Воспроизводство крупного рогатого скота

Таблица 79.1 Рекомендуемые IETS коды стадий развития и категорий качества эмбрионов.

Источник: Stringfellow D, Givens M. Руководство Международного общества по переносу эмбрионов, 4-е изд. Шампейн, Иллинойс: Международное общество по переносу эмбрионов, 2010.

с четко выраженной полостью бластоцеля или быть спавшимися. Определить эту стадию развития бывает довольно трудно, если эмбрион полностью вышел из блестящей оболочки и почти полностью спался: его легко принять за фрагмент ткани эндометрия. Эмбрионы на этой стадии не допускаются к международной торговле, поскольку из-за нарушения целостности блестящей оболочки их невозможно промыть в соответствии с процедурами IETS по санитарной обработке эмбрионов.¹⁹

Код стадии 9: расширенная бластоциста, вышедшая из оболочки

По внешнему виду эта стадия развития эмбриона идентична стадии полного выхода из оболочки с кодом 8, за исключением значительно большего диаметра. Расширенные бластоцисты, вышедшие из оболочки, редко получают от самок-доноров крупного рогатого скота, если только вымывание не проводят более чем через 8 дней после начала течки. Эмбрионы на этой стадии развития не допускаются к международной торговле.

Категория качества эмбриона

Категорию качества эмбриона определяют путем визуальной оценки его морфологических признаков. При определении категории качества отдельного эмбриона учитывают однородность бластомеров по размеру, цвету и форме, наличие вытесненных клеток, погибших или дегенерирующих бластомеров, степень зернистости цитоплазмы, наличие цитоплазматических вакуолей, фрагментацию цитоплазмы и целостность структуры блестящей оболочки.

был получен эмбрион. Нарушения, если они есть, например цитоплазматические вакуоли, сравнительно незначительны, и не менее 85% клеток эмбриона образуют целостную, жизнеспособную и связную массу (то есть не более 15% клеток эмбриона вытеснены в перивителлиновое пространство). Блестящая оболочка должна иметь сферическую форму, гладкую поверхность и не иметь вогнутых или плоских участков, из-за которых эмбрион мог бы прилипнуть к чашке Петри или соломинке.

Код категории качества 2: удовлетворительное

Наблюдаются умеренные нарушения общей формы клеточной массы эмбриона либо размера, цвета и плотности составляющих его отдельных клеток. Небольшая неравномерность пигментации цитоплазмы отдельных бластомеров (не следует путать ее с прозрачностью полости бластоцеля и темной окраской клеток ICM у эмбриона на стадии бластоцисты), мелкие вкрапления в цитоплазме отдельных бластомеров и/или небольшое число вакуолей в цитоплазме бластомеров достаточны для присвоения категории качества с кодом 2. Не менее 50% клеток эмбриона должны образовывать целостную, жизнеспособную и связную массу.

Код категории качества 3: плохое

Наблюдаются значительные нарушения формы клеточной массы эмбриона либо размера, цвета и плотности отдельных клеток. Резко выраженная неравномерность пигментации цитоплазмы отдельных бластомеров, многочисленные мелкие вкрапления в их цитоплазме и/или большое число вакуолей в отдельных бластомерах достаточны для присвоения категории качества с кодом 3. Не менее 25% клеток эмбриона должны образовывать целостную, жизнеспособную и связную массу. Наличие множества вытесненных клеток, сильно различающихся по размеру, указывает на длительное и устойчивое нарушение связности бластомеров эмбриона и служит основанием для присвоения категории качества с кодом 3.

Код категории качества 4: погибший или дегенерирующий эмбрион

Объекты, которым присвоена категория качества с кодом 4, нежизнеспособны; их не следует переносить самкам-реципиентам или подвергать криоконсервации. Погибшие или дегенерирующие эмбрионы обычно относят к этой категории из-за крайне темной цитоплазмы, нарушения целостности клеточных мембран и других значительных дефектов. Поскольку эмбрионы обычно получают приблизительно на 7-й день полового цикла, любому эмбриону, не достигшему хотя бы стадии морулы, следует присваивать категорию качества с кодом 4.

Несмотря на сильную корреляцию между категорией качества эмбриона и частотой наступления стельности после переноса, перенос некоторых эмбрионов категории 1 не приводит к стельности, тогда как перенос некоторых эмбрионов категории 3 дает более высокую, чем ожидалось, частоту наступления стельности. В Руководстве IETS²⁰ сказано:

Код категории качества 1: отличное или хорошее

Эмбрион категории качества 1 имеет симметричную клеточную массу сферической формы; отдельные бластомеры однородны по размеру, цвету и плотности. Стадия развития эмбриона соответствует ожидаемой с учетом дня полового цикла самки-донора, когда

Следует признать, что визуальная оценка эмбрионов представляет собой субъективную оценку биологической системы, а не точную науку. Кроме того, на наступление беременности после переноса эмбрионов влияют и другие важные факторы, в том числе условия окружающей среды, качество реципиентов и квалификация специалиста.

Порядок оценки эмбрионов

При извлечении эмбрионов их обычно собирают с помощью устройства для фильтрации, которое сводит к минимуму объём промывочной среды, просматриваемой специалистом при поиске эмбрионов. Некоторые устройства для фильтрации эмбрионов одновременно служат чашкой для их поиска; при использовании других устройств эмбрионы необходимо перенести из фильтрационного устройства в чашку Петри. После извлечения эмбрионы находят в промывочной среде с помощью стереомикроскопа, обычно при увеличении 10–15×. Затем эмбрионы переносят в чашку Петри со средой для временного содержания эмбрионов, где их оценивают при увеличении не менее 50×, после чего присваивают двузначный код IETS, обозначающий стадию развития и качество эмбриона.

Как показано на рисунке 79.2, на 7-й день после начала охоты чаще всего извлекают эмбрионы на стадиях компактной морулы, ранней бластоцисты и бластоцисты. Расширенную бластоцисту обычно извлекают на 8-й день, но иногда её обнаруживают и при извлечении эмбрионов на 7-й день. Благодаря полупрозрачности и способности преломлять свет блестящая оболочка служит ориентиром, помогающим специалистам находить эмбрионы и яйцеклетки. Когда эмбрион достигает стадии вылупившейся бластоцисты, обнаружить его бывает труднее: он может выглядеть спавшимся, а без блестящей оболочки его легко принять за клетки эндометрия или другие клеточные остатки в чашке Петри.

Хотя каждому извлечённому эмбриону необходимо присвоить собственный двузначный код, весьма полезно рассматривать все извлечённые эмбрионы и яйцеклетки вместе. При таком сравнении специалисту обычно легче отличить неоплодотворённые яйцеклетки (UFO) от эмбрионов, а также сопоставить расширенные эмбрионы с более тонкой блестящей оболочкой и эмбрионы, которые ещё не расширились.

Хорошим прогностическим показателем жизнеспособности эмбриона служит соответствие его стадии развития ожидаемой стадии на определённый день после начала охоты. У коровы после суперовуляции следует ожидать различий в стадиях развития извлечённых эмбрионов, поскольку фолликулы яичников разрываются и высвобождают яйцеклетки в разное время. Аналогичным образом следует ожидать и различий в оценке качества эмбрионов. Нередко от одной коровы-донора получают как эмбрионы отличного качества, так и неоплодотворённые яйцеклетки и дегенерировавшие эмбрионы. Согласно результатам опроса Американской ассоциации трансплантации эмбрионов,²¹ среднее число жизнеспособных эмбрионов, извлечённых от доноров молочного направления, составляло 5.7 (56% от общего числа извлечённых яйцеклеток и эмбрионов), а от доноров мясного направления — 6.9 (также 56% от общего числа извлечённых яйцеклеток и эмбрионов). Среднее число извлечённых дегенерировавших эмбрионов и неоплодотворённых яйцеклеток составляло соответственно 1.6 (14% от общего числа эмбрионов и яйцеклеток) и 3.1 (29% от общего числа эмбрионов и яйцеклеток) у доноров молочного направления и 2.0 (15% от общего числа яйцеклеток и эмбрионов) и 3.5 (27% от общего числа яйцеклеток и эмбрионов) у доноров мясного направления.

Практическое применение рекомендаций по оценке эмбрионов

Чтобы помочь специалистам научиться правильно оценивать эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vivo, на рисунке 79.3 с помощью фотографий реальных яйцеклеток и эмбрионов крупного рогатого скота показан диапазон стадий развития эмбрионов, которые могут быть получены после

извлечения эмбрионов на 7-й день. На рисунке 79.3b показан эмбрион на более поздней стадии развития — расширенная вылупившаяся бластоциста, хотя на 7-й день эмбрион на этой стадии обычно не ожидается. Многим людям фотографии реальных образцов, расположенные рядом, помогают освоить оценку качества и классификацию эмбрионов лучше, чем иллюстрации и схематические рисунки. Помимо составного изображения на рисунке 79.3, показывающего диапазон стадий развития эмбрионов, иллюстрации в остальной части главы демонстрируют не только принципы оценки качества и классификации эмбрионов, но и некоторые распространённые трудности, с которыми сталкиваются специалисты.

Прежде чем продолжить, важно отметить: хотя каждой стадии развития эмбриона присваивают определённый код, эмбрионы развиваются непрерывно и постепенно переходят от одной стадии к следующей. Поэтому в момент извлечения многие эмбрионы могут фактически находиться между двумя стадиями развития. Когда эмбрион переходит от одной стадии к другой, возрастает вероятность того, что один специалист отнесёт его к одной стадии, а другой — к другой (например, некоторые — к стадии 4, а другие — к стадии 5; e.g.).

Дальнейшее рассмотрение оценки эмбрионов разделено на разделы, посвящённые эмбрионам, непригодным и пригодным для переноса.

Эмбрионы, непригодные для переноса

На начальном этапе оценки эмбрионов большинство специалистов отделяют нежизнеспособные яйцеклетки и эмбрионы, непригодные для переноса, от жизнеспособных эмбрионов, пригодных для переноса. Очевидно, нежизнеспособные эмбрионы не следует ни переносить самкам-реципиентам, ни подвергать криоконсервации.

Неоплодотворённые яйцеклетки

Неоплодотворённые яйцеклетки, собранные через 6–8 дней после начала охоты, могут значительно различаться по внешнему виду (рисунок 79.4). Для распознавания неоплодотворённой яйцеклетки особенно важны три признака: (i) окружающая цитоплазму яйцеклетки вителлиновая мембрана (её также называют оолеммой) гладкая и имеет почти идеально сферическую форму, если яйцеклетка не фрагментирована и не дегенерировала; (ii) цитоплазма имеет зернистый вид, без видимых признаков клеточного строения; (iii) между яйцеклеткой и блестящей оболочкой имеется умеренное по ширине перивителлиновое пространство, за исключением случаев дегенерации.

Как отмечалось выше, точно определить стадию развития дегенерировавших или фрагментированных яйцеклеток бывает непросто. Дегенерировавшие яйцеклетки иногда очень похожи на компактную морулу. Фрагментация, которую иногда называют образованием цитоплазматических выпячиваний, — это процесс, при котором часть цитоплазмы, не содержащая хромосом или хромосомной ДНК, отделяется от яйцеклетки, в результате чего образец выглядит многоклеточным. Обычно структура, образовавшаяся вследствие фрагментации, значительно меньше ожидаемого размера бластомера эмбриона из 2 или 4 клеток. Однако без окрашивания фрагментированной яйцеклетки красителем, специфичным к ДНК (например, бисбензимидом; e.g.), невозможно с уверенностью определить, является ли этот объект эмбрионом с кодом стадии 2

(a)

Стадия 1 (1 клеток) Стадия 2 (2 клеток)

Стадия 2 (от 4 до 8 клеток)

Стадия 2 (16 клеток)

Стадия 3 (ранняя морула)

Стадия 4 (компактная морула)

Стадия 5 (ранняя бластоциста)

Стадия 6 (бластоциста)

Стадия 7 (расширенная бластоциста)

(b)

Стадия 9 (расширенная вылупившаяся бластоциста)

Рисунок 79.3 (a) Сравнение стадий развития эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo и собранных на 6–8-й день после начала охоты. На 7-й день эмбрион с кодом стадии 1 считается неоплодотворённой яйцеклеткой, а эмбрион с кодом стадии 2 — погибшим или дегенерировавшим. (b) Расширенная вылупившаяся бластоциста, обычно извлекаемая на 8-й день после начала охоты или позднее; обратите внимание на пустую блестящую оболочку справа и расширенный эмбрион слева (предоставлено д-ром Брэдом Линдси).

или фрагментированной яйцеклеткой. Однако с практической точки зрения различие между кодами стадии 1 и 2 не имеет значения, поскольку ни тот ни другой объект не пригоден для переноса.

Погибшие или дегенерирующие эмбрионы

Если эмбрионы с кодом стадии 2 извлечены на 7-й день, их стадия развития не соответствует ожидаемой. Поэтому такие

эмбрионы относят к дегенерировавшим (оценка качества 4), поскольку они сильно отстают в развитии. Дегенерировавшими называют эмбрионы, которые были оплодотворены, но погибли на одном из этапов развития.

Эмбрион также может считаться погибшим или дегенерировавшим, если его бластомеры не соединены друг с другом (то есть между «наружными» клетками эмбриона не сформировались плотные межклеточные контакты). Если бластомеры не способны