Воспроизводство крупного рогатого скота

Третьи включают в протокол прогестиновый инплант, который гарантирует, что у доноров не произойдет преждевременная охота, особенно если невозможно подтвердить наличие желтого тела до начала обработки ФСГ. Во всех случаях осеменение обычно проводится через 12 и 24 часа после начала течки.^11,37

Хотя способ суперстимуляции, начиная с середины цикла служил индустрии эмбриотрансфера на протяжении многих лет, традиционные протоколы стимуляции имеют два недостатка: 1) требование наличия обученного персонала для выявления течки как до, так и после начала лечения; и 2) необходимость иметь всех доноров в эструсе одновременно, чтобы начать суперстимулирующую терапию в наиболее подходящее время для групп коров (т. е. в середине цикла). Чтобы избежать этих проблем, были разработаны протоколы, которые облегчают суперстимуляцию после плановой индукции появления фолликулярной волны.

Синхронизация появления фолликулярной волны для суперовуляции

Эстрадиол и прогестерон

Способность выборочно вызывать появление фолликулярной волны позволяет инициировать суперстимуляцию независимо от стадии эстрального цикла и устраняет необходимость обнаружения течки или ожидания 8–12 дней для начала лечения гонадотропинами.³⁷ В 1990-х годах сообщалось об использовании прогестинов и эстрадиола для синхронного возникновения новой фолликулярной волны³⁶ , и их использование в протоколах суперстимуляции было подробно рассмотрено.^37,43 Лечение эстрадиолом вызывает подавление высвобождения ФСГ и атрезию фолликулов. Как только эстрадиол метаболизируется, скачки уровня ФСГ и новая фолликулярная волна возникает в среднем через 4 дня после лечения.^36,44 Самый распространенный протокол включает введение 5 мг эстрадиола-17β или 2,5 мг эстрадиола бензоата плюс 100 или 50 мг прогестерона путем внутримышечной инъекции во время установки интравагинального прогестинового инпланта (день 0).^37,43 Затем на 4-й день начинают внутримышечное введение ФСГ два раза в день. На 6-й день вводят PGF2α утром и вечером, а вечером удаляют прогестероновый инплант. Эструс обычно наступает на 8-й день (примерно через 48 часов после первой инъекции PGF2α), а осеменение проводится через 12 и 24 часа.

К сожалению, эстрадиол нельзя использовать во многих странах мира из-за опасений по поводу воздействия эстрогенных веществ на пищевую цепь.⁴⁵ Это ограничение ставит многих практикующих специалистов по пересадке эмбрионов перед серьезной дилеммой и создает необходимость в разработке методов лечения, не связанных с использованием эстрадиола.

Абляция (удаление) фолликула

Альтернативой использованию эстрадиола в протоколах суперстимуляции является устранение подавляющего эффекта доминантного фолликула путем аспирации всех фолликулов размером 5 мм и более под контролем УЗИ.⁴⁶ Появление фолликулярной волны происходит почти всегда через 24–36 часов, и в это время начинают обработку суперстимуляторами. Такой подход к синхронизации появления фолликулярной волны для суперстимуляции очень эффективен и приводит к ответным суперовуляторным реакциям, которые не отличаются от таковых при использовании эстрадиола.⁴⁶

Кроме того, было обнаружено, что необходимо удалить только два самых крупных фолликула, чтобы эффективно синхронизировать появление волны.⁴⁷ Протокол включает удаление двух самых крупных фолликулов на случайных стадиях эстрального цикла и введение прогестеронового импланта; обработка ФСГ начинается через 24–48 часов, а оставшаяся часть протокола такая же, как описано выше. Недостатком аспирации фолликулов под контролем УЗИ является то, что она требует ультразвукового оборудования и обученного персонала, что делает ее целесообразной только тогда, когда доноры содержатся на предприятии по производству эмбрионов; ее очень сложно применять в полевых условиях.

Гонадотропин-рилизинг-гормон

Другой альтернативой синхронизации фолликулярной волны является индукция овуляции доминантного фолликула с помощью гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ)^48,49 , за которой через 1-2 дня возникает новая волна.⁵⁰ Однако, появление новой фолликулярной волны синхронизируется только тогда, когда инъекция вызывает овуляцию, а при введении на случайных стадиях эстрального цикла ГнРГ приводит к овуляции менее чем у 60% животных.^50,51 Неудивительно, что обработка гонадолиберином перед началом суперстимуляции на случайных стадиях эстрального цикла приводила к более низким суперовуляторным ответам, чем обработка после абляции (удаления) фолликулов или инъекции эстрадиола.⁵² Совсем недавно ретроспективный анализ данных, полученных при коммерческой пересадке эмбрионов не выявил различий в количестве полученных эмбрионов между донорами, подвергнутыми сверхстимуляции через 4 дня после лечения эстрадиолом, и теми, которые были сверхстимулированы через 2 дня после лечения гонадолиберином (Randall Hinshaw, личное сообщение).^53,54 Примечательно, что в каждом из этих отчетов ГнРГ вводили через 2 дня после введения прогестеронового устройства. Более лучшие ответные реакции на стимуляцию могли быть следствием того, что прогестерон способствовал развитияю персистентного доминантного фолликула, который был более чувствителен к лечению ГнРГ.⁵⁵ Очевидно, что для подтверждения этих многообещающих результатов необходимо провести контролируемые исследования с использованием ГнРГ.

Улучшение овуляторного ответа на гонадолиберин

Большинство протоколов искусственного осеменения (ИО) с фиксированным временем, использующих ГнРГ для синхронизации появления фолликулярной волны, включают этап пресинхронизации для улучшения овуляторной реакции на первую инъекцию ГнРГ.^55,56 Другой альтернативой является синхронизация овуляции с последующей обработкой ФСГ во время появления первой фолликулярной волны.³³ Чтобы избежать необходимости определять охоту и овуляцию у доноров Nelore (Bos indicus), Nasser и др.⁵⁷ индуцировали синхронизацию овуляции с помощью протокола на основе эстрадиола, разработанного для осеменения по фиксированному времени. Затем коров обработали гонадотропинами в ожидаемое время овуляции (и появления первой фолликулярной волны). Суперовуляторный ответ не отличался от группы, одновременно подвергнутой суперстимуляции через 4 дня после лечения эстрадиолом. Однако, количество трансферабельных эмбрионов было снижено у коров, подвергнутых суперстимуляции во время первой фолликулярной волны, если это не сопровождалось использованием прогестеронового устройства. Аналогичные результаты были получены Rivera и соавторами.⁵⁸ В их исследовании коровы голштинской породы, подвергнутые суперстимуляции во время первой фолликулярной волны, также дали большее количество жизнеспособных эмбрионов после добавления прогестинового устройства.

PGF2α в день D3 вечером
и в день D4 утром
PGF2α GnRH Сбор яйцеклеток
GnRH AI AI /эмбрионов
D-8 D-1 D0 D3 D4 D5 D5 D6 D12
вечер утро вечер вечер утро утро вечер утро утро

Рис. 75.1 Протокол суперовуляции коров-доноров во время первой фолликулярной волны после овуляции, вызванной ГнРГ (GnRH). Доноры получают прогестиновое устройство вместе с PGF2α с последующим введением ГнРГ через 7 дней. В день (D)0 (36 часов после ГнРГ) начинается суперстимуляция ФСГ (два раза в день с уменьшением дозы в течение 4 дней). PGF2α вводят с двумя последними инъекциями ФСГ, а прогестиновый аппарат удаляют одновременно с последней инъекцией ФСГ. Овуляция индуцируется ГнРГ через 24 часа после удаления прогестина, доноров осеменяют в фиксированное время (AI) через 12 и 24 часа, а яйцеклетки / эмбрионы собирают через 7 дней. От Bó G, Carballo Guerrero D, Tríbulo A и др.Новые подходы к суперовуляции у коров.Reprod Fertil Dev 2010;22:106–112.

Bó и др.⁵⁹ недавно сообщили о серии экспериментов с целью разработки протокола суперстимуляции после овуляции, синхронно индуцированной введением гонадолиберина. Этот подход был основан на предыдущем исследовании, в котором овуляторный ответ увеличивался за счет развития стойкого фолликула при введении PGF2α и введении прогестинового устройства за 7-10 дней до введения ГнРГ.⁵⁵ В этом исследовании овуляция и появление фолликулярной волны происходили через 1-2 дня после введения ГнРГ, что указывает на то, что этот подход может быть использован в группах доноров с рандомным циклом.

Рекомендуемый протокол суперстимуляции схематически представлен на рисунке 75.1. Он включает инъекцию PGF2α во время введения прогестинового устройства. Семь дней спустя (когда устройство с прогестином все еще на месте) вводят гонадолиберин, чтобы вызвать овуляцию персистентного фолликула и появление фолликулярной волны; лечение ФСГ начинается через 36 часов после введения ГнРГ. Хотя этот протокол был разработан для 4-дневного лечения ФСГ, можно выполнить 5-дневный протокол суперстимуляции, просто отложив извлечение прогестинового устройства на 1 день. В целом в этой серии экспериментов более 95% животных овулировали к (или после?? овулировали в ответ на первое введение GnRH) первой инъекции ГнРГ, и суперовуляторная реакция, а также количество и качество яйцеклеток / эмбрионов были аналогичны тем, что были получены при использовании эстрадиола для синхронизации появления фолликулярной волны.⁵⁹

Фиксированное по времени осеменение доноров

Barros и Nogueira⁶⁰ разработали протокол суперстимуляции для крупного рогатого скота Bos indicus, который они назвали P-36 протокол. В этом протоколе прогестиновое устройство, которое вводится до начала суперстимулирующей терапии, остается на месте в течение 36 часов после инъекции PGF2α и овуляция индуцируется введением pLH (porcine luteinizing hormone - свиной лютеинизирующий гормон) через 12 часов после извлечения прогестинового устройства (то есть через 48 часов после введения PGF2α). Поскольку овуляция происходит между 24 и 36 часами после инъекции LH⁶¹ осеменение проводят в фиксированное время через 12 и 24 часа, что устраняет необходимость в выявлении охоты.

В серии экспериментов, в которых время овуляции контролировалось ультразвуком, Bó и др.¹¹ разработали протокол для доноров Bos taurus с фиксированным временем ИО без необходимости выявления охоты и без ущерба для результатов. По сути, время удаления прогестинового устройства откладывалось, чтобы предотвратить раннюю овуляцию и позволить поздно развивающимся фолликулам «наверстать упущенное» с последующей индукцией овуляции с помощью ГнРГ или pLH. В этом протоколе появление фолликулярной волны было синхронизировано эстрадиолом и прогестиновым устройством в день 0, а лечение ФСГ было начато на 4 день. На 6 день вводили PGF2α утром и вечером, а прогестиновое устройство было удалено утром на 7 день (через 24 часа после первого введения PGF2α). Утром 8-го дня (через 24 часа после удаления прогестинового устройства) вводили GnRH или pLH, а через 12 и 24 часа проводили ИО в фиксированное время. Отсрочка извлечения прогестинового устройства до утра 7-го дня привела к сбору большего количества яйцеклеток / эмбрионов и оплодотворенных яйцеклеток, чем его удаление утром 6-го дня (P. Chesta, докторская диссертация, Национальный университет Кордовы, Аргентина, 2010). С практической точки зрения, ИО доноров в фиксированное время показало свою эффективность в том плане, что специалистам по пересадке эмбрионов не нужно выявлять охоту.^62.

Исследования на высокопродуктивных коровах голштинской породы (Bos taurus) в Бразилии показали, что для них предпочтительно подождать еще 12 часов перед удалением прогестинового устройства (например, на 7-й день вечером; P36), а затем через 24 часа ввести ГнРГ или pLH (т.е. вечером на 8 день).⁶³ Подтверждено также, что у пород Bos indicus Baruselli и др.⁶⁴ предпочтительнее удалить прогестиновое устройство вечером 7-го дня (P36), а затем инъецировать ГнРГ через 12 часов (т. е. утром 8-го дня). Хотя доноров обычно осеменяют дважды, через 12 и 24 часа после введения pLH или ГнРГ¹¹ , можно использовать однократное осеменение высококачественной спермой через 16 часов после pLH.⁶⁴

Снижение потребности в нескольких инъекциях ФСГ

Поскольку период полувыведения гипофизарного ФСГ у коровы короткий,⁸ традиционные протоколы суперстимулирующей терапии состоят из внутримышечных инъекций ФСГ два раза в день в течение 4 или 5 дней.⁹ Это требует частого внимания со стороны персонала фермы и увеличивает вероятность неудач из-за несоблюдения протокола. Кроме того, инъекции два раза в день могут вызвать чрезмерный стресс у доноров с последующим снижением суперовуляторной реакции и / или изменением преовуляторного выброса ЛГ.^65,66

Таблица 75.1 Среднее (± SEM) продуцирование яйцеклеток / эмбрионов у доноров мясных пород, получавших Folltropin-V путем внутримышечных инъекций два раза в день в течение 4 дней (контроль) или ФСГ, разбавленный 2% гиалуронаном и вводимый путем однократной внутримышечной инъекции.

Средние показатели и проценты не различались ( P > 0.1). Источник: Bó G, Carballo Guerrero D, Tríbulo Aи др.Новые подходы к суперовуляции у коров.Reprod Fertil Dev 2010;22:106– 112.

Можно ожидать, что упрощенные протоколы уменьшат количество подходов к донорам и улучшат ответную реакцию на гормоны, особенно у менее податливых животных.

Было показано, что однократное подкожное введение ФСГ вызывает суперовуляторную реакцию, эквивалентную традиционным протоколам с инъекцией два раза в день у мясных коров с высокой упитанностью (т. е. оценка состояния тела >3 баллов по пятибальной шкале)⁶⁷ , но эти результаты не подтвердились у коров голштинской породы, у которых было меньше жировой ткани. Однако, суперовуляторные реакции у коров голштинской породы улучшились, когда однократную инъекцию разделили на две; 75% дозы ФСГ вводилось подкожно в первый день лечения, а оставшиеся 25% вводились через 48 часов после стандартного введения PGF2α.⁶⁸

Альтернативой для индукции последовательной суперовуляторной реакции с помощью однократной инъекции ФСГ является сочетание экстракта гипофиза с агентами, которые вызывают медленное высвобождение гормона в течение нескольких дней. Эти агенты обычно называют полимерами, которые биоразлагаемы и инертны по отношению к тканям, что облегчает их использование у животных.⁶⁹

В серии экспериментов, в которых ФСГ, разведенный в 2% растворе гиалуронана, вводился однократно внутримышечно (чтобы избежать влияния упитанности), было получено такое же количество яйцеклеток / эмбрионов, что и в традиционном протоколе с введением ФСГ два раза в день⁷⁰ (Таблица 75.1). Однако 2% гиалуроновая кислота была вязкой и трудно смешивалась с ФСГ, особенно в полевых условиях. Хотя более разбавленные препараты гиалуронана были менее эффективны при однократном введении, их использование было улучшено путем разделения их на две инъекции с интервалом 48 часов, как это было сделано с подкожными инъекциями ФСГ.

Протокол с раздельными внутримышечными инъекциями состоит из разбавления лиофилизированного порошка ФСГ 10 мл 1% или 0,5% раствора гиалуронана и введения 2/3 от дозы в первый день с последующим введением оставшейся 1/3 дозы через 48 часов, когда обычно вводится PGF2α.⁷¹ При сравнении с протоколом, где ФСГ вводится два раза в день (контроль) у 29 мясных коров, подвергнутых трехкратной гиперстимуляции по перекрестной схеме, количество трансферабельных эмбрионов по протоколу раздельной инъекции (1,0% гиалуронана, 5,0 ± 0,9; 0,5% гиалуронана, 6,1 ± 1,3) не отличались от контроля (4,0 ± 0,8). Эти данные предполагали, что разделение дозы ФСГ в любой концентрации гиалуронана на две внутримышечные инъекции с интервалом 48 часов приведет к сравнимой суперовуляторной реакции с традиционным протоколом внутримышечной инъекции два раза в день у мясного крупного рогатого скота. Более того, менее концентрированные растворы гиалуронана было несложно смешать с ФСГ даже в полевых условиях. Недавний отчет, основанный на данных коммерческого переноса эмбрионов, теперь подтвердил эти результаты у мясного скота в Северной Америке.⁷²

Заключительные заметки

Хотя разработка протоколов, контролирующих возникновение фолликулярной волны и овуляцию, не устранила вариабельность суперовуляторной реакции, эти методы лечения оказали положительное влияние на применение технологии пересадки эмбрионов на ферме, позволяя начинать лечение в любое назначенное время. Эти протоколы обеспечивают возможность оперативно провести суперстимуляцию без необходимости выявления охоты. Кроме того, эти протоколы облегчили ИО доноров в фиксированное время, тем самым избегая необходимости обнаружения течки во время протокола суперстимуляции. Однако эстрадиол, который оказался наиболее эффективным в этой области, был изъят из продажи почти по всему миру, оставив в арсенале практика только абляцию фолликулов, которую трудно использовать в полевых условиях, в качестве надежного метода синхронизации появления фолликулярной волны для супер стимуляции. Хотя синхронность появления фолликулярной волны после введения ГнРГ или рLH на случайных стадиях эстрального цикла считается слишком вариативной для суперстимуляции, в нескольких недавних сообщениях предлагается пересмотреть этот подход. Альтернативой может быть использование ФСГ во время появления первой фолликулярной волны после индуцированной ГнРГ овуляции персистирующего фолликула, возникшего под воздействием прогестина. Наконец, однократная или раздельная внутримышечная инъекция ФСГ в гиалуронане может использоваться для индукции удовлетворительного суперовуляторного ответа у доноров мясного крс, упрощая весь протокол и уменьшая число подходов к с животным, а также стресс, связанный с инъекциями.

Ссылки

1. Armstrong D. Последние достижения в области суперовуляции у крупного рогатого скота.Theriogenology 1993;39:7–24.

2. Looney C. Суперовуляция у самок мясного крупного рогатого скота. В кн.:Материалы 5-го ежегодного собрания Американской ассоциации трансплантации эмбрионов, Форт-Уэрт, Техас, 1986, с. 16–29.

3. Lerner S, Thayne W, Baker Rи др.Возраст, доза FSH и другие факторы, влияющие на суперовуляцию у коров голштинской породы.J Anim Sci 1986;63:176–183.

4. Hasler J, McCauley A, Schermerhorn E, Foote R. Реакция коров голштинской породы на стимуляцию суперовуляции.Theriogenology 1983;19:83–99.

5. Murphy B, Mapletoft R, Manns J, Humphrey W. Вариабельность препаратов гонадотропинов как фактор, влияющий на реакцию при стимуляции суперовуляции.Theriogenology 1984;21:117–125.