Воспроизводство крупного рогатого скота

1. Purvis K, Rui H, Schølberg A, Hesla S, Clausen O. Применение проточной цитометрии в исследованиях акросомы сперматозоидов человека. J Androl 1990;11:361–366.

2. Lybaert P, Danguy A, Leleux F, Meuris S, Lebrun P. Усовершенствованный метод выявления и количественной оценки акросомной реакции у сперматозоидов мыши. Histol Histopathol 2009;24:999–1007.

3. Carvalho J, Sartori R, Machado G, Mourão G, Dode M. Оценка качества криоконсервированных сперматозоидов быка после сортировки по полу методом проточной цитометрии и их использования для получения эмбрионов in vitro. Theriogenology 2010;74:1521–1530.

4. Anzar M, Kroetsch T, Boswall L. Криоконсервация спермы быков, доставленной на следующий день после отправки, и её влияние на подвижность сперматозоидов после оттаивания, целостность плазматической мембраны, мембранный потенциал митохондрий и сохранность акросом. Anim Reprod Sci 2011;126:23–31.

5. Yi Y, Zimmerman S, Manandhar G и др. Убиквитин-активирующий фермент (UBA1) необходим для капацитации сперматозоидов, акросомного экзоцитоза и проникновения сперматозоида через оболочку яйцеклетки при оплодотворении у свиней. Int J Androl 2012;35:196–210.

6. Carver-Ward J, Moran-Verbeek I, Hollanders J. Сравнительный анализ акросомной реакции сперматозоидов человека методом проточной цитометрии с использованием антитела к CD46 и лектинов. J Assist Reprod Genet 1997;14:111–119.

7. Evenson D, Darzynkiewicz Z, Melamed M. Одновременное измерение методом проточной цитометрии жизнеспособности сперматозоидов и мембранного потенциала митохондрий, связанного с подвижностью клеток. J Histochem Cytochem 1982;30:279–280.

8. Garner D, Thomas C, Joerg H, DeJarnette J, Marshall C. Флуориметрическая оценка функции митохондрий и жизнеспособности криоконсервированных сперматозоидов быка. Biol Reprod 1997;57:1401–1406.

9. Hallap T, Nagy S, Jaakma U, Johannisson A, RodriguezMartinez H. Оценка митохондриальной активности сперматозоидов после замораживания и оттаивания с помощью Mitotracker Deep Red 633. Theriogenology 2005;63:2311–2322.

10. Sousa A, Amaral A, Baptista M и др. Не все сперматозоиды одинаковы: функционирующие митохондрии отличают субпопуляцию сперматозоидов человека с более высоким потенциалом к оплодотворению. PLoS ONE 2011;6:e18112.

11. Thomas C, Garner D, DeJarnette J, Marshall C. Влияние криоконсервации на функцию органелл и жизнеспособность сперматозоидов быка по данным проточной цитометрии. Biol Reprod 1998;58: 786–793.

12. Garner D, Thomas C. Органеллоспецифичный зонд JC-1 выявляет различия мембранного потенциала митохондрий сперматозоидов быка. Mol Reprod Dev 1999;5:222–229.

13. Guthrie H, Welch G. Выявление высокого мембранного потенциала митохондрий в сперматозоидах, меченных митохондриальным зондом 5,5′,6,6′-тетрахлор--1,1′,3,3′-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианинйодидом (JC-1), методом проточной цитометрии с сортировкой клеток по флуоресценции. Methods Mol Biol 2008;477:89–97.

14. Evenson D, Jost L. Анализ структуры хроматина сперматозоидов полезен для оценки фертильности. Methods Cell Sci 2000;22:169–189.

15. Januskauskas A, Johannisson A, Rodriguez-Martinez H. Оценка качества сперматозоидов методами флуориметрии и анализа структуры хроматина в связи с фертильностью при осеменении в производственных условиях замороженно-оттаянной спермой шведских быков-производителей. Theriogenology 2001;55:947–961.

16. Januskauskas A, Johannisson A, Rodriguez-Martinez H. Незначительные изменения мембран в криоконсервированной сперме быков и их связь с жизнеспособностью сперматозоидов, структурой хроматина и фертильностью в производственных условиях. Theriogenology 2003;60:743–758.

17. Karabinus D, Evenson D, Jost L, Baer R, Kaproth M. Сравнение качества спермы молодых и взрослых голштинских быков по результатам световой микроскопии и проточной цитометрии. J Dairy Sci 1990;73:2364–2371.

18. Love C, Kenney R. Связь повышенной восприимчивости ДНК сперматозоидов к денатурации с фертильностью жеребца. Theriogenology 1998;50:955–972.

19. Evenson D, Jost L, Marshall D и др. Применение анализа структуры хроматина сперматозоидов в качестве диагностического и прогностического метода в клинике репродукции человека. Hum Reprod 1999;14:1039–1049.

20. Anzar M, He L, Buhr M, Kroetsch T, Pauls K. Апоптоз сперматозоидов в свежей и криоконсервированной сперме быков, выявленный методом проточной цитометрии, и его связь с фертильностью. Biol Reprod 2002;66:354–360.

21. Sutovsky P, Neuber E, Schatten G. Убиквитин-зависимый механизм контроля качества сперматозоидов распознаёт сперматозоиды с дефектами ДНК, что показано с помощью двойного анализа на убиквитин и TUNEL. Mol Reprod Dev 2002;61:406–413.

22. Waterhouse K, Haugan T, Kommisrud E и др. Повреждение ДНК сперматозоидов связано с фертильностью спермы молодых быков норвежской красной породы в производственных условиях. Reprod Fertil Dev 2006;18:781–788.

23. Colás C, Grasa P, Casao A и др. Изменения иммуноцитохимической локализации кальмодулина, связанные с капацитацией и акросомальным экзоцитозом сперматозоидов барана. Theriogenology 2009;71:789–800.

24. Guthrie H, Welch G, Theisen D, Woods L. Влияние хранения при пониженной температуре на внутриклеточную концентрацию кальция, образование активных форм кислорода, функцию митохондрий, подвижность и целостность плазматической мембраны сперматозоидов полосатого лаврака (Morone saxatilis). Theriogenology 2011;75:951–961.

25. Kumaresan A, Siqueira A, Hossain M, Bergqvist A. Вызванные криоконсервацией изменения фосфорилирования тирозиновых остатков белков сперматозоидов из разных фракций эякулята хряка. Cryobiology 2011;63:137–144.

26. Peña A, López-Lugilde L, Barrio M, Becerra J, Quintela L, Herradón P. Исследования внутриклеточной концентрации Ca²⁺ у сперматозоидов собак после оттаивания: влияние препарата Equex из разных источников, двух разбавителей для оттаивания и инкубации после оттаивания в условиях, способствующих капацитации. Reprod Domest Anim 2003;38:27–35.

27. Saacke R, Dalton J, Nadir R, Nebel R, Bame J. Связь характеристик спермы и времени осеменения с частотой оплодотворения и качеством эмбрионов. Anim Reprod Sci 2000;60–61:663–677.

28. Evenson D, Darzynkiewicz Z, Melamed M. Связь неоднородности хроматина сперматозоидов млекопитающих с фертильностью. Science 1980; 210:1131–1133.

Глава 75

Суперовуляция у коров

Reuben J. Mapletoft¹ и Gabriel A. Bó²

1 Кафедра клинических наук о крупных животных, Западный колледж ветеринарной медицины, Университет Саскачевана, Саскатун, Саскачеван, Канада

2 Институт репродукции животных Кордовы (IRAC), дорога Хенераль-Пас — местность Посо-дель-Тигре — станция

• Хенераль-Пас, почтовый индекс 5145, Кордова, Аргентина

Вступление

Целью индукции суперовуляции у крупного рогатого скота является максимальное увеличение количества оплодотворенных и трансферабельных (пригодных к пересадке) эмбрионов с высокой вероятностью наступления стельности.¹ Однако, в обзорах коммерческих отчетов о переносе эмбрионов сообщалось о широком диапазоне суперовуляторных реакций и количества полученных эмбрионов. В 2048 донорских сборах (вымываний) от мясного скота было зарегистрировано в среднем 11,5 яйцеклеток/эмбрионов с 6,2 трансферабельными эмбрионами.² Вариабельность была большой, как в плане суперовуляторной реакции, так и по качеству эмбрионов; 24% сборов не дали жизнеспособных эмбрионов, 64% дали трансферабельных эмбрионов меньше среднего, а 30% дали 70% эмбрионов. При извлечении эмбрионов от 987 дойных коров было получено немного меньше яйцеклеток/ эмбрионов, но разброс был аналогичным.³ Высокая степень непредсказуемости суперовуляторной реакции создает проблемы, которые влияют как на эффективность, так и на прибыльность программ эмбриотрансфера.⁴

Вариабельность ответа яичников на стимуляцию была связана с различиями в суперстимулирующих методах, таких как подготовка гонадотропинов, групповая и общая доза гонадотропинов, продолжительность и время обработки, а также использование дополнительных гормонов. Дополнительные факторы, которые могут быть более важными, присущи животному и окружающей его среде. Они могут включать пищевой статус, историю воспроизводства, возраст, время года, породу, влияние повторной гиперстимуляции и статус яичников на момент обработки. Хотя в понимании репродуктивной физиологии крупного рогатого скота был достигнут значительный прогресс, факторы, свойственные животному-донору, изучены лишь частично.

Гонадотропины и суперовуляция

Факторы, влияющие на суперовуляторный ответ после введения экзогенных гонадотропинов, включают источник получения гормонов, партию и биологическую активность.⁵ Для индукции суперовуляции у коровы использовались три различных типа препаратов гонадотропина: гонадотропины, полученные от свиньи, гипофиза домашних животных; лошадиный хорионический гонадотропин (eCG); человеческий менопаузальный гонадотропин или любой другой.^5,6

Менопаузальный гонадотропин человека не дает никаких преимуществ при использовании у крупного рогатого скота⁷ и не применяется в коммерческих целях; поэтому дальше обсуждаться не будет.

Экстракты гипофиза содержат фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). По оценкам, биологический период полувыведения ФСГ у коровы составляет 5 часов или меньше,⁸ поэтому его необходимо вводить два раза в день, чтобы успешно вызвать суперовуляцию.^9,10 Обычная схема обработки - это внутримышечное введение ФСГ два раза в день в течение 4 или 5 дней с общей дозой 28-50 мг (Armor) неочищенного экстракта гипофиза или 260-400 мг NIH-FSH-PI - частично очищенного экстракта гипофиза (Folltropin®-V, Bioniche Animal Health Inc., Бельвиль, Онтарио, Канада). Через 48 или 72 часа после начала обработки вводится простагландин PGF2α для индукции лютеолиза. Эструс наступает через 36–48 часов, а овуляция - на 24–36 часов позже.^11,12

Лошадиный хорионический гонадотропин (eCG) представляет собой сложный гликопротеин, обладающий активностью как ФСГ, так и лютеинизирующего гормона (ЛГ).¹³ Было показано, что его период полураспада составляет 40 часов у коровы и сохраняется в кровотоке крупного рогатого скота до 10 дней; таким образом, его обычно вводят однократно внутримышечно спустя 48 часов после инъекции PGF2α.¹⁴ Продолжительный период полураспада eCG вызывает длительную непрерывную стимуляцию яичников, ановуляцию фолликулов, нарушение эндокринных профилей и снижение качества эмбрионов.^15-18 Эти проблемы в значительной степени были преодолены с помощью внутривенной инъекции антител к eCG во время первого осеменения, через 12–18 часов после начала охоты.^14,19 Рекомендуемые дозы eCG варьируются от 1500 до 3000 МЕ, из которых при внутримышечной инъекции обычно выбирают 2500 МЕ.

Monniaux и др.¹⁰ обработали группы коров либо 2500 МЕ eCG, либо 50 мг (Armor) гипофизарного ФСГ и увидели, что частота овуляции и процент коров с более чем тремя трансферабельными эмбрионами были немного выше в группе, обработанной ФСГ, чем в группе с eCG. Хотя эти результаты согласуются с результатами Elsden и соавт,²⁰ другие исследователи не обнаружили различий между экстрактами гипофиза, содержащими ФСГ и eCG.^21,22

Исследования эндокринного статуса показали, что животные, получавшие eCG, чаще имели аномальные профили ЛГ и прогестерона,^15,23 , что было связано со снижением как процента овуляций, так и оплодотворяемости²⁴ по сравнению с коровами, получавшими ФСГ.

Хотя для фолликулогенеза у млекопитающих требуются как ФСГ, так и ЛГ, содержание ФСГ и ЛГ в неочищенных препаратах гонадотропина сильно разнится.⁵ Анализы радиорецепторов и биотесты in vitro выявили вариабельность как активности ФСГ, так и ЛГ в eCG не только среди беременных кобыл, но и у одной и той же кобылы в разные периоды беременности.¹³ Было изучено влияние соотношения ФСГ / ЛГ в eCG на суперовуляторные реакции, и была обнаружена положительная корреляция между соотношением активности ФСГ / ЛГ и суперовуляторной реакцией. Более низкие уровни активности ФСГ / ЛГ снижали овуляторный ответ у неполовозрелых крыс, а добавление ЛГ к eCG уменьшало суперовуляторный ответ у коров.^5,13

Сообщалось, что очищенные экстракты гипофиза с низким содержанием ЛГ улучшают суперовуляторную реакцию у крупного рогатого скота. Chupin и др.²⁵ сверхстимулировали три группы молочных коров равным количеством очищенного свиного (p) ФСГ - 450 мкг и различными количествами ЛГ, и показали, что средний коэффициент овуляций, общее количество эмбрионов и количество трансферабельных эмбрионов увеличивались с уменьшением дозы ЛГ. Было высказано предположение, что высокие уровни ЛГ во время суперстимуляции вызывают преждевременную активацию ооцита.¹⁶ Ряд экспериментов с экстрактом гипофиза с пониженным содержанием ЛГ²⁶ в нескольких различных дозах, в пределах от 100 до 900 мг NIH-FSH-PI, не выявили никаких доказательств пагубного влияния дозы на качество эмбриона.^6,27 С другой стороны, удвоение дозы сырых экстрактов гипофиза, содержащих как ФСГ, так и ЛГ, привело к значительному снижению частоты оплодотворения и процента пригодных к пересадке эмбрионов.⁶ В совокупности данные подтверждают гипотезу о том, что пагубное воздействие высоких доз гонадотропинов гипофиза на качество яйцеклеток / эмбрионов связано с избытком ЛГ.

Хотя обычно считается, что для успешной суперовуляции требуется некоторое количество ЛГ, уровень эндогенного ЛГ может быть достаточным. Looney и др.²⁸ сообщили, что рекомбинантно полученный бычий (b) ФСГ вызывал высокие суперовуляторные реакции без добавления экзогенного ЛГ. Эти данные предполагают, что ЛГ не нужен в суперстимулирующих препаратах и что качество эмбриона может быть лучше при использовании чистого ФСГ. Очень высокая частота оплодотворения и частота переносимых эмбрионов в отсутствие экзогенного ЛГ предполагают, что введение ЛГ в протоколах суперстимуляции в любой дозе может быть вредным для качества эмбриона. Кроме того, эти результаты и более свежие данные с рекомбинантным bFSH29 указывают на то, что будущий прогресс заключается в использовании рекомбинантно-полученных гонадотропинов.

Влияние ЛГ на суперовуляторную реакцию также было продемонстрировано в эксперименте с телками кросса Брахман (Bos indicus), суперстимулированных 400 мг NIH-FSH-PI, содержащим 100%, 16% или 2% ЛГ.³⁰ Хотя более очищенные препараты в этом эксперименте вызвали более высокие суперовуляторные реакции, наблюдались очевидные сезонные закономерности; реакции с наиболее очищенными и промежуточными препаратами превосходили наименее очищенный препарат в летние месяцы, но только наиболее очищенный препарат был высокоэффективным в зимние месяцы. Эти результаты, по-видимому, противоречат выводам Page и др.³¹ , которые сообщили, что суперовуляторная реакция и качество эмбрионов у телок

голштинской породы не зависели от уровня ЛГ в прохладную погоду, но во время теплового стресса более очищенный препарат давал больше желтых тел и значительно больше оплодотворенных яйцеклеток и трансферабельных эмбрионов. Становится очевидным, что стресс - это общий фактор; породы Bos taurus, вероятно, испытывают в летнюю жару стресс, в то время как породы Bos indicus, скорее всего, испытывают стресс в зимних условиях. В любом случае более очищенные экстракты приводили к более выраженным суперовуляторным ответам в условиях стресса под влиянием окружающей среды.

Волновая динамика фолликулов и суперстимуляция

Сообщалось, что суперстимулирующий ответ выше, если лечение начато до отбора доминантного фолликула. В одном раннем исследовании рекомбинантный bФСГ, введенный телкам в 1-й день цикла (овуляция = день 0), до периода отбора доминантного фолликула волны 1, приводил к большему количеству овуляций, чем на 5-й день, после отбора.³² Последующее исследование было проведено, чтобы определить, оказывает ли экзогенный ФСГ, введенный в ожидаемое время всплеска эндогенного волнового ФСГ, положительный эффект на сверхстимулирующий ответ.³³ Поскольку ожидалось, что эндогенный выброс ФСГ достигнет пика за 1 день до появления волны,³⁴ обработку начинали за день до, непосредственно в день или через 1-2 дня после появления волны. Значительно больше фолликулов было рекрутировано (отобрано) , когда лечение было начато в день или за день до появления фолликулярной волны, и было обнаружено больше овуляций, когда лечение было начато в день появления волны, а не за день до или через 1-2 дня после ее появления. Последующее исследование показало, что суперовуляция вызывалась с равной эффективностью, когда лечение было начато как во время первой так и во время второй фолликулярной волны, и что суперстимулирующий ответ был лучше, когда лечение начиналось во время появления фолликулярной волны.³⁵

Суперстимуляция: традиционный подход

На самых ранние этапах формирования эмбриотрансфера крупного рогатого скота обработка eCG была согласована с естественной регрессией желтого тела (то есть примерно на 16-й день цикла).¹² С введением PGF2α в 1970-х годах стало возможным начинать лечение гонадотропинами в другое время на протяжении эстрального цикла, и большинство практикующих врачей начинали лечение с ФСГ в середине цикла (то есть через 8–12 дней после эструса).^36,37 Хотя первоначально этот подход был основан на случайных свидетельствах, а затем на некоторых экспериментальных данных,³⁸ теперь известно, что он включает время появления второй фолликулярной волны у коров, демонстрирующих двух- или трехволновые циклы.^39,40

Многие практикующие врачи предпочитают сокращать график дозирования ФСГ и вводить PGF2α на третий день протокола, в то время как другие предпочитают вводить PGF2α на четвертый день, а многие вовсе не обрабатывают ФСГ на следующий день после введения PGF2α. Хотя не было обнаружено различий между 4- и 5-дневными протоколами лечения, недавние эксперименты показали, что число овуляций может быть улучшено у некоторых доноров, если лечение ФСГ продлено до 6 или 7 дней.^{41, 42}

Тем не менее, большинство протоколов суперстимуляции в большинстве случаев успешно вызывают суперовуляцию.