изгиб к его медиальной стороне и поддерживаю его, насколько возможно распрямляя. Затем продвигаю катетер как можно дальше, не ударяя и не царапая стенку рога, после чего ввожу эмбрион.
Всегда представляйте, что вы плавно вводите катетер в рог матки, а не нанизываете рог на катетер. Нажимая на шток, чтобы вытолкнуть эмбрион, представьте, что вы выдавливаете полоску зубной пасты на щётку. По мере нажатия на шток слегка отводите катетер назад, чтобы его кончик удалялся от выходящего эмбриона. Я также предпочитаю повернуть катетер на 360°, чтобы «снять» эмбрион с кончика, если он вдруг к нему прилип.
Пересадка размороженных эмбрионов
Пересадка замороженных эмбрионов проводится так же, как свежих, за исключением того, что замороженные эмбрионы следует пересаживать сразу после оттаивания, тогда как свежие можно хранить несколько часов (6–8) до пересадки.
О предпочтительном способе оттаивания ведутся споры. Возможны оттаивание в воде, на воздухе или их сочетание. При оттаивании в воде эмбрионы из ёмкости с жидким азотом (–193 °C) сразу погружают в водяную баню с температурой 35 °C. При оттаивании на воздухе эмбрионы держат на воздухе до полного оттаивания. При комбинированном оттаивании эмбрионы извлекают из ёмкости с жидким азотом, держат на воздухе 5–6 с, а затем погружают в воду с температурой 35 °C. При непосредственном погружении эмбрионов в воду возрастает вероятность растрескивания прозрачной оболочки, что может быть нежелательно при международной торговле. Эмбрионы с треснувшей прозрачной оболочкой нельзя замораживать для экспорта, поскольку через трещину к эмбриону могут проникнуть вирусы или бактерии. Показано, что выдерживание соломинки на воздухе в течение 5–6 с (и даже полное оттаивание на воздухе) предотвращает растрескивание прозрачной оболочки. Вместе с тем показано, что трещины в прозрачной оболочке могут способствовать выходу эмбриона из неё: микрофотография выявила, что некоторые эмбрионы не способны самостоятельно разорвать оболочку, необходимое для дальнейшего роста, и в результате погибают. Поэтому я применяю комбинированное оттаивание на воздухе и в воде.
Сегодня большинство специалистов по пересадке эмбрионов используют катетер IMV 52-cm для пересадки эмбрионов с синим чехлом. У чехла тщательно отполированный наконечник из нержавеющей стали, который травмирует эндометрий гораздо меньше, чем прозрачные чехлы или чехлы с зелёной заглушкой для катетера Cassou, применявшиеся при искусственном осеменении в 1970-х — 1990-х годах. Боковое отверстие чехла IMV (в отличие от открытого конца чехла для искусственного осеменения) помогает предотвратить попадание частиц из шейки матки непосредственно в место введения эмбриона.
Показатели успешности пересадки замороженных и размороженных эмбрионов очень близки к показателям для свежих эмбрионов: согласно ежегодным данным, публикуемым Американской ассоциацией по пересадке эмбрионов (AETA), различие обычно не превышает 5%.
Заключение
В заключение хочу призвать вас заняться пересадкой эмбрионов крупного рогатого скота, если вы думаете, что эта работа может вам понравиться. Вы промахнётесь в 100% случаев, когда даже не попытаетесь сделать бросок. Пересадка эмбрионов дополняла нашу ветеринарную практику по лечению крупных животных в течение 13 лет (1977–1990), а последние 23 лет мы занимаемся исключительно ею. Если вы решите работать в этой области, советую вступить в Американскую ассоциацию по пересадке эмбрионов, Канадскую ассоциацию по пересадке эмбрионов или аналогичную ассоциацию в своей стране. Посещайте их собрания, знакомьтесь с коллегами, которые охотно поделятся своими знаниями, и получайте удовольствие от одного из самых интересных направлений ветеринарной деятельности.
Интернет-ресурсы
Американская ассоциация по пересадке эмбрионов: www.aeta.org Канадская ассоциация по пересадке эмбрионов: www.ceta.org Международное общество по пересадке эмбрионов: www.iets.org
*Agtech: http://www.agtechinc.com
*Professional Embryo Transfer Supply: www.pets-inc.com
*Reproduction Resources: www.reproductionresources.com
Stone Manufacturing (поставщик описанного расширителя шейки матки): www.stonemfg.net
*Упомянутые в тексте продукты Bioniche можно приобрести у этих и других поставщиков.
Глава 77
Криоконсервация эмбрионов крупного рогатого скота
Кеннет Бондиоли
Школа наук о животных, Университет штата Луизиана, Батон-Руж, Луизиана, США
Введение
Использование криоконсервации эмбрионов стало неотъемлемой частью технологии пересадки эмбрионов, особенно её коммерческого применения в отрасли пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. Об этом свидетельствует отраслевая статистика, собранная Международным обществом по пересадке эмбрионов (IETS). Из 572 342 in vivo эмбрионов крупного рогатого скота, полученных этим способом и пересаженных во всём мире в 2011 году, 324 149, или 57%, были криоконсервированы.1 Криоконсервация эмбрионов в сочетании с их пересадкой позволяет эффективно использовать реципиенток, сокращает необходимость перевозки скота, обеспечивает эффективный способ реализации генетического материала и значительно облегчает международный обмен генетическим материалом крупного рогатого скота.
Методы криоконсервации
Для криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота обычно применяют два типа процедур: (i) медленное, или «традиционное», замораживание и (ii) витрификацию. Витрификация — это переход воды в твёрдое стеклообразное состояние без образования кристаллов льда. При медленном замораживании используют низкую концентрацию криопротектора, вызывают образование кристаллов льда вне клеток эмбриона и медленно снижают температуру. Благодаря этому кристаллы растут и вытягивают воду из клеток эмбриона, тогда как внутри клеток кристаллы не образуются. Процесс продолжают до тех пор, пока концентрация криопротектора внутри клеток не станет достаточно высокой для образования стеклообразной структуры. При витрификации, напротив, используют высокие концентрации криопротекторов и очень быстрое охлаждение, так что стеклообразная структура внутри клеток образуется сразу. Из этого краткого описания двух методов видно, что терминология не вполне точна: оба метода в конечном счёте приводят к витрификации. Тем не менее термины «медленное замораживание» и «витрификация», используемые для различения способов достижения этого состояния, общеприняты и широко распространены.
Отбор эмбрионов для криоконсервации
Независимо от используемого метода криоконсервации отбор эмбрионов для замораживания всегда остаётся одним из основных факторов, влияющих на успех процедуры. На эффективность криоконсервации может влиять стадия развития эмбриона. Ооциты и эмбрионы на ранних стадиях развития (до образования компактной морулы) обычно переносят цикл замораживания и оттаивания хуже, чем эмбрионы на более поздних стадиях. К счастью, эмбрионы крупного рогатого скота на стадиях от компактной морулы до бластоцисты (обычно получаемые через 7 дней после проявления половой охоты), которые используют для нехирургической пересадки, успешно переносят криоконсервацию.
«Качество», или категория эмбриона, — показатель, который может значительно различаться и существенно влияет на эффективность криоконсервации. Оценка качества эмбриона, или присвоение ему категории, представляет собой попытку определить вероятность того, что данный эмбрион после пересадки подходящей реципиентке разовьётся до доношенного плода. Морфологические признаки эмбрионов крупного рогатого скота, лежащие в основе присвоения категорий, были описаны Линдером и Райтом2 и получили достаточно единообразное применение в коммерческой практике пересадки эмбрионов. Эти критерии оценки качества эмбрионов, а также критерии определения стадии их развития описаны в «Руководстве IETS по пересадке эмбрионов» .3 Это руководство широко признано во всём мире в качестве стандарта процедур пересадки эмбрионов. (Примечание редактора : подробное описание оценки эмбрионов и присвоения им категорий см. в главе 79.)
Важно понимать, что многие различия в морфологических признаках, лежащих в основе критериев оценки качества эмбрионов, усиливаются при замораживании и оттаивании. Многие из этих различий, из-за которых эмбрионам присваивают более низкие категории качества, прямо или косвенно отражают число жизнеспособных клеток в эмбрионе. Можно ожидать, что цикл замораживания и оттаивания лишь уменьшит
число жизнеспособных клеток, поэтому признаки, из-за которых эмбрионам присваивают более низкие категории качества, после такого цикла становятся более выраженными. Таким образом, криоконсервацию обычно применяют только к эмбрионам более высоких категорий качества (категории 1 или 2).
Хотя стадия развития влияет на криоконсервацию эмбрионов некоторых видов (например, человека, свиньи и лошади), при обычной пересадке эмбрионов она не имеет большого значения для криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота. У эмбрионов крупного рогатого скота наблюдались различия в способности переживать криоконсервацию в зависимости от стадии развития,4 однако эмбрионы на всех стадиях, обычно получаемые при нехирургическом извлечении на 7-й день (при этом 0-й день — день наблюдаемой или ожидаемой охоты), одинаково хорошо переживают криоконсервацию. Возможное исключение составляют вылупившиеся бластоцисты, которые, по наблюдениям, плохо переносят криоконсервацию. На 7-й день у крупного рогатого скота вылупившиеся бластоцисты обычно не получают, но иногда их обнаруживают, если извлечение откладывают до 8-го дня.
Криопротекторы
Криопротектором называют любое вещество, способствующее выживанию клеток при замораживании и оттаивании. Криопротекторы можно разделить на две основные группы: проникающие и непроникающие. Проникающие криопротекторы проходят через клеточную мембрану и действуют внутри клетки. Эти соединения имеют низкую молекулярную массу и полярную структуру молекулы, благодаря которой могут имитировать воду. При медленном, или традиционном, замораживании эмбрионов крупного рогатого скота обычно используют один из двух проникающих криопротекторов: глицерин или этиленгликоль (EG). Для витрификации в качестве проникающих криопротекторов часто используют глицерин и EG, а также диметилсульфоксид (DMSO) и изопропиловый спирт. Непроникающие криопротекторы не проходят через клеточную мембрану и действуют вне клетки. Эти соединения влияют на осмолярность раствора для замораживания и способствуют стабилизации мембраны. Как правило, это сахара, в том числе сахароза, галактоза и трегалоза. Обычно такие криопротекторы не включают в растворы для медленного замораживания, но часто используют для регулирования перемещения воды через клеточную мембрану после оттаивания (об этом речь пойдет ниже). Непроникающие криопротекторы часто включают в растворы для витрификации. Растворы для медленного замораживания обычно содержат только один криопротектор, а растворы для витрификации — несколько.
Растворы для замораживания готовят, добавляя криопротектор в буферный раствор. Традиционно для этого используют фосфатно-солевой буфер с добавлением сыворотки или бычьего сывороточного альбумина (BSA). В последнее время в продаже появились готовые растворы для замораживания. В них вместо фосфатного буфера часто используют цвиттер-ионный буфер, например MOPS или HEPES, а вместо сыворотки или BSA — синтетическую макромолекулу, например поливиниловый спирт. Последняя замена крайне важна для международного перемещения криоконсервированных эмбрионов. Проникающие криопротекторы обычно добавляют в концентрации 1.4 mol/L для глицерина или 1.5 mol/L для EG.
Медленное замораживание
При методе криоконсервации, обычно называемом медленным замораживанием, температуру снижают медленно или с контролируемой скоростью, чтобы кристаллы льда росли вне клеток и вытягивали из них воду, а внутри клеток кристаллы не образовывались. Как отмечалось выше, это название не вполне точно: медленное охлаждение продолжается лишь короткое время, после чего происходит очень быстрое охлаждение и витрификация оставшейся воды. Скорость охлаждения необходимо каким-либо образом контролировать; обычно для этого используют тот или иной электронный аппарат для замораживания.
Добавление криопротекторов
Описанные выше растворы для замораживания явно гипертоничны: при первом контакте с ними клетки сжимаются, а затем медленно возвращаются к исходному размеру по мере проникновения криопротекторов внутрь. Первоначально считалось, что такой осмотический стресс снижает жизнеспособность эмбрионов, поэтому их помещали в растворы криопротекторов поэтапно. Эмпирические исследования показали, что поэтапное добавление криопротектора не требуется. Особенно это справедливо для EG. Эмбрионы помещают в раствор для замораживания и выдерживают до установления равновесия с криопротектором. Поскольку в такой концентрации криопротекторы не обладают высокой токсичностью, точная продолжительность выдержки не имеет решающего значения: установление равновесия продолжается, пока эмбрионы «загружают» в соответствующую «упаковку», а также в начале замораживания. Помещенные в раствор для замораживания эмбрионы сначала плавают из-за гипертоничности раствора, а затем медленно опускаются по мере проникновения криопротекторов в клетки. Обычно загружать эмбрионы начинают, как только они опустятся на дно чашки; перед началом замораживания их выдерживают для установления равновесия не менее 10 мин.
Упаковка эмбрионов для криоконсервации
Контейнер, в который загружают эмбрионы для замораживания, должен отвечать нескольким требованиям. Его материал должен эффективно проводить тепло и выдерживать перепад от температуры тела до температуры жидкого азота (LN). Желательно также, чтобы контейнер было удобно маркировать и чтобы он не занимал слишком много места при хранении в LN. Криоконсервированные эмбрионы хранят в жидкой фазе LN, где пространство ограничено, поэтому важно, чтобы LN не проникал внутрь контейнера. Если при хранении LN попадет в контейнер, быстрое нагревание при оттаивании может повредить контейнер и привести к потере эмбрионов. На начальном этапе применения криоконсервированных эмбрионов крупного рогатого скота для пересадки часто использовали стеклянные ампулы, помещая в каждую по несколько эмбрионов. Однако из-за медленной теплопередачи, особенно при оттаивании, и большого объема, занимаемого стеклянными ампулами в LN, для этой цели вскоре стали применять пайеты для спермы. По мере распространения метода криоконсервации с «непосредственной пересадкой» (рассматривается ниже) предпочтительным контейнером стала пайета для спермы 0.25-mL. При непосредственной пересадке контейнер для криоконсервации используют и для пересадки, поэтому в каждом
