупного рогатого скота, является важной задачей в отрасли искусственного осеменения (ИО) крупного рогатого скота для предотвращения распространения болезни в разных регионах. Каждый год миллионы доз замороженной бычьей спермы производятся и распространяются как внутри Соединенных Штатов, так и по всему миру. Чтобы снизить риск распространения заболеваний, были установлены стандарты производства спермы от быков-доноров, и быки-доноры должны пройти жесткую программу тестирования, чтобы получить право на поступление в центр искусственного осеменения (ЦИО) и находиться под постоянным наблюдением на протяжении всего процесса сбора для производства спермы. По мере разработки новых тестов и проведения новых исследований программы тестирования быков-доноров в ЦИО постоянно оцениваются и совершенствуются, чтобы снизить вероятность распространения заболеваний через замороженную сперму.

В США Certified Semen Services, Inc. (CSS) устанавливает минимальные требования к тестированию быков-доноров, поступающих и проживающих в ЦИО для внутреннего распределения спермы. Дополнительное тестирование может потребоваться, если замороженная сперма быка-донора предназначена для международного экспорта и эти требования согласовываются Министерством сельского хозяйства США (USDA) и страной-импортером. Многие страны устанавливают свои собственные требования к тестированию, и они часто основываются на руководящих принципах, опубликованных Всемирной организацией здравоохранения животных (ВОЗЖ) при сборе и обработке спермы крупного рогатого скота. Одной из намеченных целей этих руководящих принципов ВОЗЖ является поддержание здоровья животных в ЦИО на уровне, допустимом для международного распространения спермы с незначительным риском заражения других животных или людей патогенами, передаваемыми через сперму.¹

Обычно быки-доноры и животные, предназначенные для использования в качестве подставных (на которых бык делает садку) , проходят тестирование в три этапа. Отобранные животные сначала проходят первичное тестирование перед тем, как попасть на карантинные объекты ЦИО. Второй этап состоит из группировки животных на период карантина и тестирование их в течение всего периода карантина и в конце периода.

И, наконец, как только животное попадает в постоянную популяцию в ЦИО, его проверяют ежегодно или раз в полгода для мониторинга статуса заболевания в ЦИО. В зависимости от требований различных экспортных рынков могут потребоваться дополнительные исследования.

В этой главе рассматриваются основные вызывающие озабоченность заболевания, которые могут передаваться через замороженную сперму крупного рогатого скота. Рассмотрены вовлеченные патогены и стратегии тестирования для минимизации риска передачи другим животным.

Вирусная диарея крупного рогатого скота

Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV) представляет собой одноцепочечный пестивирус с РНК, принадлежащий к семейству Flaviviridae. Это заболевание встречается во всем мире и является серьезным с точки зрения экономических последствий в инфицированных стадах. Клинические последствия различны и включают респираторные, желудочно-кишечные и репродуктивные симптомы, при этом основным источником инфекции являются персистентно инфицированные (ПИ) животные, присутствующие в стаде. ПИ-животные будут передавать BVDV восприимчивым животным в стаде, вызывая острую преходящую инфекцию, которая может привести к снижению оплодотворяемости у телок и коров. Несколько исследований показали, что BVDV может присутствовать в семени персистентно и остро инфицированных быков, способных передавать BVDV восприимчивому реципиенту.^2–5 Кроме того, есть сообщения о быках с инфекцированными семенниками, которые могут передавать BVDV с семенной жидкостью без виремии.^6,7

ПИ-животные являются результатом трансплацентарного заражения вирусом в период развития плода до 125 дней стельности. ПИ-быки могут нормально развиваться, но обладают иммунотолерантностью к штамму BVDV, которому подверглось животное.⁸ Бык с ПИ способен выделять BVDV в течение длительных периодов времени и в больших количествах, несмотря на то, что производит сперму с нормальной концентрацией, подвижностью и морфологией.² Эффект от использования спермы ПИ-быков и выявления восприимчивых самок значительный. Одно исследование показало, что у 12 из 12 серонегативных и вирус-отрицательных телок, искусственно осемененных спермой ПИ-быка, сероконверсия (образование антител) произошла в течение 2 недель после заражения.³

Другое исследование показало, что 161 из 162 коров, осемененных спермой ПИ-быка, были серопозитивными по сравнению с 95 из 143 коров, осемененных спермой других быков, наталкивая на вывод, что сперма от ПИ-быков способна передавать инфекцию BVD в восприимчивых стадах.² Это подчеркивает важность правильного отбора быков на предмет носительства до поступления в ЦИО.

Проверку на статус ПИ BVD быков до поступления в ЦИО осуществляют двукратным тестированием на антиген BVDV в сыворотке или цельной крови с интервалом не менее 10 дней. CSS (Центр сертификации спермы) требует, чтобы сыворотка или цельная кровь тестировались с помощью выделения вируса (VI - virus isolation), полимеразной цепной реакции (ПЦР) или иммуноферментного анализа (ELISA) с захватом антигена по первому образцу, собранному на ферме происхождения быка за 30 дней до его попаданиея в изолятор ЦИО с отрицательным результатом. У быка берут пробы для второго теста на антиген BVDV в сыворотке или цельной крови в течение периода изоляции, по крайней мере, через 10 дней после поступления в изолятор ЦИО с отрицательным результатом. Из-за влияния материнских антител на циркуляцию BVDV в сыворотке, быков младше 6 месяцев необходимо тестировать с использованием цельной крови в условиях изоляции.⁹

Восприимчивые быки, подвергшиеся воздействию BVDV, могут заболеть в острой или слабовыраженной форме в течение 6–21 дней после заражения. Период виремии также совпадает со значительным увеличением продукции антител к инфекционному штамму BVDV, что указывает на воздействие вируса.¹⁰ BVDV может быть обнаружен в сперме остро инфицированных быков на протяжении всего периода виремии, хотя уровни вируса в сперме значительно ниже, чем у персистентно инфицированных быков.^2,7,11 В результате уровни сероконверсии у животных, осемененных спермой остро инфицированных быков, у которых присутствует вирус, ниже, чем у животных, осемененных спермой ПИ-быков (1,8–15,4%).^4,5 Несмотря на более низкие показатели сероконверсии, тестирование на наличие острой инфекции у быков в ЦИО важно для предотвращения распространения BVDV в восприимчивых стадах. Требования к тестированию на острые инфекции BVDV аналогичны тестированию ПИ-быков. CSS требует, чтобы бык был протестирован на ферме с использованием VI, ПЦР или ELISA с захватом антигена в сыворотке или цельной крови в течение 30 дней после помещения в изолятор ЦИО с отрицательным результатом. Быка повторно тестируют не менее чем через 10 дней после помещения в карантин ЦИО с отрицательным результатом. Подобно тестированию на статус ПИ, у быков младше 6 месяцев необходимо проверять цельную кровь. Если результат положительный, быка изолируют от оставшихся в карантине животных и вновь исследуют, по крайней мере, через 21 день вместе с этими оставшимися животными. Если второй результат положительный, это указывает на то, что бык является ПИ и ему запрещается доступ в резидентное стадо. Если второй результат отрицательный, быков необходимо проверить в третий раз, по крайней мере, через 10 дней после второй пробы с отрицательным результатом до попадания в производственное стадо.⁹ В случае, если BVDV изолирован от быка с острой инфекцией, все партии спермы, собранные за 30 дней до и 30 дней после положительного результата, должны быть протестированы с помощью VI или ПЦР, прежде чем будут распределены.

Дополнительное тестирование на острые инфекции BVDV, рекомендованное ВОЗЖ, включает тест на обнаружение антител к BVDV.

Образцы сыворотки собираются до или в начале карантинного периода и, минимум, через 21 день после поступления в изолятор. Сероконверсия указывает на заражение в период изоляции, и бык должен пройти повторное тестирование перед тем, как войти в резидентное стадо. ВОЗЖ также рекомендует ежегодно отбирать у быков пробы и тестировать их на антитела к BVDV для мониторинга сероконверсии, пока они являются резидентами производственного стада ЦИО.¹

Дважды сообщалось о быках с персистентной тестикулярной инфекцией (наличие вируса в семенниках) , которые были способны выделять вирусные частицы в сперму, несмотря на отсутствие виремического состояния и наличие циркулирующих антител к BVDV.^6,12 Считается, что это возможно тогда, когда образование антител было вызвано первоначальной инфекцией, но вирус в семенниках был защищен от циркулирующих антител за счет гематосеменникового барьера. В обоих отчетах сказано, что эти быки стабильно производили сперму, содержащую вирус, в течение длительного периода времени, хотя вирусная нагрузка в дозе осеменения была меньше, чем в сперме, полученной от ПИ-быков, но больше, чем в сперме остро инфицированных быков.⁷ Одно исследование показало, что осеменение трех телок замороженной спермой одного из указанных быков привело к сероконверсии у одной из трех телок.¹³

Имеются сообщения о быках с пролонгированной тестикулярной инфекцией (PTI), у которых антиген вируса BVDV в сперме обнаруживался в течение 2,75 лет после экспериментальных острых инфекций. Однако, BVDV можно было обнаружить в сперме только с помощью теста VI во время виремического периода инфекции, хотя инфекционный вирус можно было выявить в семенниковой ткани через 12,5 месяцев после заражения.^7,14 Положительный результат был обусловлен обнаружением нейтрализованного вируса с помощью ПЦР, но последующее исследование не смогло обнаружить инфекционный вирус через 17 дней после заражения с использованием VI спермы. Несмотря на это, один эксперимент продемонстрировал, что неочищенная сперма, собранная у одного из быков с положительным PTI через 5 месяцев после заражения, привела к сероконверсии у 6- месячного теленка при ее внутривенной инъекции.¹⁴ В другом исследовании повтор этого опыта не привел к сероконверсии у телят, инокулированных внутривенно сырой спермой, а опыты с использованием замороженной спермы PTI-быков для осеменения телок также не дали сероконверсий. Был сделан вывод о том, что риск передачи вируса в результате длительной тестикулярной BVDVинфекции, может быть незначительным, но для подтверждения этого вывода требуется дополнительная информация.⁷ Требования CSS заключаются в том, чтобы быки, содержащиеся в ЦИО, проходили тестирование на PTI одним из двух способов до выпуска спермы на рынок. Первый метод заключается в тестировании всех изолированных быков с помощью реакции нейтрализации BVDV в сыворотке. Быки, получившие положительный результат теста, должны иметь единый код партии замороженной обработанной спермы, проверенной с помощью VI или ПЦР. Второй метод состоит в том, чтобы необработанная замороженная сперма от всех изолированных быков, независимо от их статуса антител, была проверена с использованием VI или ПЦР и имела единый код партии. Любой бык, у которого обнаружена персистентная тестикулярная BVDV-инфекция, не имеет права на сбор спермы и ему не допускается в резидентное племенное стадо.⁹ В настоящее время нет рекомендаций относительно тестирования быков для определения их статуса PTI. По мере поступления дополнительной информации может потребоваться дополнительный анализ с дополнительными тестами.