Воспроизводство крупного рогатого скота

действующих ограничений международной торговли. Например, OIE относит блютанг к болезням, о которых необходимо сообщать, ввиду его социально-экономического значения и большой роли международной торговли животными и продукцией животного происхождения.^11,12 Кроме того, для большинства серотипов вируса блютанга (BTV) характерна передача половым путём и через плаценту.^13–17 Поэтому вмешательство человека, препятствующее таким путям передачи или способствующее им, может существенно влиять на распространение BTV,¹⁸ что подчёркивает необходимость этих исследований.

Первый подход состоял в том, что эмбрионы подвергали воздействию изучаемого патогена. После искусственного заражения in vitro эмбрионы промывали с обработкой трипсином или без неё, а затем проверяли на наличие вируса с помощью анализа in vitro либо путём переноса эмбрионов реципиентам, свободным от болезни. За реципиентами и их потомством тщательно наблюдали, выявляя признаки инфекции. Результаты этих опытов были обнадёживающими: применявшиеся процедуры обработки эмбрионов, по-видимому, позволяли предотвращать распространение ряда важных возбудителей инфекций.^19,20 Были проведены и дополнительные исследования, чтобы подтвердить эффективность этих процедур обработки эмбрионов при использовании обычных протоколов их получения и переноса. В этих исследованиях эмбрионы получали от больных доноров — в острой стадии заболевания или в период выздоровления, — промывали или обрабатывали трипсином, а затем либо проверяли на наличие патогенов in vitro либо переносили реципиентам, свободным от болезни. За реципиентами и их потомством наблюдали, чтобы выявить передачу заболевания.^{7–10,19–21} Результаты этих исследований подтвердили, что процедуры обработки эмбрионов, ныне одобренные IETS²¹ и рекомендованные OIE,²² действительно эффективно препятствуют распространению некоторых инфекционных болезней в широком масштабе; OIE относит эти болезни к соответствующим категориям.^8,13,22,23 К таким процедурам относятся стандартные способы обработки эмбрионов, полученных in vivo, перечисленные в руководстве IETS²¹ и одобренные OIE, как уже отмечалось выше.²² В «Руководстве по обучению работе с эмбрионами» Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединённых Наций (FAO)²⁴ приводятся следующие рекомендации.

1. Эмбрионы следует промывать не менее 10 раз, обеспечивая при каждой промывке разведение не менее чем в 100 раз; для переноса эмбрионов между промывками каждый раз следует использовать новую пипетку.

2. Вместе следует промывать только эмбрионы от одного донора, причём за один раз — не более 10 эмбрионов.

3. Иногда, например когда требуется инактивировать или удалить определённые вирусы, такие как герпесвирус крупного рогатого скота (BHV)-1 и вирус болезни Ауески, стандартную процедуру промывки следует дополнить промывками с ферментом трипсином, как описано в руководстве IETS.²¹

4. После промывки всю поверхность блестящей оболочки каждого эмбриона следует осмотреть при увеличении не менее 50 ×, чтобы убедиться в её целостности и отсутствии прилипшего материала.²⁴

Протокол промывки и обработки трипсином при работе с вирусами, способными прикрепляться к эмбрионам, такими как вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (BHV-1), вирус болезни Ауески и вирус везикулярного стоматита, предусматривает пятикратную промывку эмбрионов в

фосфатно-солевом буфере с добавлением антибиотиков и 0.4% бычьего сывороточного альбумина, но без Ca²⁺ и Mg²⁺ (поскольку они подавляют действие трипсина), затем двукратную промывку раствором трипсина продолжительностью 30–45 с каждая и повторную пятикратную промывку солевым раствором с антибиотиками и 2% термически инактивированной сыворотки (а не бычьего сывороточного альбумина) для инактивации трипсина.²⁴ Активность фермента трипсина, используемого для приготовления промывочных растворов, должна быть такой, чтобы 1 g гидролизовал 250 g казеина за 10 мин при 25°C и pH 7.6. Стерильный раствор трипсина должен содержать 0.25% трипсина в сбалансированном солевом растворе Хэнкса без Ca²⁺ и Mg²⁺. В продаже имеются готовые к применению растворы. После промывки всю поверхность эмбрионов следует осмотреть под микроскопом при увеличении не менее 50×.²⁴ Кроме того, в целях борьбы с болезнями переносить или подвергать криоконсервации следует только эмбрионы с неповреждённой блестящей оболочкой, свободной от прилипшего материала.^21–24

Источники патогенов

Хотя некоторым аспектам получения эмбрионов, по-видимому, уделялось достаточно внимания, другие важные источники патогенов при получении эмбрионов изучены недостаточно. К ним относятся загрязнённые материалы (реагенты) животного происхождения и больные реципиенты.^25–27 Понятие «материалы животного происхождения» охватывает различные компоненты, в том числе добавки к питательным средам (например, g фетальную бычью сыворотку или бычий сывороточный альбумин), гормоны, которые могут использоваться для обработки доноров (например, g фолликулостимулирующий гормон гипофизарного происхождения), и ферменты для обработки эмбрионов (например, g трипсин). Подробные описания рисков, связанных с этими продуктами, уже публиковались.^26–28 В частности, бычий сывороточный альбумин маловероятен как источник патогенов, поскольку технология его производства, по-видимому, исключает выживание загрязняющих агентов.^29,30 Напротив, фетальная бычья сыворотка при отсутствии надлежащего контроля качества может быть источником посторонних бактерий, грибов или вирусов.^26,31 Наиболее распространённым загрязняющим агентом в фетальной бычьей сыворотке является вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV).^26,31–33

Известен ряд патогенов, передающихся от матери плоду через плаценту. К ним относятся BVDV, Neospora caninum , BTV, вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) и Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (болезнь Йоне).^{13–17,34–36} Таким образом, при всесторонней оценке риска всегда следует учитывать всех возбудителей инфекций, способных вызывать временную, латентную или персистирующую инфекцию у донора и/или реципиента, которая может привести к заболеванию плода. В противном случае сбор и перенос эмбрионов, даже свободных от возбудителей, может привести к рождению больного потомства вследствие последующих внутриутробных инфекций.

По состоянию на декабрь 2012 года официальные рекомендации по биобезопасности при международном перемещении эмбрионов изложены в главе 4.7.5 Кодекса здоровья наземных животных в разделе «Управление рисками».³⁷ Эти общие стратегии были разработаны для того, чтобы перенос эмбрионов, полученных in vivo, не приводил к передаче возбудителей инфекций. Существуют три общие стратегии, позволяющие предотвратить передачу возбудителей инфекций при переносе эмбрионов, полученных in vivo, от

животных-доноров.^38,39 Каждая из них предполагает искусственное изменение условий среды, призванное препятствовать передаче возбудителей. Для крупного рогатого скота предпочтительным методом является обработка эмбрионов (то есть промывание или обработка трипсином),²¹ как описано выше, поскольку она относительно недорога, а её способность предотвращать распространение различных вирусов, бактерий и губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота подтверждена многочисленными исследованиями (см. таблицу 80.1).^8,22,37–39

Для крупного рогатого скота применяли и другие методы, включая обследование доноров, а также карантин и обследование реципиентов.³⁸ Обследование доноров на наличие заболевания во время сбора эмбрионов, а затем повторно через несколько недель или месяцев (пока эмбрионы хранятся в криоконсервированном состоянии) позволяет подтвердить, что доноры не являются возможным источником возбудителя. Обследование реципиентов после переноса эмбрионов и потомства после рождения служит биопробой: реципиенты и потомство выступают в роли животных-индикаторов. Однако для этого требуется длительный карантин животных. Кроме того, эти методы дорогостоящи и требуют проведения нескольких анализов, если необходимо выявить более одного заболевания, а также убедиться, что во время карантина не произошло случайного заражения. Поэтому с экономической точки зрения обработка эмбрионов является предпочтительным методом подтверждения их благополучия в отношении инфекций. Этот метод значительно облегчил международную торговлю эмбрионами благодаря преимуществам с точки зрения благополучия животных, борьбы с болезнями и экономики.³⁸

Категоризация возбудителей заболеваний, связанных с эмбрионами

Чтобы ещё больше облегчить международную торговлю эмбрионами, OIE при содействии подкомитета IETS по исследованиям в области охраны здоровья и безопасности составляет оценку, или категоризацию, известного риска передачи конкретного заболевания при переносе эмбрионов и ежегодно её обновляет.^22,23 Официальная категоризация заболеваний, связанных с эмбрионами, подробнее изложена в главе 1.4.7.14 Кодекса здоровья наземных животных в разделе «Категоризация болезней и патогенных агентов».²² Болезни категории 1 определены и перечислены в таблице 80.1.

В Кодексе здоровья наземных животных 1.4.7.14 указано, что к категории 2 относятся болезни, для которых накоплены убедительные данные о пренебрежимо малом риске передачи при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом согласно Руководству IETS, но для подтверждения имеющихся данных требуются дополнительные переносы эмбрионов.²² К категории 2 относятся следующие болезни: блютанг (овцы), артрит-энцефалит коз и классическая чума свиней. К категории 3 относятся болезни или патогенные агенты, для которых предварительные данные указывают на пренебрежимо малый риск передачи при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом согласно Руководству IETS, но для подтверждения предварительных результатов необходимы дополнительные данные экспериментов in vitro и in vivo.²² К категории 3 относятся следующие болезни или патогенные агенты: вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (козы), BVDV (крупный рогатый скот), Campylobacter fetus (овцы), ящур (свиньи, овцы и козы), Haemophilus somnus (крупный рогатый скот), маэди-висна

Таблица 80.1 Болезни или патогенные агенты категории 1, для которых имеется достаточно исследований, показывающих, что риск передачи при переносе эмбрионов, полученных in vivo, пренебрежимо мал при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом.

Источник : глава 4.7.14 Кодекса здоровья наземных животных (http://www.oie.int/index. php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_1.4.7.htm).

(овцы), Mycobacterium paratuberculosis (крупный рогатый скот), Neospora caninum (крупный рогатый скот), легочный аденоматоз овец, репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS), чума крупного рогатого скота (ликвидирована) и везикулярная болезнь свиней.²² К категории 4 согласно Кодексу здоровья наземных животных 1.4.7.14 относятся болезни и патогенные агенты, в отношении которых проведены или проводятся исследования, пока не позволяющие сделать вывод об уровне риска передачи, либо указывающие на то, что риск передачи при пересадке эмбрионов может быть существенным, даже если в период между получением и пересадкой с эмбрионами обращаются надлежащим образом в соответствии с руководством IETS.²² К категории 4 относятся следующие болезни и патогенные агенты: африканская чума свиней, болезнь Акабане (крупный рогатый скот), анаплазмоз крупного рогатого скота, катаральная лихорадка овец (козы), пограничная болезнь (овцы), BHV-4, Chlamydia psittaci (крупный рогатый скот, овцы), контагиозный метрит лошадей, энтеровирус (крупный рогатый скот, свиньи), ринопневмония лошадей, вирусный артериит лошадей, Escherichia coli 09:K99 (крупный рогатый скот), Leptospira borgpetersenii серовар Hardjobovis (крупный рогатый скот), Leptospira sp. (свиньи), нодулярный дерматит крупного рогатого скота, Mycobacterium bovis (крупный рогатый скот), Mycoplasma spp. (свиньи), эпидидимит овец ( Brucella ovis ), вирус парагриппа-3 (крупный рогатый скот), парвовирус (свиньи), цирковирус свиней (тип 2) (свиньи), скрепи (козы), Tritrichomonas foetus (крупный рогатый скот), Ureaplasma и Mycoplasma spp. (крупный рогатый скот, козы), а также везикулярный стоматит (крупный рогатый скот, свиньи).²²

Борьба с вирусными патогенами

Ограниченный объём главы не позволяет обсудить каждую болезнь из всех четырёх категорий. Поэтому далее в этой главе основное внимание будет уделено BVDV. Этот вирус имеет огромное значение из-за колоссального экономического ущерба, который он наносит мясному и молочному скотоводству: он снижает продуктивность вследствие ухудшения эффективности использования корма и сокращения выработки молока, а также вызывает гибель эмбрионов на ранних стадиях развития, аборты, мумификацию плодов, аномалии развития плодов, пневмонию и различные другие заболевания, ослабляющие животных.^28,40–47 Экономический ущерб от BVDV оценивался в исследовании Houe,⁴¹ согласно которому потери скотоводческой отрасли от BVDV составляли

20–57 миллионов долларов на миллион отёлов. Недавно Hessman и соавт.⁴² исследовали экономические последствия, а также здоровье и продуктивность поголовья крупного рогатого скота после контакта с персистентно инфицированными (PI) животными. Они сообщили, что среди животных, непосредственно контактировавших с PI-животным, экономические потери вследствие гибели составляли 5.26 долларов на животное, а потери из-за снижения продуктивности были значительно выше — 88.26 долларов на животное. Кроме того, ввиду значительного экономического ущерба от инфекций, вызываемых BVDV, ряд стран, в том числе Дания, Финляндия, Норвегия, Швеция, Шетландские острова и Словения, разработали программы ликвидации этой инфекции.^28,48–52 В нескольких странах действуют программы борьбы с инфекцией и ведётся подготовка к внедрению программ её ликвидации. В других странах, например в США, установление стандартов борьбы с BVDV путём создания добровольных программ предоставлено отдельным штатам и, прежде всего, работающим в них животноводам. Борьбу с BVDV в США дополнительно осложняет присутствие вируса в популяции белохвостых оленей.^53,54 Поэтому большинство программ борьбы с инфекцией сосредоточено на надлежащих мерах биобезопасности, включая карантин, тестирование, выявление и удаление PI-животных, а также предотвращение появления новых PI-животных.

Пересадка эмбрионов как средство предотвращения передачи патогенов

Исторически пересадку эмбрионов применяли как способ свести к минимуму передачу болезней и одновременно максимально использовать генетический потенциал животных.^55,56 Однако после начала применения этого метода возникли вопросы о способности эмбрионов передавать патогены. Многочисленные исследования показали, что пересадка эмбрионов действительно позволяет предотвращать или сводить к минимуму передачу патогенов при условии надлежащего контроля качества и соблюдения соответствующих процедур обработки.^{8,38,39,55–61} Однако для некоторых микроорганизмов предотвращение передачи патогенов не было бесспорно доказано, а в отдельных случаях пересадка эмбрионов, вероятно, могла служить механизмом заноса болезни. Первоначальное отнесение BVDV к категории 3 основывалось на исследовании, проведённом более 20 лет назад.⁵⁶ Это исследование подтвердило эффективность промывания эмбрионов для удаления вируса после искусственного заражения эмбрионов цитопатогенным изолятом BVDV.⁵⁶ В ходе четырёх более поздних исследований после пересадки промытых или обработанных трипсином эмбрионов, полученных от PI-коров-доноров, в общей сложности родилось пять телят, свободных от BVDV.^57–60 Хотя данные этих четырёх публикаций были ограниченными, результаты обнадёживали. Однако сообщения Lindberg и соавт.⁶² и Drew и соавт.⁶³ побудили продолжить изучение возможности передачи BVDV при пересадке эмбрионов: в первом случае после пересадки эмбрионов у тёлок произошла сероконверсия, а во втором после пересадки эмбриона родился PI-телёнок. Предполагалось, что причиной этих инфекций стала загрязнённая сыворотка крови плодов крупного рогатого скота. Поэтому потребовались дополнительные исследования, чтобы установить, сохраняется ли BVDV на эмбрионах после стандартной обработки эмбрионов, полученных in vivo и проводимой по правилам IETS, и может ли связанный с эмбрионами вирус передаваться при их пересадке. Дальнейшие исследования показали, что разные штаммы BVDV различаются по степени сродства к эмбрионам.^64,65 Было показано, что некоторые штаммы сохраняли связь с эмбрионами после обработки по процедурам IETS

в том числе при добавлении к этим процедурам обработки трипсином.^64,65 Эти штаммы с высоким сродством стали вызывать ещё большее беспокойство, когда было установлено, что связанный с эмбрионами вирус действительно заразен как в исследованиях in vitro, так и в исследованиях in vivo.^65,66 В недавнем исследовании Gard и соавт.⁶⁷ сообщили, что у 27% эмбрионов, полученных in vivo, и у 42% эмбрионов, полученных in vitro, после искусственного воздействия штамма BVDV с высоким сродством (SD-1, тип 1a) и промывания в соответствии с процедурами IETS (без трипсина) обнаруживался связанный с эмбрионами вирус (EAV). Было также установлено, что количество EAV составляло от 100 до 450 CCID50 (инфицирующих доз для клеточной культуры при конечной точке 50%) на эмбрион.⁶⁷ В предыдущих исследованиях также было установлено, что EAV сохраняет инфекционность в системе культивирования in vitro и в модели in vivo при внутривенном введении эмбрионов реципиентам, у которых не обнаруживались вирус и антитела к нему.^64,66,67 Недавно было проведено дополнительное исследование, в котором использовали удвоенное количество EAV по сравнению с ранее выявленным у отдельных эмбрионов, полученных in vivo и in vitro, после процедур обработки.⁶⁸ Затем это количество удвоили (878 CCID50 на соломинку), чтобы воспроизвести практику, иногда применяемую при пересадке эмбрионов, а именно одновременную пересадку двух эмбрионов одному реципиенту, и учесть наихудший сценарий. Было установлено, что у всех реципиентов, получивших эмбрионы и вирус, развилась виремия, а затем произошла сероконверсия. На 30-й день после пересадки было выявлено шесть случаев беременности, а на 60-й день — только один. Однако все беременности прервались. При беременности на сроке 60 дней плод извлекли посредством кольпотомии и исследовали на BVDV. Секвенирование показало, что выявленный штамм BVDV — SD-1, то есть тот же штамм, которым проводили заражение.⁶⁸ Отсутствие в этом исследовании потомства, положительного по BVDV, согласуется с результатами Bielanski и соавт.⁶⁹ В их исследовании эмбрионы, полученные in vitro, подвергали воздействию нецитопатических биотипов BVDV в течение 1 часа: штамма типа 2 (P-131) или штамма типа 1 (NY-1). Затем эмбрионы промывали в соответствии с рекомендациями IETS (без обработки трипсином) и пересаживали серонегативным и BVDV-отрицательным реципиентам. После внутриматочной пересадки эмбрионов сероконверсии не произошло ни у одного из реципиентов, получивших эмбрионы, подвергнутые воздействию штамма типа 1. Однако из 35 реципиентов, получивших эмбрионы, подвергнутые воздействию штамма типа 2, сероконверсия произошла у 18 (51%); на 30-й день после пересадки было выявлено 11 случаев беременности, но лишь в двух случаях родилось живое потомство. У обоих родившихся животных не обнаружили ни BVDV, ни антител к нему.⁶⁹ Таким образом, по-видимому, иммунная система плода не распознала инфекцию и/или вирус был уничтожен до формирования иммунной компетентности, поэтому антитела у плода не выработались. Отсутствие выявляемой сероконверсии при воздействии штамма типа 1 и аборты, вызванные BVDV типа 2, могут быть следствием мутаций вируса. В исследовании Meyers и соавт. ,⁷⁰ при введении беременным коровам двух различных мутантных штаммов вируса не наблюдались снижение выработки интерферона, аборты или присутствие вируса в тканях плодов. Каждый из этих мутантных штаммов имел мутации, затрагивавшие N-концевую протеазу (N(pro)), а также делецию кодона 349, которая устраняет РНКазную активность структурного гликопротеина E(rns). Однако при заражении вирусами дикого типа и вирусами, имевшими только одну из мутаций — в N(pro) либо в E(rns), — наблюдались снижение выработки интерферона, аборты и присутствие вируса в тканях плодов.⁷⁰ Следовательно, для формирования персистирующей инфекции необходимы как N(pro), так и E(rns). Логично предположить, что