JC-1 имеет преимущество по сравнению с Rhodamine 123 и Mitotracker в том, что он может количественно определять митохондриальный взрыв клетки. Недостатком зонда JC-1 является его двойное флуоресцентное излучение, которое ограничивает его комбинацию с другими зондами, излучающими на зеленой и красной длинах волн.
Целостность ДНК
Для определения потенциальной фертильности сперматозоидов важно оценить статус хроматина. В последние годы основным методом, используемым для оценки целостности хроматина в сперматозоидах с помощью проточной цитометрии является анализ структуры хроматина сперматозоидов, разработанный Evenson и Jost48 , является.49,50 В анализе структуры хроматина сперматозоидов используется двойное флуоресцентное излучение акридинового оранжевого в зависимости от того, связывается ли он с одноцепочечной ДНК (красная флуоресценция) или двухцепочечной ДНК (зеленая флуоресценция) (акридиновый оранжевый - флуорохроматический краситель, который связывается с нуклеиновыми кислотами бактерий и других клеток и под действием ультрафиолетового излучения акридиновый оранжевый окрашивает РНК и однонитевую ДНК в оранжевый цвет, двунитевую ДНК — в зеленый). После стадии денатурации образец спермы инкубируют с акридиновым оранжевым и затем анализируют посредством проточной цитометриии. Денатурация (потеря структуры и естественных свойств) приведет к образованию одноцепочечной ДНК при наличии разрывов ДНК и создаст разнородную популяцию красной и зеленой флуоресценции в зависимости от целостности хроматина. Наиболее важным результатом анализа структуры хроматина сперматозоидов является соотношение красно-зеленой и красной флуоресценции, называемое индексом фрагментации ДНК, где высокий индекс фрагментации ДНК коррелирует с высоким уровнем ее повреждения. Индекс фрагментации ДНК показал корреляцию с фертильностью у разных видов.51–53 Большой спектр люминесценции, охватываемый акридиновым оранжевым, и стадия денатурации, необходимая для индукции одноцепочечной ДНК, являются двумя основными недостатками анализа структуры хроматина сперматозоидов при многопараметрическом анализе. Акридиновый оранжевый флуоресцирует в зеленом и красном спектре; это оставляет мало возможностей для добавления других флуорохромов в этих спектральных областях, а стадия денатурации выполняется с раствором кислоты / детергента, несовместимым со всеми зондами. Другой анализ для оценки целостности ДНК, разработанный для проточной цитометрии, - это анализ TUNEL (мечение концов терминальной трансферазы dUTP), который может идентифицировать разрывы цепи ДНК.54–56 Фермент трансфераза включает флуоресцентно модифицированные нуклеотиды в местах разрыва ДНК. Затем полученные меченые клетки можно анализировать с помощью проточной цитометрии. Анализ TUNEL позволяет количественно определять меченые нуклеотиды в составе фрагментированной ДНК, которые проявляются увеличением флуоресценции, что дает заметное преимущество перед анализом структуры хроматина сперматозоидов.
Кальциевый насос
Кальциевый насос - один из основных этапов процесса капацитации сперматозоидов. Повышение уровня внутриклеточного кальция в конечном итоге приводит к фосфорилированию остатков тирозина и серина в белках, регулирующих сигнальный каскад. Самым популярным красителем, используемым для определения внутриклеточной концентрации кальция в сперматозоидах, является зонд семейства Fluo-3/4, возбуждаемый лазером с длиной волны 488 нм.57-59 Не связанный с кальцием Fluo-3 является нефлуоресцентной молекулой, но когда ионы кальция проникают в клетку и связывают Fluo-3, последний становится флуоресцентным Fluo-4 - производным Fluo-3, обладающим более высокой флуоресценцией.
Fura red - это зонд, также возбуждаемый лазером с длиной волны 488 нм, флуоресцентное излучение которого уменьшается при связывании кальция. Двойная маркировка сперматозоидов с помощью Fluo-3 / Fura red позволяет рассчитать соотношение несвязанного и связанного кальция. Отношение между двумя средними интенсивностями флуоресценции (Fluo-3 / Fura red) пропорционально внутриклеточной концентрации кальция в сперматозоидах. Этот экспериментальный подход был использован Peña и др.60 для оценки спермы собак. Одним из важнейших аспектов использования этих красителей является загрузка зонда в клетки. Поскольку средняя интенсивность флуоресценции является параметром, используемым для обозначения уровня внутриклеточного кальция, ошибки при пипетировании зонда изменят среднюю интенсивность и приведут к неверной интерпретации результатов. Недостатком комбинации Fluo-3 / Fura red является необходимость в наличии двух разных детекторов флуоресценции, что уменьшает возможности многопараметрического подхода. Пентаацетоксиметиловый эфир Indo-1 представляет собой проницаемый для мембран кальциевый сенсорный краситель, используемый для мониторинга изменений уровня внутриклеточного кальция. Как только Indo-1 попадает в клетку, эстеразы расщепляют ацетоксиметильную группу, образуя проницаемый для мембран краситель. Несвязанный Indo-1 имеет максимум излучения при 485 нм. При связывании кальция пик излучения смещается до 410 нм. Измерение во времени можно представить как отношение двух длин излучаемых волн. Поскольку Indo-1 ацетоксиметил является ратиометрическим зондом, проблемы загрузки клеток (как и для Fluo-3/4) менее важны. Одним из ограничений этого зонда является то, что не все лаборатории оснащены прибором с ультрафиолетовым лазером, необходимым для возбуждения ацетоксиметила Indo-1. Для тех, у кого есть этот прибор, Indo-1 ацетоксиметил становится очень хорошим датчиком для многопараметрического анализа, потому что это один из немногих датчиков, использующих ультрафиолетовый лазер, что оставляет лучи в 488 и 633 нм дсвободными для изучения других параметров.
Ограничения проточной цитометрии
На выбор цитометра для анализа сперматозоидов влияет несколько факторов. Цена инструмента остается основным фактором. Многопараметрический анализ обычно выполняется с помощью приборов, содержащих более одного лазера и несколько фотоэлектронных умножителей, что существенно увеличивает стоимость оборудования. Действительно, тип выполняемого анализа также является фактором, определяющим выбор проточного цитометра. В зависимости от целей племенного центра и схемы эксперимента необходимо учитывать комбинацию лазеров (количество и длину волны) и количество фотоумножителей, включенных в прибор. Прибор только с одним лазером и тремя фотоэлектронными умножителями позволяет обнаруживать максимум три параметра на каждой ячейке, в то время как многопараметрический анализ, включающий четыре или более параметров, обычно требует прибора, имеющего по крайней мере два лазера и четыре фотоумножительных трубки. Программное обеспечение, управляющее проточным цитометром, является еще одним важным аспектом при выборе прибора. Большинство доступных программных продуктов довольно просты и понятны для начинающего пользователя. Однако, для работы с некоторым ПО требуются определенные знания принципов проточной цитометрии, что затрудняет работу с прибором. Например, образцы, окрашенные смесью, содержащей несколько зондов, подвергаются стробирующему анализу (стробирование -метод выделения некоторого интервала на временной оси, шкале частот и т.п. для увеличения вероятности обнаружения полезных сигналов на фоне помех. Т.е. это включение приемника волн только в момент предполагаемого прихода к нему сигнала) . Чтобы получить репрезентативные результаты, входы (датчика?) должны быть связаны с определенной популяцией в правильной иерархии, и с этим трудно справиться с некоторым программным обеспечением для начинающего пользователя.
Более того, в некоторых программах есть пробелы в экспорте и компиляции данных, что затрудняет анализ данных и отнимает много времени у пользователя.
Как упоминалось в разделе, посвященном анализу функции сперматозоидов с помощью проточной цитометрии, проточная цитометрия - относительно новое направление для ЦПС (Центр производства спермы) . При выборе инструмента необходимо учитывать уникальные особенности сперматозоидов. Лопастная форма головы и наличие жгутика приводят к тому, что сперматозоиды сильно отличаются друг от друга по размеру и клеточной сложности по сравнению с большинством клеток, исследованных с помощью проточной цитометрии. Действительно, большинство клеток, исследованных с помощью этой технологии, имеют круглую форму, и прохождение перед лазером приводит к четкому графику зависимости прямого и бокового рассеяния. Однако, когда сперматозоид попадает на лазер, он может быть на толстой или тонкой стороне головки. Эта уникальная особенность сперматозоидов позволяет получить диаграммы разброса разного размера и сложности. Очень важный аспект, который мы обнаружили при изучении замороженно-размороженных сперматозоидов с помощью проточной цитометрии и который обсуждался в этой главе, - это разбавитель, в котором разбавляется сперма. Как уже говорилось, для разбавления семенной жидкости используются разные типы разбавителей, и некоторые из них содержат частицы такого же размера, как и сперматозоиды. Этот аспект "загрязнения" частицами целевой популяции вызывает беспокойство при рассмотрении вопроса о покупке цитометра для многопараметрических анализов. Устройство, достаточно мощное, чтобы отличать сперматозоиды от частиц только на основании размера и сложности клеток, позволяет идентифицировать популяцию сперматозоидов без использования каких-либо флуорохромов. В результате остается доступным больше фотоумножителей для определения характеристик клеток с помощью флуорохромов. Наша лаборатория сравнила несколько проточных цитометров, и только половина из них были достаточно чувствительны, чтобы проводить различие между инородными частицами и сперматозоидами без использования какихлибо флуорохромов. Если в исследовательская лаборатории стоит цитометр, который не может отличить дебрис от сперматозоидов, то при анализе следует либо промыть клетки, чтобы удалить посторонние частицы, либо окрасить сперматозоиды флуорохромом, что оставляет меньше пробирок фотоумножителя для изучения других параметров. Не все флуорохромы подходят для разбавителей спермы, особенно для разбавителей на основе яичного желтка, которые, как известно, гасят некоторые флуоресцентные красители. Для окрашивания нуклеиновой кислоты сперматозоидов при использовании цитометра, оснащенного ультрафиолетовым или фиолетовым лазером обычно используется Hoechst 33342. Этот подход позволяет удалять частицы, выводя их наружу, что приводит к более точному анализу (рис. 74.2). К сожалению, не все системы оснащены такими лазерами для использования Hoechst 33342 в качестве красителя, "отслеживающего" клетки, но к сперме может быть добавлен краситель, проникающий в клетки, такой как SYBR-14 и тогда эта флуоресцентная популяция будет помечена для дальнейшего анализа.
Многопараметрический подход для
стандартизации и контроля качества среди ЦПС
Использование CASA и проточной цитометрии в качестве инструментов контроля качества
Субъективная оценка спермы с помощью обычной микроскопии до сих пор используется во многих ЦПС (Центр производства спермы) . Как обсуждалось ранее, этот тип оценки спермы приводит к разным решениям относительно того, принимать или отклонять партию семени во время контроля качества.
Несмотря на то, что CASA используется в некоторых ЦПС, фертильность - это многопараметрическое явление, следовательно, параметров подвижности сперматозоидов недостаточно для оценки общего потенциала фертильности образца спермы. Внедрение проточной цитометрии в ЦПС позволит лучше охарактеризовать сперматозоиды, поскольку сама по себе проточная цитометрия направлена на анализ множества параметров. Сочетание CASA и цитометрии обеспечит ЦПС мощным многопараметрическим подходом в оценке качества производимой спермы и позволит установить стандартизированные процедуры для принятия точных и универсальных решений по результатам анализа спермы. Мы оценили потенциал этих инструментов для точной оценки качества спермы, произведенной в ЦПС по всей Канаде. Процент общей и прогрессирующей подвижности и процент жизнеспособности, целостности акросом и высокой митохондриальной активности оценивали с помощью CASA и проточной цитометрии. Мы получили и повторно проанализировали 660 партий спермы с яичным разбавителем, произведенной различными ЦПС, которые ранее были проанализированы стандартным субъективным методом контроля качества, и из них 58% (n = 385) были приняты, а 42% (n = 275) были отклонены. Оценка спермы проводилась в двух разных временных точках: сразу после оттаивания и через 2 часа после воздействия теплового стресса (оценка терморезистентности) . Для каждого параметра, проанализированного с помощью CASA/проточной цитометрии в каждый момент времени были установлены пограничные значения (таблица 74.1). Партии спермы, которые не соответствовали нашему стандартному диапазону значений, были бы отклонены и выброшены. С другой стороны, если качество спермы было хорошим и соответствовало нашим пороговым значениям после оценки с использованием CASA и проточной цитометрии, то партия считалась пригодной и могла поступить на реализацию.
В таблице 74.2 показан процент из 660 партий, отклоненных после анализа с помощью CASA и проточной цитометрии. Анализ CASA показал, что 14% (94 из 660) уникальных партий не соответствовали пороговому значению сразу после размораживания по сравнению с 27% (178 из 660) уникальных партий после 2 часов инкубации. То же наблюдение можно было сделать из анализов проточной цитометрии, где 24% (156 из 660) уникальных партий были отклонены после размораживания по сравнению с 32% (214 из 660) уникальных партий после 2 часов инкубации. Этот анализ демонстрирует необходимость включения теста на терморезистентность в систему оценки качества ( QC) для повышения ее точности, в случае, когда большинство партий отбраковывается по результатам 2-часовой инкубации. Кроме того, оценка CASA привела к отбраковке 28% партий, тогда как анализ проточной цитометрии забраковал 34% (224 из 660) партий. Когда CASA и проточная цитометрия использовались в комбинации, в общей сложности 41% (268 из 660) уникальных партий были отклонены, что привело к увеличению отклонения на 13% по сравнению с использованием только одного CASA (28%). В целом, эти результаты демонстрируют очень высокий авторитет многопараметрического подхода при принятии решения об отклонении / принятии партии семени.
Детальный анализ принятых и отклоненных с помощью CASA / проточной цитометрии партий по сравнению со стандартным контролем качества показал 77,4% совпадения решений, принятых с использованием двух разных методов оценки качества, но 22,6% образцов не соответствовали друг другу (рис. 74.3). Это несоответствие можно рассматривать как «влияние точности» многопараметрического метода над стандартной субъективной оценкой. Т.е. эти 22,6% состоят из 10,8% партий, принятых стандартными методами, которые были бы отклонены с помощью наших многопараметрических инструментов, и 11,8% партий, отклоненных стандартными методами, которые были бы приняты при использовании многопараметрического подхода.
(a) (b)
10 5 10 5
10 4 10 4
10 3 10 3
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
(c) (d)
10 5 Сперматозоиды 10 5 Сперматозоиды
10 4 10 4
10 3 10 3
Прочие частицы
Прочие частицы
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
(e) (f)
10 5 10 5
10 4 10 4
10 3 10 3
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
SSC-A SSC-A
Hoechst-A Hoechst-A
SSC-A SSC-A
Рис. 74.2 Сравнение (а) хорошего и (б) плохого отделения сперматозоидов от несперматических частиц в размороженных эякулятах. Мечение клеток с помощью Hoechst 33342 (синие клетки в c, d) позволяет исключить окрашивание сперматозоидов и различать клеточный дебрис (мусор) и несперматические частицы из яичного желтка. Распознанную популяцию сперматозоидов можно использовать для дальнейшего многопараметрического анализа (e, f). SSC - график бокового рассеяния; FSC - график прямого рассеяния.
На первый взгляд, 22,6% расхождений между объективной и субъективной оценкой могут показаться высокими. Однако, при CASA / проточной цитометрии было бы отбраковано 268 партий (таблица 74.2), при этом было принято 392 партии по сравнению с исходными принятыми 385 и 275 отклоненными SPC. Это различие составляет 1% от всей поступившей на оценку спермы (7 партий из 660) и может рассматриваться как «производственное влияние» CASA / проточной цитометрии по сравнению со стандартным контролем качества. Это исследование показывает, что производственное влияние будет незначительным, но влияние точности будет весьма значительным.
Чтобы оценить влияние этого многопараметрического подхода на фертильность спермы в полевых условиях, мы применили этот анализ к партиям спермы с известной фертильностью, которые были реализованы (т.е. осеменены животные) в полевых условиях после использования стандартного контроля качества. CASA и проточная цитометрия были выполнены на 192 партиях с не менее 250 первых осеменений. Фертильность, связанная с каждой партией, была получена из Канадской молочной сети и выражена как FERTSOL, что представляет 56-дневный невозвратный коэффициент, скорректированный с учетом нескольких параметров, включая сезон осеменения, осеменатора, кратность осеменения и т. д.
