Порядок оценки эмбрионов
При извлечении эмбрионов их обычно собирают с помощью устройства для фильтрации, которое сводит к минимуму объём промывочной среды, просматриваемой специалистом при поиске эмбрионов. Некоторые устройства для фильтрации эмбрионов одновременно служат чашкой для их поиска; при использовании других устройств эмбрионы необходимо перенести из фильтрационного устройства в чашку Петри. После извлечения эмбрионы находят в промывочной среде с помощью стереомикроскопа, обычно при увеличении 10–15×. Затем эмбрионы переносят в чашку Петри со средой для временного содержания эмбрионов, где их оценивают при увеличении не менее 50×, после чего присваивают двузначный код IETS, обозначающий стадию развития и качество эмбриона.
Как показано на рисунке 79.2, на 7-й день после начала охоты чаще всего извлекают эмбрионы на стадиях компактной морулы, ранней бластоцисты и бластоцисты. Расширенную бластоцисту обычно извлекают на 8-й день, но иногда её обнаруживают и при извлечении эмбрионов на 7-й день. Благодаря полупрозрачности и способности преломлять свет блестящая оболочка служит ориентиром, помогающим специалистам находить эмбрионы и яйцеклетки. Когда эмбрион достигает стадии вылупившейся бластоцисты, обнаружить его бывает труднее: он может выглядеть спавшимся, а без блестящей оболочки его легко принять за клетки эндометрия или другие клеточные остатки в чашке Петри.
Хотя каждому извлечённому эмбриону необходимо присвоить собственный двузначный код, весьма полезно рассматривать все извлечённые эмбрионы и яйцеклетки вместе. При таком сравнении специалисту обычно легче отличить неоплодотворённые яйцеклетки (UFO) от эмбрионов, а также сопоставить расширенные эмбрионы с более тонкой блестящей оболочкой и эмбрионы, которые ещё не расширились.
Хорошим прогностическим показателем жизнеспособности эмбриона служит соответствие его стадии развития ожидаемой стадии на определённый день после начала охоты. У коровы после суперовуляции следует ожидать различий в стадиях развития извлечённых эмбрионов, поскольку фолликулы яичников разрываются и высвобождают яйцеклетки в разное время. Аналогичным образом следует ожидать и различий в оценке качества эмбрионов. Нередко от одной коровы-донора получают как эмбрионы отличного качества, так и неоплодотворённые яйцеклетки и дегенерировавшие эмбрионы. Согласно результатам опроса Американской ассоциации трансплантации эмбрионов,21 среднее число жизнеспособных эмбрионов, извлечённых от доноров молочного направления, составляло 5.7 (56% от общего числа извлечённых яйцеклеток и эмбрионов), а от доноров мясного направления — 6.9 (также 56% от общего числа извлечённых яйцеклеток и эмбрионов). Среднее число извлечённых дегенерировавших эмбрионов и неоплодотворённых яйцеклеток составляло соответственно 1.6 (14% от общего числа эмбрионов и яйцеклеток) и 3.1 (29% от общего числа эмбрионов и яйцеклеток) у доноров молочного направления и 2.0 (15% от общего числа яйцеклеток и эмбрионов) и 3.5 (27% от общего числа яйцеклеток и эмбрионов) у доноров мясного направления.
Практическое применение рекомендаций по оценке эмбрионов
Чтобы помочь специалистам научиться правильно оценивать эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vivo, на рисунке 79.3 с помощью фотографий реальных яйцеклеток и эмбрионов крупного рогатого скота показан диапазон стадий развития эмбрионов, которые могут быть получены после
извлечения эмбрионов на 7-й день. На рисунке 79.3b показан эмбрион на более поздней стадии развития — расширенная вылупившаяся бластоциста, хотя на 7-й день эмбрион на этой стадии обычно не ожидается. Многим людям фотографии реальных образцов, расположенные рядом, помогают освоить оценку качества и классификацию эмбрионов лучше, чем иллюстрации и схематические рисунки. Помимо составного изображения на рисунке 79.3, показывающего диапазон стадий развития эмбрионов, иллюстрации в остальной части главы демонстрируют не только принципы оценки качества и классификации эмбрионов, но и некоторые распространённые трудности, с которыми сталкиваются специалисты.
Прежде чем продолжить, важно отметить: хотя каждой стадии развития эмбриона присваивают определённый код, эмбрионы развиваются непрерывно и постепенно переходят от одной стадии к следующей. Поэтому в момент извлечения многие эмбрионы могут фактически находиться между двумя стадиями развития. Когда эмбрион переходит от одной стадии к другой, возрастает вероятность того, что один специалист отнесёт его к одной стадии, а другой — к другой (например, некоторые — к стадии 4, а другие — к стадии 5; e.g.).
Дальнейшее рассмотрение оценки эмбрионов разделено на разделы, посвящённые эмбрионам, непригодным и пригодным для переноса.
Эмбрионы, непригодные для переноса
На начальном этапе оценки эмбрионов большинство специалистов отделяют нежизнеспособные яйцеклетки и эмбрионы, непригодные для переноса, от жизнеспособных эмбрионов, пригодных для переноса. Очевидно, нежизнеспособные эмбрионы не следует ни переносить самкам-реципиентам, ни подвергать криоконсервации.
Неоплодотворённые яйцеклетки
Неоплодотворённые яйцеклетки, собранные через 6–8 дней после начала охоты, могут значительно различаться по внешнему виду (рисунок 79.4). Для распознавания неоплодотворённой яйцеклетки особенно важны три признака: (i) окружающая цитоплазму яйцеклетки вителлиновая мембрана (её также называют оолеммой) гладкая и имеет почти идеально сферическую форму, если яйцеклетка не фрагментирована и не дегенерировала; (ii) цитоплазма имеет зернистый вид, без видимых признаков клеточного строения; (iii) между яйцеклеткой и блестящей оболочкой имеется умеренное по ширине перивителлиновое пространство, за исключением случаев дегенерации.
Как отмечалось выше, точно определить стадию развития дегенерировавших или фрагментированных яйцеклеток бывает непросто. Дегенерировавшие яйцеклетки иногда очень похожи на компактную морулу. Фрагментация, которую иногда называют образованием цитоплазматических выпячиваний, — это процесс, при котором часть цитоплазмы, не содержащая хромосом или хромосомной ДНК, отделяется от яйцеклетки, в результате чего образец выглядит многоклеточным. Обычно структура, образовавшаяся вследствие фрагментации, значительно меньше ожидаемого размера бластомера эмбриона из 2 или 4 клеток. Однако без окрашивания фрагментированной яйцеклетки красителем, специфичным к ДНК (например, бисбензимидом; e.g.), невозможно с уверенностью определить, является ли этот объект эмбрионом с кодом стадии 2
(a)
Стадия 1 (1 клеток) Стадия 2 (2 клеток)
Стадия 2 (от 4 до 8 клеток)
Стадия 2 (16 клеток)
Стадия 3 (ранняя морула)
Стадия 4 (компактная морула)
Стадия 5 (ранняя бластоциста)
Стадия 6 (бластоциста)
Стадия 7 (расширенная бластоциста)
(b)
Стадия 9 (расширенная вылупившаяся бластоциста)
Рисунок 79.3 (a) Сравнение стадий развития эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo и собранных на 6–8-й день после начала охоты. На 7-й день эмбрион с кодом стадии 1 считается неоплодотворённой яйцеклеткой, а эмбрион с кодом стадии 2 — погибшим или дегенерировавшим. (b) Расширенная вылупившаяся бластоциста, обычно извлекаемая на 8-й день после начала охоты или позднее; обратите внимание на пустую блестящую оболочку справа и расширенный эмбрион слева (предоставлено д-ром Брэдом Линдси).
или фрагментированной яйцеклеткой. Однако с практической точки зрения различие между кодами стадии 1 и 2 не имеет значения, поскольку ни тот ни другой объект не пригоден для переноса.
Погибшие или дегенерирующие эмбрионы
Если эмбрионы с кодом стадии 2 извлечены на 7-й день, их стадия развития не соответствует ожидаемой. Поэтому такие
эмбрионы относят к дегенерировавшим (оценка качества 4), поскольку они сильно отстают в развитии. Дегенерировавшими называют эмбрионы, которые были оплодотворены, но погибли на одном из этапов развития.
Эмбрион также может считаться погибшим или дегенерировавшим, если его бластомеры не соединены друг с другом (то есть между «наружными» клетками эмбриона не сформировались плотные межклеточные контакты). Если бластомеры не способны
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
(g) (h)
Рисунок 79.4 Неоплодотворённые яйцеклетки, извлечённые нехирургическим методом у коров-доноров после суперовуляции через 6–8 дней после начала охоты. Обратите внимание на чрезвычайно большое разнообразие морфологических признаков, затрудняющее точное распознавание таких яйцеклеток неопытными специалистами. (a) Неоплодотворённая яйцеклетка с гладкой вителлиновой мембраной и зернистой цитоплазмой, которую можно принять за компактную морулу. (b) Фрагментированная неоплодотворённая яйцеклетка. (c) Неоплодотворённая яйцеклетка с тёмной цитоплазмой и гладкой вителлиновой мембраной; её можно принять за компактную морулу. (d) Дегенерировавшая неоплодотворённая яйцеклетка. (e) Неоплодотворённая яйцеклетка со светлой зернистой цитоплазмой; обратите внимание на сперматозоиды (стрелки), прикреплённые к блестящей оболочке. (f) Неоплодотворённая яйцеклетка с гладкой вителлиновой мембраной; одна половина яйцеклетки зернистая, другая — прозрачная; её можно принять за эмбрион на стадии бластоцисты. (g) Фрагментированная неоплодотворённая яйцеклетка. (h) Дегенерировавшая неоплодотворённая яйцеклетка; обратите внимание на «исчезновение» вителлиновой мембраны.
образовать плотную, связанную группу, уплотниться и сформировать плотные межклеточные контакты, это признак того, что эмбрион дегенерирует или погибает (рисунки 79.5 и 79.6). На рисунке 79.6 обратите внимание на компактную морулу (a) рядом с дегенерировавшим или погибшим эмбрионом (b).
Эмбрионы, пригодные для переноса
После того как специалист отбраковал неоплодотворённые яйцеклетки и эмбрионы, непригодные для переноса, следует сосредоточиться на оставшихся эмбрионах, пригодных для переноса. В идеале всем таким эмбрионам присваивалась бы оценка качества 1. Однако на практике это не так. У пригодных для переноса эмбрионов встречается ряд «дефектов», из-за которых оценка качества может быть снижена до 2 или 3. Далее эти «дефекты» рассматриваются подробнее.
Каковы признаки эмбриона с оценкой качества 1? По существу, это отсутствие «дефектов», из-за которых ему присвоили бы оценку качества 1. Хотя ряд эмбрионов с оценкой качества 1 уже был показан (например, на рисунках 79.3 и 79.6; e.g.), в дальнейшем основное внимание будет уделено выявлению «дефектов» эмбрионов, приводящих к снижению оценки качества. Тем не менее на многих фотографиях эмбрионы с оценкой качества 1 будут показаны рядом с эмбрионами с оценками качества 2 и 3, а также с неоплодотворёнными яйцеклетками, чтобы облегчить сравнение.
Ряд морфологических особенностей эмбриона можно считать отклонениями от нормы. К таким нарушениям относятся неодинаковые размеры бластомеров, крупные и/или множественные вакуоли в цитоплазме клеток эмбриона, дегенерация одной или нескольких его клеток, отсутствие связи отдельных клеток с остальными клетками эмбриона (то есть наличие вытесненных бластомеров или клеток), а также повреждение или неправильная форма блестящей оболочки. У многих жизнеспособных эмбрионов обнаруживаются некоторые морфологические отклонения, например небольшое число вытесненных клеток. При оценке качества эмбриона необходимо учитывать не только наличие или отсутствие таких отклонений, но и то, насколько сильно они, предположительно, повлияют на выживаемость эмбриона после переноса. Опыт показывает, например, что эмбрион с несколькими дегенерировавшими клетками, состоящий преимущественно из клеток нормального вида, имеет отличные шансы обеспечить наступление беременности и рождение живого телёнка.
Вытесненные клетки
Одно из нарушений, относительно часто встречающихся на доимплантационной стадии развития эмбриона, заключается в том, что не все его клетки продолжают развиваться. В норме все клетки эмбриона соединены друг с другом и взаимодействуют между собой. Однако в некоторых случаях отдельные клетки не участвуют вместе с остальными в нормальном развитии эмбриона. Клетки, не принимающие полноценного участия в этом процессе, называют экструдированными: они не связаны с остальной частью эмбриона и находятся в перивителлиновом пространстве. Экструдированные клетки часто снижают потенциал развития эмбриона, особенно если их вытеснение происходит на раннем этапе. Поэтому размер и количество таких клеток непосредственно влияют на категорию качества эмбриона.
Экструдированные клетки, как правило, не делятся; их вытеснение из эмбриона может происходить на любом этапе развития начиная со стадии 2 клеток. Если значительное число бластомеров эмбриона остаётся здоровым, он может дать начало жизнеспособной беременности даже при наличии экструдированных клеток. Частота наступления беременности зависит
