Воспроизводство крупного рогатого скота

Пайета Воздушный промежуток Эмбрион Герметизирующая
пробка
в среде для
замораживания
Среда для замораживания Среда для замораживания

Рисунок 77.1 Эмбрионы в пайетах со средой для замораживания, разделенной небольшими воздушными промежутками, или «пузырьками воздуха».

контейнере находится один эмбрион. Эмбрионы загружают в пайеты, втягивая несколько столбиков среды для замораживания, разделенных небольшими воздушными промежутками, или «пузырьками воздуха». Первый столбик не содержит эмбриона и герметизирует конец пайеты с пробкой. Во втором столбике находится эмбрион; от первого и третьего столбиков он отделен воздушными промежутками (рисунок 77.1).

Один из важных аспектов упаковки эмбрионов для замораживания — возможность их маркировки. Объем сведений, необходимых для надлежащей маркировки криоконсервированных эмбрионов, может значительно различаться. Руководство IETS рекомендует указывать определенные сведения о криоконсервированных эмбрионах. Как минимум следует указать отца и мать эмбриона и дату его замораживания. Дополнительно можно указать специалиста или компанию, проводивших замораживание, породы отца и матери, регистрационные номера, а также стадию развития и категорию качества эмбриона на момент замораживания. IETS предоставляет своим членам «коды замораживания», по которым можно определить специалиста или компанию, проводивших замораживание. Эти сведения можно напечатать непосредственно на пайете. Существуют принтеры для печати на пайетах, но при работе с эмбрионами их используют нечасто, поскольку сведения могут быть индивидуальными для каждого эмбриона. Надпись можно нанести от руки, но тогда она может оказаться неразборчивой. Один из способов маркировки — термосваркой прикрепить пайету 0.5-mL к пайете 0.25-mL и нанести маркировку на пайету 0.5-mL. Другой способ — использовать пластиковые стержни для идентификации и герметизации. Такие стержни крепятся к концу пайеты для спермы и могут служить для маркировки. В обоих случаях сведения можно напечатать на самоклеящихся этикетках и обернуть ими маркировочную пайету или пробку. Не рекомендуется наклеивать этикетки на пайету с эмбрионом: это может препятствовать эффективной теплопередаче при замораживании и оттаивании. Еще одно преимущество размещения маркировки отдельно от пайеты с эмбрионом состоит в том, что ее можно прочитать, не извлекая пайету с эмбрионом из LN.

Процесс замораживания

Медленное замораживание часто называют замораживанием с контролируемой скоростью, поскольку на большей части процесса скорость охлаждения контролируют. Выдержку для установления равновесия с криопротектором и упаковку для замораживания обычно проводят при температуре окружающей среды, или комнатной температуре. После того как эмбрионы загружены в пайеты, пайеты надлежащим образом промаркированы и герметизированы, температуру снижают до уровня на 1 или 2 °C ниже фактической температуры замерзания раствора для замораживания. Для обычно используемых растворов эта температура составляет приблизительно –6 °C. Поскольку льда еще нет

образования кристаллов льда на этом этапе, скорость охлаждения в течение этой фазы не имеет значения. Обычно эмбрионы помещают в соответствующие контейнеры в аппарат для замораживания с регулируемой скоростью охлаждения и снижают температуру на 1–2 °C в минуту до целевой температуры –6 °C. Затем в растворе для замораживания вызывают образование кристаллов льда — процесс, называемый «затравкой». Затравка, как правило, необходима, поскольку при таком охлаждении растворы переохлаждаются и остаются жидкими при температуре ниже истинной точки замерзания. Если допустить переохлаждение, то в момент начала образования кристаллов льда температура на короткое время резко снизится. Скорость этого снижения может легко превысить скорость, при которой вода успевает выходить из клеток, и внутри клеток образуются кристаллы льда. Образование кристаллов льда инициируют при температуре на 1 или 2 °C ниже истинной точки замерзания, охлаждая раствор в части контейнера, удалённой от эмбриона. Прикосновение к контейнеру пинцетом, охлаждённым в жидком азоте, или ватным тампоном, смоченным жидким азотом, — простой и эффективный способ вызвать образование кристаллов льда при условии, что температура остаётся немного ниже температуры замерзания раствора. После затравки температуру поддерживают в течение нескольких минут, чтобы между клетками эмбриона и раствором для замораживания, содержащим кристаллы льда, установилось осмотическое равновесие. Затем начинается собственно замораживание с регулируемой скоростью: температуру снижают со скоростью 0.3–0.5 °C в минуту. Во время этой фазы кристаллы льда растут в растворе вне клеток и вытягивают из них воду. Скорость охлаждения, при которой вода успевает выходить из клеток без образования кристаллов льда внутри них, определяется сочетанием проницаемости мембраны и размера клеток. Для клеток эмбриона крупного рогатого скота на стадии от морулы до бластоцисты эта скорость охлаждения составляет 0.3–0.5 °C. Охлаждение с регулируемой скоростью продолжают примерно до –35 °C. К этому моменту количество воды уменьшается настолько, а концентрации криопротектора и солей становятся достаточно высокими, чтобы при быстром снижении температуры произошла витрификация. После короткого периода уравновешивания при –35 °C температуру резко снижают, непосредственно погружая контейнер в жидкий азот. Охлаждение с регулируемой скоростью прекращают при температуре, допускающей витрификацию, поскольку наряду с концентрацией криопротектора повышается и концентрация солей. Продолжение охлаждения с регулируемой скоростью усиливает повреждение клеток вследствие ионного стресса и токсического действия криопротектора. После охлаждения эмбрионов до температуры жидкого азота их хранят в его жидкой фазе до размораживания. Разработано множество аппаратов для замораживания эмбрионов, некоторые из них выпускаются серийно. В большинстве таких аппаратов для охлаждения используют жидкий азот, а скорость охлаждения регулируют подводом тепла. Серийно выпускаемые аппараты оснащены тем или иным компьютерным интерфейсом, позволяющим регулировать скорость охлаждения в соответствии с программой замораживания, заданной оператором.

Размораживание

Хотя на начальном этапе охлаждение проводят медленно, на заключительном этапе применяют высокую скорость охлаждения, в результате чего оставшаяся в клетках вода витрифицируется. Поэтому размораживание должно быть быстрым. При медленном размораживании образуются кристаллы льда, вызывающие повреждение клеток. Быстрое нагревание обеспечивают погружением контейнеров в тёплую воду (35–37 °C) до полного таяния льда. Замечено, что если быстрое нагревание начинают непосредственно после извлечения из жидкой фазы азота, часто повреждается блестящая оболочка эмбриона. Эмпирические исследования показали, что нагревание на воздухе в течение примерно 30 с перед переносом в тёплую воду снижает частоту повреждения блестящей оболочки. При этом прохождение критического диапазона температур выше примерно –60 °C остаётся быстрым, что позволяет избежать повреждения клеток вследствие образования кристаллов льда при размораживании.

Удаление криопротектора

С самого начала применения криоконсервации эмбрионов для трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота удаление криопротекторов после размораживания оставалось одной из основных проблем. Она связана с тем, что вода проходит через биологические мембраны быстрее большинства криопротекторов. При удалении криопротекторов вода поступает в клетки быстрее, чем криопротектор выходит из них, вызывая набухание клеток. Клетки гораздо менее устойчивы к набуханию, чем к сжатию, а степень набухания при обычных концентрациях DMSO и глицерина может быть весьма губительной. Первоначально эту проблему обходили, удаляя криопротектор путём последовательного уравновешивания в растворах со всё более низкой его концентрацией. Применялись различные подходы с использованием сахарозы, в том числе «одноэтапный» метод, при котором используют раствор сахарозы с осмотическим давлением, равным осмотическому давлению раствора для замораживания.⁵ При таком подходе криопротектор может выходить из клеток без поступления в них воды, поэтому набухания не происходит. После удаления криопротектора эмбрионы можно поместить в физиологический раствор, и вода вновь поступит в клетки. При других подходах используют более низкие концентрации сахарозы,⁶ что позволяет удалять криопротектор в два этапа. Такой подход также предотвращает набухание клеток и ограничивает степень их сжатия и обезвоживания. Все эти подходы позволяют сохранить жизнеспособность криоконсервированных эмбрионов, однако требуют перемещения эмбрионов между разными растворами, а значит, на этапе между размораживанием и переносом необходимы определённые навыки работы с эмбрионами и соответствующее оборудование.

Прямой перенос

Методы предотвращения повреждения клеток при удалении криопротектора требуют перемещения эмбрионов между разными растворами. Поэтому при переносе криоконсервированных эмбрионов необходимы определённые навыки работы с эмбрионами и соответствующее оборудование. Описан ряд методов криоконсервации эмбрионов, при которых между размораживанием и переносом не требуется никаких дополнительных манипуляций. Это позволяет размораживать криоконсервированные эмбрионы и переносить их подходящим реципиентам в том же контейнере, в котором они

были заморожены; такой способ называют «прямым переносом». Описан ряд подходов с использованием сахарозы, однако в 1992 году Фёлкель и Ху⁷ сообщили, что криопротектор EG очень быстро проходит через мембраны клеток эмбриона крупного рогатого скота на 7-й день развития. Скорость его проникновения настолько высока, что эмбрионы, замороженные в растворе 1.5 mol/L EG, можно переносить непосредственно реципиентам без потери жизнеспособности. При такой концентрации EG является эффективным криопротектором, а отсутствие необходимости в манипуляциях между размораживанием и переносом позволяет избежать потери жизнеспособности из-за набухания клеток. Метод криоконсервации с использованием раствора для замораживания, содержащего 1.5 mol/L EG, стал стандартным в практике трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота.

Витрификация

Метод криоконсервации, обычно называемый витрификацией, отличается от медленного замораживания в двух основных отношениях: (i) применяются более высокие концентрации криопротектора; (ii) очень быстрое охлаждение начинают при более высокой температуре. Конкретные процедуры витрификации существенно различаются, и «универсальный» метод витрификации эмбрионов крупного рогатого скота пока не разработан. Здесь рассматриваются только общие аспекты процедуры.

Растворы для витрификации

Чтобы витрификация происходила при сравнительно высоких температурах (20–25 °C), концентрация криопротектора должна быть выше, чем при описанном медленном замораживании. Большинство растворов для витрификации эмбрионов крупного рогатого скота содержат сочетание двух или более проникающих криопротекторов и непроникающего криопротектора, например сахарозы или трегалозы. Типичный раствор для витрификации эмбрионов крупного рогатого скота содержит 15–20% EG, 15–20% DMSO и 0.3– 0.5 mol/L сахарозы или трегалозы. Суммарная концентрация EG и DMSO как минимум втрое превышает концентрацию EG или глицерина, применяемую при медленном замораживании. Длительное воздействие криопротекторов в таких концентрациях может быть токсичным, поэтому эмбрионы последовательно подвергают воздействию растворов со всё более высокой концентрацией, а время выдержки в конечном растворе для витрификации ограничивают 40–45 с.

Быстрое охлаждение

Чтобы витрификация происходила при высоких температурах, скорость охлаждения должна быть очень высокой — порядка 1000 °C в минуту или выше. Для достижения такой скорости, даже при непосредственном погружении в жидкий азот, отношение площади поверхности к объёму должно быть выше, чем у соломины для спермы размером 0.25-mL. Один из способов увеличить это отношение — использование «открытой вытянутой соломины»,⁸ которую успешно применяют для витрификации эмбрионов крупного рогатого скота. Для её изготовления пластиковую соломину для спермы осторожно нагревают и вытягивают, значительно уменьшая её диаметр и тем самым увеличивая отношение площади поверхности к объёму. К другим средствам достижения сверхвысокой скорости охлаждения относятся Cryoloop™, Cryotop™, Cryoleaf™ и другие.⁹ Они представляют собой различные подложки или носители, на которых можно разместить эмбрион в минимальном количестве раствора для витрификации. Это обеспечивает

высокое отношение площади поверхности к объёму и сверхбыстрое охлаждение при непосредственном погружении в жидкий азот. При использовании всех этих носителей эмбрион контактирует с жидким азотом, поэтому после завершения охлаждения эмбрион вместе с носителем помещают в герметизируемый внешний контейнер. Тот же принцип высокого отношения площади поверхности к объёму, который обеспечивает сверхбыстрое охлаждение, обеспечивает и сверхбыстрое нагревание при помещении в тёплый раствор для размораживания. Растворы для размораживания обычно содержат сахарозу, чтобы обеспечить быструю передачу тепла и ограничить набухание клеток при удалении криопротекторов.

Применение витрификации

Витрификация широко применяется для криоконсервации эмбрионов и ооцитов человека, но гораздо реже — эмбрионов крупного рогатого скота. В настоящее время криоконсервация ооцитов крупного рогатого скота не применяется в коммерческой практике, а ценность витрификации эмбрионов крупного рогатого скота на 7-й день развития, находящихся на стадии поздней морулы или бластоцисты, не установлена. Преимущество витрификации состоит в том, что для неё не нужен аппарат для замораживания с регулируемой скоростью охлаждения, а замораживание одного эмбриона занимает гораздо меньше времени. Однако необходимость точного соблюдения временных интервалов при витрификации требует обрабатывать эмбрионы по одному. Поэтому, если требуется обработать даже умеренное количество эмбрионов, витрификация займёт столько же времени или больше, чем медленное замораживание, при котором группы эмбрионов замораживают за один цикл работы аппарата. Необходимость точного соблюдения временных интервалов и особенности обращения с эмбрионами при сверхбыстром охлаждении и нагревании в ходе витрификации могут приводить к различиям в эффективности в зависимости от квалификации специалиста, выполняющего процедуру. Данных контролируемых исследований, проведённых в практических условиях и сравнивающих эффективность витрификации и медленного замораживания эмбрионов крупного рогатого скота на стадии поздней морулы или бластоцисты, очень мало. Одной из областей, где витрификация может иметь большее значение, является криоконсервация эмбрионов, полученных in vitro . Эмбрионы крупного рогатого скота, полученные из аспирированных ооцитов, созревших, оплодотворённых и культивированных in vitro , переносят криоконсервацию хуже, чем эмбрионы на той же стадии, полученные in vivo и извлечённые у коров после суперовуляции. Витрификация может найти более широкое применение для криоконсервации таких эмбрионов.

Перенос криоконсервированных эмбрионов

Условия переноса криоконсервированных эмбрионов реципиентам не отличаются от условий переноса эмбрионов, не подвергавшихся криоконсервации. Требования к синхронности половых циклов донора и реципиента такие же, как при

эмбрионов, не подвергавшихся криоконсервации. Конечно, понятие синхронности с эстральным циклом донора формально теряет смысл, поскольку пересадка криоконсервированного эмбриона может произойти спустя годы после его получения. Это подчеркивает важность указания стадии развития на маркировке криоконсервированных эмбрионов. Если стадия развития эмбриона находится между поздней компактной морулой и бластоцистой, его можно считать эмбрионом 7-го дня развития. Трудно говорить об ожидаемой частоте наступления беременности при любой пересадке эмбрионов, поскольку на нее влияет слишком много факторов. То же относится и к пересадке криоконсервированных эмбрионов. Если высококачественные эмбрионы крупного рогатого скота 7-го дня развития криоконсервированы описанными здесь методами медленного охлаждения, можно ожидать частоту наступления беременности, вполне сопоставимую с таковой при пересадке эмбрионов, не подвергавшихся криоконсервации, в тех же условиях. Уточнение «высококачественные эмбрионы» особенно важно для криоконсервированных эмбрионов, поскольку при использовании эмбрионов более низкого качества различие в частоте наступления беременности становится значительным.¹⁰Витрификация таких же эмбрионов, выполненная опытным и квалифицированным специалистом, должна обеспечивать сходную частоту наступления беременности.

Список литературы

1. Страуд Б. Отчет комитета IETS по статистике и сбору данных за 2012 год. Информационный бюллетень Общества пересадки эмбрионов 2012;30:16–26.

2. Линдер Г., Райт Р.-мл. Морфология и оценка эмбрионов крупного рогатого скота. Териогенология 1983;20:407–441.

3. Стрингфеллоу Д. А. Сертификация и идентификация эмбрионов. В кн.: Стрингфеллоу Д. А., Гивенс М. Д. (ред.) Руководство Международного общества пересадки эмбрионов, 4-е изд. Шампейн, Иллинойс: IETS, 2010.

4. Луни К., Уэстхьюсин М., Бондиоли К. Влияние температуры охлаждения на эмбрионы крупного рогатого скота до стадии компактизации. Териогенология 1989;31:218 (аннотация).

5. Лейбо С. Одноэтапный метод прямой нехирургической пересадки замороженных и оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота. Териогенология 1986;21:767–790.

6. Ниманн Х., Захер Б., Шиллинг Э., Шмидт Д. Повышение выживаемости бластоцист крупного рогатого скота при использовании сахарозы для разведения глицерина после быстрого замораживания и оттаивания. Териогенология 1982;17:102 (аннотация).

7. Фёлькель С., Ху Ю. С. Использование этиленгликоля в качестве криопротектора для эмбрионов крупного рогатого скота, позволяющее непосредственно пересаживать замороженные и оттаянные эмбрионы самкам-реципиентам. Териогенология 1992;37:687–697.

8. Вайта Г., Хольм П., Куваяма М. и др. Витрификация в открытой вытянутой соломинке (OPS): новый способ снижения криоповреждений яйцеклеток и эмбрионов крупного рогатого скота. Молекулярная репродукция и развитие 1998;51:53–58.

9. Сарагусти Дж., Арав А. Современные достижения в криоконсервации ооцитов и эмбрионов путем медленного замораживания и витрификации. Репродукция 2011;141:1–19.

10. Хаслер Дж., Макколи А., Латроп У., Фут Р. Влияние взаимодействия донора, эмбриона и реципиента на частоту наступления беременности в крупномасштабной программе пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. Териогенология 1987;27:139–168.