Воспроизводство крупного рогатого скота

Блестящая оболочка
Перивителлиновое пространство
Внутренняя клеточная масса
Полость бластоцеля
Клетки трофобласта

Рисунок 79.1 Схематическое изображение эмбриона крупного рогатого скота на стадии бластоцисты.

(отдельные клетки оплодотворённого эмбриона до клеточной дифференцировки на стадии бластоцисты) становятся всё меньше с каждым делением клетки.

Блестящая оболочка — это полупрозрачная оболочка, окружающая эмбрион от стадии 1 клеток до стадии расширенной бластоцисты. Она служит физическим барьером для патогенов, содержит рецепторы для сперматозоидов и препятствует проникновению дополнительных сперматозоидов в яйцеклетку. Когда эмбрион достигает стадии расширенной бластоцисты и продолжает расти, он становится настолько большим, что разрывает блестящую оболочку и «вылупляется».

В ходе нормального in vivo эмбрионального развития бластомеры проходят ряд делений дробления. После оплодотворения яйцеклетка делится и развивается в эмбрион из 2 клеток, эмбрион из 2 клеток — в эмбрион из 4 клеток, эмбрион из 4 клеток — в эмбрион из 8 клеток и так далее. Когда бластомеры напоминают гроздь винограда и отдельные бластомеры невозможно различить, эта стадия эмбрионального развития называется стадией морулы. По мере дальнейшего развития эмбрион готовится к первой дифференцировке, называемой бластуляцией. Непосредственно перед ней клетки морулы «уплотняются» и распределяются между «внутренней» и «наружной» частями эмбриона.

После бластуляции эмбрион находится на стадии бластоцисты. Бластоциста содержит две популяции дифференцированных клеток: наружное кольцо клеток трофобласта и внутреннее скопление клеток, называемое внутренней клеточной массой. Из внутренней клеточной массы (ICM) развиваются плод и большая часть слоёв плаценты, а клетки трофобласта со временем образуют её наружный слой. Ещё один отличительный признак бластоцисты — наличие полости бластоцеля. Эта заполненная жидкостью полость окружена клетками трофобласта и постепенно увеличивается, способствуя истончению блестящей оболочки перед выходом из неё эмбриона. На рисунке 79.1 показаны признаки эмбриона крупного рогатого скота на стадии бластоцисты, а на рисунке 79.2 — стадии эмбрионального развития крупного рогатого скота.

Система оценки качества и классификации эмбрионов IETS

Эмбрионы обычно получают через 6–8 дней после начала охоты. Полученные эмбрионы следует распределить по группам в зависимости от стадии развития и категории качества. В таблице 79.1 представлена действующая система оценки эмбрионов IETS; далее приводится подробное описание стадий развития. После завершения оценки специалист присваивает каждому эмбриону двухзначный код. Например, раннюю бластоцисту удовлетворительного качества

обозначают кодом 5-2. Эмбрион на стадии бластоцисты отличного или хорошего качества обозначают кодом 6-1.

Стадия эмбрионального развития

Код стадии 1: 1 клетка

Если объект, полученный на 6–8-й день, действительно состоит лишь из одной клетки, можно с уверенностью считать его неоплодотворённой яйцеклеткой (UFO). Однако начинающему специалисту бывает трудно отличить UFO от компактной морулы (код стадии 4, см. ниже). Отличить UFO от других стадий эмбрионального развития также бывает сложно, поскольку не все UFO выглядят одинаково. У многих «нормальных» UFO блестящая оболочка и оолемма (также называемая желточной оболочкой) имеют идеально сферическую форму, цитоплазма отличается относительно однородной зернистостью, а перивителлиновое пространство имеет умеренный объём. Однако у других UFO могут наблюдаться различные признаки дегенерации, в том числе фрагментация цитоплазмы, создающая ложное впечатление наличия полости бластоцеля и/или клеточного деления, а также сильное уплотнение, из-за которого UFO можно спутать с компактной морулой.

Код стадии 2: от 2 до 12 клеток

Клетки доимплантационного эмбриона до их морфологической и функциональной дифференцировки называют бластомерами. Любой эмбрион, полученный через 6–8 дней после начала охоты и содержащий 2–12 бластомеров, почти наверняка погиб или дегенерирует. В нормальных условиях такая стадия эмбрионального развития должна наблюдаться в яйцеводе (а не в матке) до 5-го дня полового цикла коровы (день 0 = начало охоты). Очевидно, что даже если эмбрион из 2–12 клеток каким-то образом остаётся жизнеспособным, его развитие сильно задержано, и его не следует использовать для трансплантации или криоконсервации.

Код стадии 3: ранняя морула

Термин «морула» происходит от латинского слова, означающего «тутовая ягода». Эмбрионы на стадии морулы состоят из группы как минимум 16 клеток. Хотя некоторые отдельные бластомеры легко различимы, другие видны лишь частично, поскольку «скрыты» за другими бластомерами. Эта стадия эмбрионального развития, как и все рассмотренные ранее стадии, плохо подходит для криоконсервации.

Код стадии 4: компактная морула

Отдельные бластомеры этого эмбриона слились, образовав плотный компактный шар клеток. На этой стадии развития эмбриона различить отдельные бластомеры невозможно. В ходе компактизации клетки распределяются между внутренней и наружной частями клеточного шара. Клетки на его поверхности образуют друг с другом плотные контакты, формируя непрерывный слой. Клетки эмбриона занимают приблизительно 60–70% пространства внутри блестящей оболочки, называемого перивителлиновым пространством. Как отмечалось ранее, эмбрион на этой стадии легко спутать с НЛО.

1. 1-клеточный 2. 2-клеточный 2. 4-клеточный
   (день 1) (день 2) (день 3)
   2. 8-клеточный 2. 16-клеточный 3. Ранняя морула
   (день 4) (день 5) (день 5–6)
   4. Морула 5. Ранняя бластоциста 6. Бластоциста
   (день 6) (день 7) (день 7–8)
   8. Бластоциста, вышедшая из оболочки
   7. Расширенная бластоциста (день 9) 9. Расширяющаяся
   (день 8–9) бластоциста, вышедшая из оболочки
   (день 9–10)
   

Рисунок 79.2 Нормальное развитие эмбрионов крупного рогатого скота. Воспроизведено с разрешения: Stringfellow D, Givens M. Руководство Международного общества по переносу эмбрионов, 4-е изд. Шампейн, Иллинойс: Международное общество по переносу эмбрионов, 2010.

Код стадии 5: ранняя бластоциста

Наиболее характерный признак эмбриона на стадии ранней бластоцисты — небольшая заполненная жидкостью полость, называемая бластоцелем. Между полостью бластоцеля и блестящей оболочкой также видны несколько дифференцированных клеток трофобласта, хотя на этой стадии отличить их от клеток внутренней клеточной массы (ICM) довольно трудно. Клетки эмбриона занимают приблизительно 70–80% перивителлинового пространства. Толщина блестящей оболочки остается такой же, как на описанных ранее, менее поздних стадиях развития эмбриона.

Код стадии 7: расширенная бластоциста

Наиболее характерные признаки эмбриона на стадии расширенной бластоцисты — увеличение его общего диаметра в 1.2–1.5 раза по сравнению с первоначальным диаметром 150–190 мкм и истончение блестящей оболочки приблизительно до одной трети ее первоначальной толщины, составлявшей 12–15 мкм. Из-за значительного увеличения объема полости бластоцеля на этой стадии развития эмбриона перивителлиновое пространство отсутствует. Интересно, что расширенные бластоцисты часто выглядят спавшимися. Это явление характеризуется частичной потерей жидкости из полости бластоцеля и считается нормальным процессом, способствующим выходу эмбриона из оболочки. Истончившись, блестящая оболочка уже никогда не восстанавливает первоначальную толщину.

Код стадии 6: бластоциста

У эмбриона на стадии бластоцисты отчетливо различимы слой трофобласта, полость бластоцеля и группа клеток ICM; блестящая оболочка имеет нормальную толщину. Перивителлиновое пространство практически или полностью отсутствует, за исключением случаев, когда эмбрион частично спался.

Код стадии 8: бластоциста, вышедшая из оболочки

Эмбрионы на стадии выхода бластоцисты из оболочки могут еще выходить из блестящей оболочки либо уже полностью выйти из нее. Эмбрионы на этой стадии могут иметь сферическую форму

Таблица 79.1 Рекомендуемые IETS коды стадий развития и категорий качества эмбрионов.

Источник: Stringfellow D, Givens M. Руководство Международного общества по переносу эмбрионов, 4-е изд. Шампейн, Иллинойс: Международное общество по переносу эмбрионов, 2010.

с четко выраженной полостью бластоцеля или быть спавшимися. Определить эту стадию развития бывает довольно трудно, если эмбрион полностью вышел из блестящей оболочки и почти полностью спался: его легко принять за фрагмент ткани эндометрия. Эмбрионы на этой стадии не допускаются к международной торговле, поскольку из-за нарушения целостности блестящей оболочки их невозможно промыть в соответствии с процедурами IETS по санитарной обработке эмбрионов.¹⁹

Код стадии 9: расширенная бластоциста, вышедшая из оболочки

По внешнему виду эта стадия развития эмбриона идентична стадии полного выхода из оболочки с кодом 8, за исключением значительно большего диаметра. Расширенные бластоцисты, вышедшие из оболочки, редко получают от самок-доноров крупного рогатого скота, если только вымывание не проводят более чем через 8 дней после начала течки. Эмбрионы на этой стадии развития не допускаются к международной торговле.

Категория качества эмбриона

Категорию качества эмбриона определяют путем визуальной оценки его морфологических признаков. При определении категории качества отдельного эмбриона учитывают однородность бластомеров по размеру, цвету и форме, наличие вытесненных клеток, погибших или дегенерирующих бластомеров, степень зернистости цитоплазмы, наличие цитоплазматических вакуолей, фрагментацию цитоплазмы и целостность структуры блестящей оболочки.

был получен эмбрион. Нарушения, если они есть, например цитоплазматические вакуоли, сравнительно незначительны, и не менее 85% клеток эмбриона образуют целостную, жизнеспособную и связную массу (то есть не более 15% клеток эмбриона вытеснены в перивителлиновое пространство). Блестящая оболочка должна иметь сферическую форму, гладкую поверхность и не иметь вогнутых или плоских участков, из-за которых эмбрион мог бы прилипнуть к чашке Петри или соломинке.

Код категории качества 2: удовлетворительное

Наблюдаются умеренные нарушения общей формы клеточной массы эмбриона либо размера, цвета и плотности составляющих его отдельных клеток. Небольшая неравномерность пигментации цитоплазмы отдельных бластомеров (не следует путать ее с прозрачностью полости бластоцеля и темной окраской клеток ICM у эмбриона на стадии бластоцисты), мелкие вкрапления в цитоплазме отдельных бластомеров и/или небольшое число вакуолей в цитоплазме бластомеров достаточны для присвоения категории качества с кодом 2. Не менее 50% клеток эмбриона должны образовывать целостную, жизнеспособную и связную массу.

Код категории качества 3: плохое

Наблюдаются значительные нарушения формы клеточной массы эмбриона либо размера, цвета и плотности отдельных клеток. Резко выраженная неравномерность пигментации цитоплазмы отдельных бластомеров, многочисленные мелкие вкрапления в их цитоплазме и/или большое число вакуолей в отдельных бластомерах достаточны для присвоения категории качества с кодом 3. Не менее 25% клеток эмбриона должны образовывать целостную, жизнеспособную и связную массу. Наличие множества вытесненных клеток, сильно различающихся по размеру, указывает на длительное и устойчивое нарушение связности бластомеров эмбриона и служит основанием для присвоения категории качества с кодом 3.

Код категории качества 4: погибший или дегенерирующий эмбрион

Объекты, которым присвоена категория качества с кодом 4, нежизнеспособны; их не следует переносить самкам-реципиентам или подвергать криоконсервации. Погибшие или дегенерирующие эмбрионы обычно относят к этой категории из-за крайне темной цитоплазмы, нарушения целостности клеточных мембран и других значительных дефектов. Поскольку эмбрионы обычно получают приблизительно на 7-й день полового цикла, любому эмбриону, не достигшему хотя бы стадии морулы, следует присваивать категорию качества с кодом 4.

Несмотря на сильную корреляцию между категорией качества эмбриона и частотой наступления стельности после переноса, перенос некоторых эмбрионов категории 1 не приводит к стельности, тогда как перенос некоторых эмбрионов категории 3 дает более высокую, чем ожидалось, частоту наступления стельности. В Руководстве IETS²⁰ сказано:

Код категории качества 1: отличное или хорошее

Эмбрион категории качества 1 имеет симметричную клеточную массу сферической формы; отдельные бластомеры однородны по размеру, цвету и плотности. Стадия развития эмбриона соответствует ожидаемой с учетом дня полового цикла самки-донора, когда

Следует признать, что визуальная оценка эмбрионов представляет собой субъективную оценку биологической системы, а не точную науку. Кроме того, на наступление беременности после переноса эмбрионов влияют и другие важные факторы, в том числе условия окружающей среды, качество реципиентов и квалификация специалиста.