Воспроизводство крупного рогатого скота

1. Jones A, Beal W. Применение ультразвукового исследования в воспроизводстве коров. Bov Pract 2003;37:1–9.

2. Smith D, Grotelueschen D, Knott T, Ensley S. Организация отёла для снижения заболеваемости телят диареей: система отёла «Сандхиллс». В кн.: Материалы XVIII симпозиума по мясному скотоводству на пастбищных угодьях, Митчелл, штат Небраска , 2003. http:// digitalcommons.unl.edu/rangebeefcowsymp/70/

3. Jones A, Marek D, Wilson J, Looney C. Использование ультразвукового исследования для повышения эффективности отбора реципиентов благодаря ранней диагностике стельности. Theriogenology 1990;33:259.

4. Looney C, Nelson J, Schneider H, Forrest D. Повышение фертильности коров-реципиентов мясных пород. Theriogenology 2006;65:201–209.

5. Bó G, Peres L, Cutaia L и соавт. Схемы синхронизации коров-реципиентов для переноса эмбрионов в фиксированное время и повышения частоты наступления стельности. Reprod Fertil Dev 2011;24:272–277.

6. Lamb G, Larson J, Marquenzini G, Vasconcelos J. Факторы, влияющие на частоту наступления стельности в программе переноса эмбрионов, полученных методом ЭКО. В кн.: Материалы

совместной конференции Американской ассоциации переноса эмбрионов и Канадской ассоциации переноса эмбрионов , 2005, с. 31–36.

1. Wallace L, Breiner C, Breiner R и соавт. Введение хорионического гонадотропина человека при переносе эмбрионов вызывало овуляцию доминантного фолликула первой волны и повышало уровень прогестерона и частоту наступления стельности после переноса. Theriogenology 2011;75:1506–1515.

2. Vasconcelos J, Sá Filho O, Justolin P и соавт. Влияние введения гонадотропинов после осеменения на частоту зачатия у лактирующих молочных коров после искусственного осеменения в фиксированное время или переноса эмбрионов в условиях тропиков. J Dairy Sci 2011;94: 223–234.

3. Scenna F, Hockett M, Towns T и соавт. Влияние ингибитора синтеза простагландинов, вводимого при переносе эмбрионов, на частоту наступления стельности у коров-реципиентов. Prostaglandins Other Lipid Mediat 2005;78:38–45.

Глава 79

Оценка полученных in vivo эмбрионов крупного рогатого скота

Marianna M. Jahnke¹ , James K. West² и Curtis R. Youngs³

• 1 Кафедра ветеринарной диагностики и продуктивного животноводства, Колледж ветеринарной медицины, Университет штата Айова, Эймс, Айова, США

• 2 Директор службы переноса эмбрионов, Университет штата Айова, Эймс, Айова, США

3 Кафедра зоотехнии, Университет штата Айова, Эймс, Айова, США

Введение

Морфологическую оценку качества эмбрионов проводят по трём основным причинам. Первая — чтобы отличить эмбрионы от неоплодотворённых яйцеклеток. Тщательная оценка полученных эмбрионов и яйцеклеток необходима, чтобы не выбросить жизнеспособные эмбрионы и, наоборот, не перенести или не подвергнуть криоконсервации неоплодотворённые яйцеклетки. Вторая причина проведения морфологической оценки эмбрионов, полученных от донора, — определить, соответствует ли стадия их развития ожидаемой с учётом числа дней после течки, на которые их получили. Среди эмбрионов, полученных от одной самки-донора, часто наблюдается значительная вариабельность стадий развития; эту вариабельность следует учитывать при выборе подходящей самки-реципиента. Третья причина оценки качества эмбрионов — предоставить специалистам достаточно информации для принятия решения о переносе или криоконсервации полученных эмбрионов. Эмбрионы более низкого качества, перенос которых в свежем виде может привести к наступлению стельности, обычно не выдерживают криоконсервации.

Несмотря на важность этой темы, освоить оценку эмбрионов как часть процесса их переноса трудно, особенно при самостоятельном обучении. Хотя в этой главе приведено множество полезных фотографий эмбрионов и неоплодотворённых яйцеклеток, начинающим специалистам было бы полезно пройти интенсивное обучение с многократной практикой морфологической оценки эмбрионов под руководством опытного наставника по переносу эмбрионов. Надлежащая подготовка, соответствующее оборудование и большой практический опыт — три основных фактора, определяющих квалификацию специалиста в оценке эмбрионов.

История оценки эмбрионов крупного рогатого скота

Самые ранние стадии эмбрионального развития крупного рогатого скота (яйцеклетка и 2-клеточный эмбрион) впервые были описаны в 1931 г. Hartman и соавт. .¹ В последующее десятилетие ещё две исследовательские

группы^2,3 описали и проиллюстрировали различные стадии эмбрионального развития крупного рогатого скота. Эти первые описания эмбрионального развития легли в основу метода морфологической оценки эмбрионов, который впоследствии развился и получил широкое распространение в коммерческой практике переноса эмбрионов крупного рогатого скота.⁴

Метод морфологической оценки эмбрионов основан на способности человека визуально различать тонкие особенности полученных эмбрионов. В первые годы применения этот метод критиковали за чрезмерную субъективность, непоследовательность результатов и подверженность ошибкам. Поэтому изучали несколько альтернативных методов оценки качества эмбрионов, которые потенциально могли быть менее субъективными и давать более стабильные результаты, чем морфологическая оценка. Среди изучавшихся показателей и методов были способность эмбриона продолжать развитие при культивировании in vitro,^5,6 тест с исключением красителя,⁷ измерение метаболической активности эмбриона,⁶ поглощение глюкозы,⁸ окрашивание для выявления живых и мёртвых клеток,⁹ компьютерный анализ изображений,¹⁰ прижизненное окрашивание диацетатом флуоресцеина,^11,12 окрашивание DAPI (4′,6′-диамино-2-фенилиндолом) для выявления мёртвых клеток,¹³ и культивирование in vivo в яйцеводах кроликов.¹⁴

Совершенствование метода морфологической оценки эмбрионов

Несмотря на многочисленные попытки разработать более точный метод оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота, позволяющий надёжнее прогнозировать их дальнейшее развитие, методов, признанных лучшими или более точными, чем морфологическая оценка эмбрионов, пока не создано. В клинических условиях этот метод предпочитают для оценки жизнеспособности эмбрионов, поскольку он относительно прост и позволяет достаточно быстро оценить эмбрионы крупного рогатого скота.

После ранней публикации об оценке эмбрионов крупного рогатого скота, вышедшей в 1976 г. за авторством Shea и соавт. ,⁴ в течение следующих 7 лет были опубликованы ещё три основополагающие работы по оценке эмбрионов.^15–17 Эти две группы практикующих специалистов и учёных описали критерии, которые по большей части до сих пор используются в качестве общих

руководство по оценке эмбрионов и прогнозированию вероятности наступления беременности. В последней из этих работ¹⁷ описаны многочисленные параметры, обычно используемые для оценки эмбрионов, включая стадию эмбрионального развития и особенности строения: размер и форму эмбриона, наличие вышедших за его пределы или дегенерировавших клеток, окраску, количество и плотность расположения клеток (также называемых бластомерами), из которых состоит эмбрион на ранней стадии развития, целостность блестящей оболочки, а также наличие или отсутствие вакуолей в цитоплазме бластомеров эмбриона.

История системы оценки качества и классификации эмбрионов IETS

Международное общество трансплантации эмбрионов (IETS) — международная организация, основанная в 1974 году в Денвере, штат Колорадо, США. Её создала группа североамериканских практикующих специалистов и учёных, осознавших необходимость обмена научными открытиями. По мере роста мировой отрасли коммерческой трансплантации эмбрионов возникла острая необходимость в стандартизированной номенклатуре, чтобы покупатели и продавцы эмбрионов точно знали стадию развития и качество предлагаемых эмбрионов.

В своём руководстве IETS опубликовало¹⁸ рекомендованную систему двухзначных кодов для единообразного и систематического описания эмбрионов и их характеристик. После морфологической оценки эмбриону присваивают два числа, разделённые дефисом: они обозначают стадию эмбрионального развития и категорию качества эмбриона. Стандартизированные коды стадий эмбрионального развития варьируются от 1 (неоплодотворённая яйцеклетка) до 9 (расширяющаяся бластоциста, вышедшая из оболочки). Стандартизированный код качества эмбриона, определяемого по его морфологическим признакам, также является числовым и варьируется от 1 (отличное/хорошее качество) до 4 (погибший/дегенерирующий эмбрион). Использование системы оценки качества и классификации эмбрионов IETS обязательно при международной торговле эмбрионами; поэтому большинство практикующих специалистов применяют её и в повседневной работе. Более подробное описание этой системы приведено далее в главе.

Важность хорошего микроскопа

Прежде чем перейти к конкретной методике морфологической оценки эмбрионов, важно напомнить читателям, что для точной оценки необходимо надлежащее оборудование. Хотя многие начинающие специалисты по трансплантации эмбрионов стремятся купить недорогой микроскоп, чтобы сократить первоначальные затраты, такой выбор, скорее всего, затруднит поиск и оценку эмбрионов. При использовании микроскопа низкого качества специалисту бывает крайне трудно отличить неоплодотворённую яйцеклетку (UFO) от компактной морулы. Кроме того, такой микроскоп мешает различать категории качества эмбрионов.

В отличие от оценки спермы, для которой используют составной микроскоп, при трансплантации эмбрионов необходим стереомикроскоп. Стереомикроскопы, также называемые препаровальными микроскопами, предназначены для исследования объёмных объектов.

Эмбрионы крупного рогатого скота до имплантации, несмотря на микроскопические размеры, имеют округлую форму, подобно баскетбольному мячу, поэтому их лучше всего оценивать с помощью стереомикроскопа.

У стереомикроскопа есть несколько важных характеристик, непосредственно влияющих на то, насколько легко и точно можно оценивать эмбрионы. Одна из них — общее увеличение. Оно зависит от увеличения окуляров, объектива и трансфокатора. Например, общее увеличение стереомикроскопа с окулярами 10×, объективом 1× и трансфокатором 2× составит приблизительно 20× (10 × 1 × 2 = 20). Многие специалисты предпочитают искать эмбрионы при общем увеличении от 10× до 15×, но для эффективной оценки мелких деталей и выявления таких отклонений, как трещины в блестящей оболочке, эмбрионы следует рассматривать под стереомикроскопом с хорошим оптическим качеством и диапазоном увеличения, достигающим как минимум 50×. Следует отметить, что утверждённая IETS процедура санитарной обработки эмбрионов требует их осмотра при увеличении не менее 50 × .

Большинство специалистов по трансплантации эмбрионов предпочитают окуляры с увеличением не более 10×, чтобы сохранить достаточные поле зрения и разрешение изображения. Микроскоп с диоптрийной регулировкой хотя бы одного окуляра (если не обоих) очень полезен для компенсации различий в зрении левого и правого глаза специалиста. Регулируемая бинокулярная насадка также позволяет нескольким специалистам с разным межзрачковым расстоянием пользоваться одним стереомикроскопом.

Вторая важная характеристика стереомикроскопа для работы с эмбрионами и их оценки — рабочее расстояние (расстояние от эмбриона до объектива). Оно должно быть большим, чтобы обеспечить максимальную свободу действий при поиске эмбрионов. Предметный столик микроскопа должен быть просторным и не иметь препятствий, таких как зажимы для препаратов, кнопки питания и подобные элементы, затрудняющие перемещение чашек Петри по столику. Просторный, свободный от препятствий столик позволяет перемещать чашки Петри и работать инструментом для манипуляций с эмбрионами, не рискуя случайно опрокинуть чашку и потерять эмбрионы.

Третья важная характеристика стереомикроскопа, используемого для оценки эмбрионов, — освещение. Свет должен поступать снизу, под пластиной предметного столика, и быть ярким и равномерным по всей её площади. Пластина столика должна быть прозрачной; матовые пластины для работы с эмбрионами не подходят. Для большинства стереомикроскопов стандартным является освещение по методу светлого поля, но при поиске эмбрионов в «мутной» жидкости в поисковой чашке может помочь освещение по методу тёмного поля.

Нормальное in vivo эмбриональное развитие крупного рогатого скота

Чтобы определять, развивались ли эмбрионы, полученные от донора, с ожидаемой скоростью, специалистам необходимо хорошо понимать нормальное in vivo эмбриональное развитие крупного рогатого скота. Общий диаметр эмбриона крупного рогатого скота составляет 150–190 μm (или примерно в 15 раз больше размера белых кровяных клеток); сюда входит блестящая оболочка толщиной приблизительно 12–15 μm.¹⁷ Общий диаметр эмбриона внутри блестящей оболочки практически не меняется от стадии 1 клеток до стадии бластоцисты, поскольку бластомеры