Воспроизводство крупного рогатого скота

Таблица 74.1 Предельные значения CASA / проточной цитометрии, используемые для определения показателей прохождения/непрохождения во время контроля качества размороженной спермы сразу после оттаивания и после 2 часов воздействия терморезистентного стресса. Партии спермы, соответствующие этим пороговым значениям или превышающие их, прошли оценку.

Таблица 74.2 Количество (%) отбракованных образцов (всего 660), по крайней мере, по одному параметру контроля качества на основании только CASA, только проточной цитометрии или CASA плюс проточная цитометрия.

Конкретные применения многопараметрического подхода к оценке спермы

Многофакторный аспект фертильности может привести к неправильной оценке качества спермы при оценке лишь нескольких параметров. Даже сперма, прошедшая строгие этапы контроля качества, может иметь низкую фертильность после полевых испытаний.

Отклонено стандартом.
Отклонено CASA / FC
29.8%
Принят стандартом.
Отклонено CASA /
FC 10,8%
Отклонено
стандартом.
Принято CASA / FC
11,8%

Принят стандартом.
Принято CASA / FC 47,6%

Рис. 74.3 Сравнительный анализ процентного соотношения допущенных/не допущенных к реализации образцов спермы между стандартной QC и CASA / проточной цитометрией во время контроля качества 660 размороженных партий спермы.

Такие партии прошли бы все наши пороговые значения CASA/ проточной цитометрии, но все же дали бы меньше телят, несмотря на большое число осеменений. Необходим более подробный анализ этой спермы, чтобы понять причину ее низкой фертильности. Однако, более глубокий анализ образцов спермы требует много времени и средств, поэтому он проводится только для высококачественной спермы. Здесь мы сообщаем о двух случаях, когда проточная цитометрия помогла нам выявить предполагаемую причину низкой фертильности семени. В первом случае был молодой бык (бык А), одна из партий спермы которого произвела очень мало эмбрионов после экстракорпорального оплодотворения по сравнению со среднестатистическим показателем. Эту партию спермы сравнивали (в трех экземплярах) с партией среднего быка (бык С), используемой в качестве внутреннего контроля для большинства наших экспериментов. Параметры подвижности и жизнеспособности, оцененные с помощью CASA/проточной цитометрии, показали среднее качество сперматозоидов от обоих быков (в среднем 36% общей подвижности и 15% прогрессивной подвижности). Оценка уровня внутриклеточного кальция и целостности акросомной мембраны проводилась сразу после оттаивания и через 5 часов инкубации после оттаивания с гепарином при 38,5 °C. В обоих случаях аликвоту (часть образца, пробу) сперматозоидов инкубировали с ацетоксиметилом Indo-1 и агглютинином арахиса FITC, а затем обрабатывали тапсигаргином, чтобы вызвать внутриклеточный каскад, участвующий в процессе капацитации. Процент живых сперматозоидов с высоким внутриклеточным уровнем кальция и прореагировавших акросом определяли методом проточной цитометрии. Анализ сразу после оттаивания перед инкубацией с гепарином и введением тапсигаргина показал аналогичный процент клеток с прореагировавшими акросомами, и клеток с высоким внутриклеточным кальцием между быком A и быком C. После стимуляции тапсигаргином аналогичный процент сперматозоидов из каждой акросомы быка прореагировал, но сперма от быка A показала увеличение клеток с высоким содержанием кальция по сравнению с быком C (23,3 ± 6,3% против 13,3 ± 2,5%, соответственно; P = 0,14) (таблица 74.3).

Таблица 74.3 Сравнение целостности акросом и уровня кальция в живых сперматозоидах быков А и С до и после контрольной обработки тапсигаргином, как после оттаивания, так и после 5-часовой инкубации с гепарином.

Значения представляют собой средние проценты от трех протестированных проб ± SEM. Различные буквы (a, b) в одном столбце представляют достоверные различия, P <0,01 - парный t-критерий Стьюдента. AR - акросома прореагировала; High Ca - % клеток с повышенным уровнем кальция; Thaps - тапсигаргин.

Таблица 74.4 Сравнение функций сперматозоидов быков B и C сразу после оттаивания на основе анализа CASA и проточной цитометрии.

Значения представляют собой средние проценты по двум тестам ± SEM. Достоверные отличия от контроля представлены *, P <0,05 - **, P <0,001 - тестом множественного сравнения Даннета (каждая проба сравнивается с контролем) .

В семени быка A после добавления тапсигаргина по-прежнему было меньше клеток с акросомной реакцией, по сравнению с быком C (10,5 ± 2,0% против 23,1 ± 0,5%; P <0,01), но также было пропорционально меньшее увеличение процента клеток с высоким содержанием кальция. Эти наблюдения предполагают, что у сперматозоидов быка А капацитация не могла происходить в среде, содержащей гепарин, о чем свидетельствует меньшее количество клеток с акросомной реакцией и высокое содержание внутриклеточного кальция в сперматозоидах. В целом, этот анализ предполагает, что эта конкретная партия спермы быка А была недостаточно зрелой, чтобы полностью завершить процесс капацитации и реализовать свой потенциал фертильности. Saacke и др.⁶¹ описали некоторые компенсируемые и некомпенсированные нарушения функции семени, связанные с субфертильностью (недостаточной фертильностью) . Компенсируемые факторы включают функциональные или молекулярные показатели, отраженные в этом тематическом исследовании низким процентом клеток, с прореагировавшими акросомами или повышенным содержанием кальция. В этом случае может быть полезно увеличить количество сперматозоидов на соломинку у быка А, чтобы компенсировать его субфертильность. Вторым исследованным случаем был взрослый бык (бык B), который показал чрезвычайно низкую фертильность в полевых условиях (FERTSOL <–2) по нескольким различным партиям спермы, выпущенным из ЦПС после стандартных QC-тестов (проверки качества) . Сначала мы провели базовые тесты CASA/проточной цитометрии для пяти разных партий и сравнили результаты со средним быком (бык C). Все изученные партии прошли бы наши ограничения по контролю качества. Удивительно, но процентные доли общей и прогрессивной подвижности у быка B существенно не различались по сравнению с быком C (таблица 74.4). С другой стороны, акросомная реакция, гибель клеток и митохондриальная активность значительно отличались в некоторых проанализированных партиях по сравнению с быком C (таблица 74.4).

Поскольку эти результаты не могли объяснить очень низкую фертильность быка B, мы провели анализ структуры хроматина сперматозоидов, как обсуждалось ранее для тех же партий, и сравнили с результатами, полученными по быку C. Процентный индекс фрагментации ДНК был примерно в два-четыре раза выше у быка B, чем у быка C (P <0,001; Таблица 74.4). Высокий процент индекса фрагментации ДНК коррелировал с пониженной фертильностью главным образом у людей.^53,62 Следовательно, очень низкая фертильность, наблюдаемая у быка B, может быть объяснена высоким уровнем денатурации ДНК, измеренным с помощью анализа структуры хроматина сперматозоидов. В отличие от первого исследования, аберрация хроматина - это не компенсируемый фактор, связанный с субфертильностью.⁶¹ Увеличение количества сперматозоидов на соломинку в этом случае не может компенсировать чрезвычайно низкую плодовитость быка B, наблюдаемую в полевых условиях.

Выводы

Многопараметрический анализ спермы, проводимый ЦПС с помощью CASA и проточной цитометрии, демонстрирует очень высокий прогностический потенциал в плане оценки качества спермы и фертильности. Поскольку фертильность зависит от множества факторов, должны проводиться общирные исследования и разработка новых маркеров для определения спермы с высокой фертильностью. Включение новых маркеров в многопараметрический подход приведет к лучшей оценке качества спермы и фертильности. Кроме того, внедрение этих инструментов в ЦПС поможет стандартизировать процедуры контроля качества, устранив субъективный аспект оценки спермы. Это позволит стандартизировать сперму, производимую в рамках одного ЦПС и нескольких ЦПС для компаний, занимающихся ИО, которые производят сперму в нескольких лабораториях.

Еще одно применение этих инструментов в индустрии искусственного интеллекта - определение параметров семени с высокой генетической ценностью. В индустрии ИИ большая часть производимой спермы происходит от нескольких животных с высокой генетической ценностью. Эти очень востребованные на рынке образцы спермы должны быть очень хорошо охарактеризованы, чтобы оптимизировать производство по количеству производимых соломинок и по качеству спермы, доступной на рынке. В целом индустрия искусственного интеллекта выиграет от внедрения CASA и проточной цитометрии в ЦПС.

Примечание редактора

Эта глава является воспроизведением работы, подготовленной авторами, которая ранее впервые была опубликована в Proceedings Association for Applied Animal Andrology Conference (2012) и Animal Reproduction, июль / сентябрь 2012 г., книга, страницы 153–165.

Ссылки

1. Verstegen J, Iguer-Ouada M, Onclin K. Компьютерные анализаторы спермы в андрологических исследованиях и ветеринарной практике. Theriogenology 2002;57:149–179.

2. Mortimer S. CASA: практические аспекты. J Androl 2000;21:515–524.

3. Kathiravan P, Kalatharan J, Karthikeya G, Rengarajan K, Kadirvel G. Объективный анализ подвижности сперматозоидов для оценки фертильности молочных быков с помощью компьютерной системы: обзор. Reprod Domest Anim 2011;46:165–172.

4. Massányi P, Chrenek P, Lukáč N и др. Сравнение различных камер для оценки параметров подвижности сперматозоидов кроликов с помощью системы CASA. Slovak J Anim Sci 2008;41:60–66.

5. Iguer-ouada M, Verstegen J. Оценка автоматизированной компьютерной системы «Hamilton Thorn» для анализа спермы собак. Theriogenology 2001;55:733–749.

6. Purdy PH, Tharp N, Stewart T, Spiller S, Blackburn H. Влияние pH и температуры разбавленной охлаждённой спермы хряков на характеристики подвижности свежих и размороженных сперматозоидов. Theriogenology 2010;74:1304–1310.

7. Contri A, Valorz C, Faustini M, Wegher L, Carluccio A. Влияние подготовки спермы на результаты оценки подвижности криоконсервированных сперматозоидов быков методом CASA. Theriogenology 2010;74:424–435.

8. Mortimer S, Swan M. Влияние частоты получения изображений на общепринятые и не зависящие от сглаживания кинематические показатели сперматозоидов человека, проходящих капацитацию. Hum Reprod 1999;14:997–1004.

9. Brito L. Различия в лабораторных процедурах оценки и исследования спермы. В кн.: Материалы 23-й технической конференции по искусственному осеменению и воспроизводству , 2010, с. 61–67.

10. Castellini C, Dal Bosco A, Ruggeri S, Collodel G. Какая частота кадров оптимальна для оценки подвижности сперматозоидов разных видов с помощью компьютерного анализа спермы? Fertil Steril 2011;96:24–27.

11. Mortimer S, Swan M. Разработка не зависящих от сглаживания кинематических показателей движения сперматозоидов человека, проходящих капацитацию. Hum Reprod 1999;14:986–996.

12. Fernández-Santos M, Martínez-Pastor F, Matias D и др. Влияние длительного хранения в охлаждённом состоянии придатков семенников благородного оленя на целостность ДНК и подвижность размороженных сперматозоидов. Anim Reprod Sci 2009;111:93–104.

13. Zinaman M, Uhler M, Vertuno E, Fisher S, Clegg E. Оценка компьютерного анализа спермы (CASA) с окрашиванием IDENT для определения концентрации сперматозоидов. J Androl 1996;17:288–292.

14. Tardif A, Farrell P, Trouern-Trend V, Simkin M, Foote R. Использование красителя Hoechst 33342 для оценки живых сперматозоидов в свежей и замороженной сперме быков методом компьютерного анализа. J Androl 1998;19:201–206.

15. Wood P, Foulkes J, Shaw R, Melrose D. Оценка спермы, фертильность и отбор быков герефордской породы для искусственного осеменения. J Reprod Fertil 1986;76:783–795.

16. Kjaestad H, Ropstad E, Berg K. Оценка сперматологических показателей, используемых для прогнозирования фертильности замороженной спермы быков. Acta Vet Scand 1993;34:299–303.

17. Correa J, Pace M, Zavos P. Взаимосвязь характеристик сперматозоидов после замораживания и оттаивания, оцениваемых при стандартном анализе спермы и функциональных тестах сперматозоидов, с фертильностью быков в программе искусственного осеменения. Theriogenology 1997;48:721–731.

18. Gillan L, Kroetsch T, Maxwell W, Evans G. Оценка характеристик сперматозоидов in vitro в связи с фертильностью быков молочных пород. Anim Reprod Sci 2008;103:201–214.

19. Kathiravan P, Kalatharan J, Edwin M, Veerapandian C. Автоматизированный компьютерный анализ подвижности сперматозоидов быков-помесей и её связи с оплодотворением in vitro ооцитов хомяка без блестящей оболочки. Anim Reprod Sci 2008;104:9–17.

20. Farrell P, Presicce G, Brockett C, Foote R. Количественная оценка характеристик сперматозоидов быков методом компьютерного анализа спермы (CASA) и их связи с фертильностью. Theriogenology 1998;49:871–879.

21. Januskauskas A, Gil J, Söderquist L и др. Влияние скорости охлаждения на подвижность сперматозоидов после оттаивания, целостность мембран, состояние капацитации и фертильность спермы быков молочных пород, используемой для искусственного осеменения в Швеции. Theriogenology 1999;52:641–658.

22. Budworth P, Amann R, Chapman P. Взаимосвязь между измеренными с помощью компьютера показателями подвижности сперматозоидов быков после замораживания и оттаивания и фертильностью. J Androl 1988;9:41–54.

23. Davis R, Katz D. Эксплуатационные стандарты для приборов CASA. J Androl 1993;14:385–394.

24. Gillan L, Evans G, Maxwell W. Проточно-цитометрическая оценка показателей сперматозоидов в связи с потенциалом фертильности. Theriogenology 2005;63:445–457.

25. Martínez-Pastor F, Mata-Campuzano M, Alvarez-Rodríguez M, Alvarez M, Anel L, de Paz P. Зонды и методы оценки сперматозоидов с помощью проточной цитометрии. Reprod Domest Anim 2010;45(доп. 2):67–78.

26. Hossain M, Johannisson A, Wallgren M, Nagy S, Siqueira A, Rodriguez-Martinez H. Проточная цитометрия для оценки целостности и функциональности сперматозоидов животных: современное состояние. Asian J Androl 2011;13:406–419.

27. Graham J, Kunze E, Hammerstedt R. Анализ жизнеспособности сперматозоидов, целостности акросомы и функции митохондрий с помощью проточной цитометрии. Biol Reprod 1990;43:55–64.

28. Partyka A, Nizański W, Łukaszewicz E. Оценка свежей спермы птицы и спермы после замораживания и оттаивания методом проточной цитометрии. Theriogenology 2010;74:1019–1027.

29. Oldenhof H, Blässe A, Wolkers W, Bollwein H, Sieme H. Осмотические свойства субпопуляций сперматозоидов жеребца, определённые путём одновременной оценки объёма и жизнеспособности клеток. Theriogenology 2011;76:386–391.

30. Garner D, Johnson L, Yue S, Roth B, Haugland R. Оценка жизнеспособности сперматозоидов быка с помощью двойного окрашивания ДНК красителями SYBR-14 и йодидом пропидия. J Androl 1994;15:620–662.

31. Garner D, Johnson L. Оценка жизнеспособности сперматозоидов млекопитающих с использованием SYBR-14 и йодида пропидия. Biol Reprod 1995;153:276–284.

32. Marchiani S, Tamburrino L, Giuliano L и др. Сумоилирование сперматозоидов человека и его связь с качеством спермы. Int J Androl 2011;34:581–593.

33. Maxwell W, Welch G, Johnson L. Жизнеспособность и целостность мембран сперматозоидов после разбавления и сортировки методом проточной цитометрии в присутствии или отсутствие семенной плазмы. Reprod Fertil Dev 1996;8:1165–1178.

34. Nagy S, Jansen J, Topper E, Gadella B. Метод проточной цитометрии с тройным окрашиванием для оценки целостности плазматической и акросомной мембран криоконсервированных сперматозоидов быка непосредственно после оттаивания в присутствии частиц яичного желтка. Biol Reprod 2003;68:1828–1835.