Воспроизводство крупного рогатого скота

штамм типа 1, использованный в исследовании Bielanski, мог иметь мутации в этих участках, благодаря чему выработка интерферона была достаточной и заражения плода не произошло. Разные штаммы могут по-разному влиять на выработку интерферона и, следовательно, могут вызывать или не вызывать заражение плода, причём такое заражение может быть смертельным для плода, а может и не быть.

С учётом результатов этих исследований и разнообразия штаммов BVDV нельзя исключать появления животного с персистирующей инфекцией (PI) вследствие пересадки заражённого эмбриона. Результаты исследований Gard и Bielanski показывают, что некоторые изоляты с высоким сродством могут вызывать виремию и сероконверсию у восприимчивых реципиентов с последующей гибелью эмбрионов на ранней стадии и абортами.^68,69 Однако, судя по результатам этих недавних исследований, появление животного с PI после пересадки заражённых эмбрионов, по-видимому, с большей вероятностью связано с виремией у реципиента (острым заражением) и выделением вируса, заражающего других беременных животных, чем с самой пересадкой заражённого эмбриона. Тем не менее необходимо провести дополнительные исследования с использованием эмбрионов, естественным образом заражённых различными штаммами BVDV и пересаженных в матку, чтобы установить способность BVDV передаваться внутриутробно и оценить вероятность рождения телёнка с PI. Тщательная оценка важна, поскольку возможность передачи BVDV через эмбрион потребовала бы пересмотра процедур подтверждения здоровья эмбрионов, а также введения дополнительных правил в отношении эмбрионов, экспортируемых из стран, где присутствует BVDV, в страны, где этот вирус искоренён.

Второе поколение технологий получения эмбрионов

Получение эмбрионов in vitro называют вторым поколением технологий получения эмбрионов; большинство основных элементов этого процесса для крупного рогатого скота были разработаны и усовершенствованы за последние 35 лет.^28,39,71 Основные процедуры, используемые в настоящее время при получении эмбрионов in vitro, включают получение ооцитов путём трансвагинальной аспирации фолликулов, созревание ооцитов in vitro (IVM), капацитацию сперматозоидов in vitro, оплодотворение in vitro (IVF), культивирование эмбрионов in vitro (IVC) до стадии бластоцисты и пересадку эмбриона реципиенту.⁷² Эта технология предполагает множество изменений условий разведения животных и создаёт возможности для проникновения, размножения и распространения патогенов. Поэтому существует ряд возможных источников патогенов при получении эмбрионов in vitro. К ним относятся гаметы и связанные с ними жидкости, соматические клетки, используемые при IVM, IVF или IVC, а также материалы животного происхождения, добавляемые в среды для созревания, оплодотворения или культивирования (например, g, сыворотка крови плодов крупного рогатого скота, бычий сывороточный альбумин или фолликулостимулирующий гормон).²⁶

Исследования на наличие загрязняющих агентов в лабораториях по получению эмбрионов in vitro проводились в ряде стран, в том числе в Канаде,^73,74 Дании,⁷⁵ Франции^7,76 и США.^71,77,78Как и ожидалось, при использовании материалов, полученных на бойне, в системах получения эмбрионов уровень бактериального загрязнения может быть довольно высоким: от 13 до 68% образцовin vitro.⁷¹Кроме того, в материалах, полученных на бойне, обнаруживали BVDV и BHV-1 в небольшом или умеренном количестве: положительный результат на BVDV давали 1–12% образцов, а на BHV-1 — 0–12% образцов.^71,78

Поскольку BVDV широко распространён среди крупного рогатого скота и, как известно, поражает репродуктивные ткани, исследователи уделяют ему больше всего внимания.⁷⁷Было показано, что все материалы животного происхождения, используемые при получении эмбрионов крупного рогатого скота методом ЭКО (продукты животного происхождения, яичники, ооциты, фолликулярная жидкость, клетки кумулюса, клетки маточных труб и сыворотка), содержат BVDV, если их получают от животных с активной инфекцией.^77,79Опасность усугубляется тем, что у части животных, инфицированных BVDV, симптомы отсутствуют.^41,80У крупного рогатого скота с персистирующей инфекцией BVDV симптомы часто отсутствуют; такие животные служат резервуаром большого количества вируса.⁴¹Кроме того, большинство полевых изолятов BVDV не обладают цитопатическим действием и могут вызывать незаметную персистирующую инфекцию в устойчивых лабораторных клеточных линиях,^31,79которые используют для совместного культивирования с эмбрионами.^31,79Наконец, следует отметить, что условия культивирования на каждом этапе получения эмбрионов методом ЭКО идеально подходят для размножения BVDV: вирусу доступны достаточное время, питательная среда и восприимчивые клетки. Поэтому даже низкий уровень загрязнения может привести к значительному размножению вируса, в результате чего к концу культивирования in vitro эмбрионы подвергаются воздействию высокой концентрации вируса.

Как и в случае эмбрионов, полученных in vivo, первоначально предполагалось, что прозрачная оболочка эмбрионов, полученных методом ЭКО, защитит развивающийся зародыш от инфекций. Исследования с искусственным заражением действительно показали, что неповреждённая прозрачная оболочка служит эффективным барьером, через который возбудители проникают редко.⁸¹Тем не менее ясно, что процедуры обработки, рекомендованные для эмбрионов, полученных in vivo, менее эффективны для эмбрионов, полученных методом ЭКО, поскольку было показано, что ряд возбудителей (например, g BTV, BHV-1, вирус ящура и BVDV) легче прикрепляется к прозрачной оболочке таких эмбрионов.^77,78Кроме того, было показано, что присутствие вируса снижает частоту созревания, оплодотворения и развития эмбрионов.^77,82–85

Исследования показали, что BVDV остаётся связанным с эмбрионами, полученными in vitro, после воздействия вируса и последующего промывания или обработки трипсином.^86,87Однако заражение восприимчивых реципиентов после переноса подвергшихся воздействию вируса эмбрионов продемонстрировано не было. Кроме того, при попытках установить, составляет ли количество BVDV, связанного с отдельными эмбрионами, инфекционную дозу in utero .^88,89были получены некоторые интересные результаты. Совокупные результаты исследований риска передачи BVDV при переносе эмбрионов, полученных in vitro, несколько противоречивы. С одной стороны, ясно, что несколько штаммов BVDV остаются связанными с эмбрионами, полученными методом ЭКО, после промывания или обработки трипсином.^88–90С другой стороны, по-видимому, существуют естественные факторы, препятствующие передаче связанного с эмбрионами вируса восприимчивым клеткам in vitro .^88–90. Очевидно, что для разрешения этих вопросов необходимы дальнейшие исследования.

Официальные рекомендации по международной перевозкеin vitro — эмбрионов, полученных этим методом, для предотвращения распространения болезней изложены в главе 4.8 Кодекса здоровья наземных животных МЭБ.⁹¹ Препятствиями для введения общепризнанных санитарных мер при получении эмбрионов крупного рогатого скота методом ЭКО являются различия в методиках разных лабораторий, сравнительная лёгкость, с которой возбудители прикрепляются к прозрачной оболочке, а также то, что исходный материал часто получают на бойнях.⁹² Очевидно, что механическая промывка и обработка трипсином эмбрионов, полученных методом ЭКО,^86,87 не обеспечивают такой же

эффективности, как при очистке эмбрионов, полученных in vivo. Однако показано, что эти процедуры существенно снижают степень контаминации эмбрионов, полученных методом ЭКО, после их искусственного воздействия такими возбудителями, как BHV-1 и BVDV.^86,87,93 Таким образом, как и в случае с эмбрионами, полученными in vivo, для завершения оценки риска необходимы дальнейшие исследования. В частности, требуется всесторонне оценить, достаточно ли количества BVDV, связанного с эмбрионами, для заражения реципиентов и/или их плодов после переноса эмбрионов в матку. Очевидно, что штамм вируса оказывает огромное влияние на его сродство к эмбрионам, поэтому при оценке фактического риска его необходимо учитывать.⁶⁵

Третье поколение эмбриональных технологий

К третьему поколению эмбриональных технологий относятся клонирование, в частности перенос ядра соматической клетки, и трансгенные технологии. Эти технологии включают созревание и удаление ядер из ооцитов, введение ядер соматических клеток, активацию, культивирование in vitro, при необходимости криоконсервацию и нехирургический перенос. Для третьего поколения эмбриональных технологий характерны те же риски, что и для второго, с несколькими дополнительными оговорками. Они связаны с тем, что прозрачную оболочку разрушают либо удаляют, а донорские ядра получают из дополнительных клеточных линий. Используемые клеточные линии часто культивируют в течение 8–12 недель для увеличения числа клеток. Кроме того, процедуры размножения клеток могут способствовать репликации нецитопатогенного BVDV и заражению им этих клеточных линий вследствие использования материалов животного происхождения, таких как ооциты, полученные на бойнях, и сыворотка крови плодов крупного рогатого скота, при получении и культивировании эмбрионов.

Присутствие нецитопатогенного BVDV может проявляться низкой эффективностью клонирования и нарушениями развития, низкой частотой наступления беременности, ранней гибелью эмбрионов, потерей плодов и аномалиями у новорождённых. Пример проблем, которые могут быть связаны с контаминацией BVDV в системах клонирования, подробно описан в работе Shin и соавт.⁹⁴ В этой работе сообщается о высокой частоте нарушений развития плодов крупного рогатого скота, полученных путём клонирования с использованием клеток, инфицированных BVDV. В частности, линия фибробластов плода была непреднамеренно инфицирована нецитопатогенным штаммом BVDV. В результате при использовании этой клеточной линии наблюдались чрезвычайно высокая гибель эмбрионов и резорбция плодов.⁹⁴ В другом исследовании Stringfellow и соавт. ,⁹⁵ при анализе образцов, направленных в ветеринарные диагностические лаборатории, установили, что 15 из 39 линий фибробластов плода, использовавшихся в исследованиях по клонированию, дали положительный результат на BVDV по данным различных анализов, включая полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Однако было установлено, что фактически BVDV были инфицированы только 5 из 39 клеточных линий. Кроме того, было установлено, что три из этих пяти линий не были инфицированы на самом раннем криоконсервированном пассаже. Это позволило заключить, что клеточные линии заразились после культивирования в средах, содержавших контаминированную сыворотку крови плодов крупного рогатого скота. Сравнение последовательностей амплифицированной кДНК из одной партии такой сыворотки подтвердило, что она была источником инфекции для одной из этих клеточных линий.⁹⁵ Поскольку BVDV был выделен из двух оставшихся клеточных линий уже на самом раннем доступном пассаже, нельзя было исключить, что источником вируса являлись плоды, из которых эти линии были

получены. Эти исследования подчёркивают дополнительные проблемы, связанные с клонированием и трансгенными технологиями, а также более высокий риск получения контаминированных эмбрионов при использовании этих методов. Поэтому исключительно важен строгий контроль качества для предотвращения заражения эмбрионов патогенами и передачи патогенов реципиентам при переносе эмбрионов. Это имеет большое значение для всех поколений эмбриональных технологий, причём с каждым последующим поколением потребность в таком контроле возрастает.

Применение эмбриональных технологий продолжает расширяться и у других видов, включая свиней, коз, овец, лошадей, а также диких животных. Как и у крупного рогатого скота, существуют различные возбудители, вызывающие опасения и способные приводить к гибели эмбрионов и плодов. В обзоре Givens и Marley⁹⁶ обобщены сведения о бактериальных, грибковых, протозойных и вирусных причинах нарушений репродуктивного развития у крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, собак и кошек. Эта работа показывает, насколько важно при применении эмбриональных технологий разумно использовать вакцинацию и меры биобезопасности, чтобы свести к минимуму репродуктивные потери.

Экспериментальные методы обработки

Добавление антибиотиков и противогрибковых препаратов в среды значительно уменьшает проблемы, связанные с бактериями и грибами при культивировании. Однако вирусная контаминация представляет собой более сложную угрозу. В ряде недавних исследований изучалось добавление противовирусных веществ, таких как интерферон-тау, который, согласно опубликованным данным, снижает количество BVDV в культуре, но не BHV-1.⁹⁷ Кроме того, показано, что другие противовирусные соединения, такие как 2-(4-[2-имидазолинил]фенил)-5-(4-метоксифенил)фуран (DB606), подавляют репликацию BVDV в эпителиальных клетках маточных труб крупного рогатого скота, клетках почки крупного рогатого скота линии Madin Darby и фибробластах плода, не оказывая отрицательного влияния ни на развитие эмбрионов, ни на последующую плодовитость тёлок, полученных из эмбрионов после ЭКО, обработанных DB606.^98,99 В более позднем исследовании Newcomer и соавт.¹⁰⁰оценили спектр противовирусной активности другого сходного соединения — дигидрохлорида 2-(2-бензимидазолил)-5-[4-(2-имидазолино)фенил]фурана (DB772) — в отношении различных пестивирусов. Изоляты BVDV 2, вируса пограничной болезни, вируса HoBi, вируса вилорогой антилопы и вируса Bungowannah проверяли на чувствительность in vitro к DB772, инкубируя инфицированные клетки в среде с различными концентрациями DB772. Было установлено, что DB772 эффективно подавляет все изученные пестивирусы при концентрациях выше 0.20 мкmol/L, при этом признаков цитотоксичности не наблюдалось.¹⁰⁰Эти соединения, DB606 и DB772, наряду с интерфероном-тау потенциально способны снижать присутствие вирусных патогенов, в частности пестивирусов, в культуре. Это может позволить использовать их при культивировании эмбрионов и размножении линий фибробластов для клонирования и получения трансгенных животных.^99–101

Заключение

Необходимо продолжать оценку этих новых подходов и их внедрение в системы культивирования для предотвращения заражения эмбрионов патогенами. Вполне возможно, что в будущем эти соединения станут основой надёжного метода ограничения распространения инфекционных вирусов, связанных с эмбрионами. Однако

надлежащая биобезопасность и контроль качества всегда играют первостепенную роль в предотвращении заражения эмбрионов патогенами и должны быть в центре внимания стандартных операционных процедур при использовании технологий работы с эмбрионами любого поколения.

Список литературы

1. Smith RD. Определения. В кн.: Smith RD (ред.) Клиническая эпидемиология в ветеринарии, 3-е изд. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press, 2005, с. 10–12.

2. Thibier M, Stringfellow D. Консультативный комитет по здоровью и безопасности (HASAC) Международного общества трансплантации эмбрионов (IETS) на протяжении двух десятилетий успешно решал важнейшие задачи. Theriogenology 2003;59:1067–1078.

3. Stroud B. Ежегодный отчёт Комитета IETS по сбору данных. Embryo Transfer Newsletter, декабрь 2012, с. 16–26. http:// www.iets.org/pdf/Newsletter/Dec12_IETS_Newsletter.pdf

4. Thibier M. Ежегодный отчёт Комитета IETS по сбору данных. Embryo Transfer Newsletter, декабрь 2010, с. 11–21. http:// www.iets.org (доступ к архиву бюллетеня ограничен членами IETS).

5. Betteridge K. Размышления по случаю пятидесятой годовщины первой трансплантации эмбриона, в результате которой родился телёнок. Theriogenology 2000;53:3–10.

6. Mapletoft R. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. В кн.: Morrow DA (ред.) Современные методы лечения в териогенологии, 2-е изд. Филадельфия: Saunders, 1986, с. 54.

7. Guerin B, Nibart M, Marquant-Le Guienne B, Humblot P. Санитарные риски, связанные с трансплантацией эмбрионов. Theriogenology 1997;47:33–42.

8. Wrathall A, Brown K, Sayers A и др. Исследования трансплантации эмбрионов от крупного рогатого скота с клиническими признаками губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE). Vet Rec 2000;150:365–378.

9. Stringfellow D, Givens M. Эпидемиологические вопросы, связанные с получением эмбрионов сельскохозяйственных животных in vivo и in vitro. Anim Reprod Sci 2000;60–61:629–642.

10. Bielanski A, Hare W. Методы планирования и анализа исследований передачи инфекционных болезней при трансплантации эмбрионов. В кн.: Stringfellow DA, Seidel SM (ред.) Руководство Международного общества трансплантации эмбрионов, 3-е изд. Савой, Иллинойс: Международное общество трансплантации эмбрионов, 1998, с. 143–149.

11. Backx A, Heutink R, Van Rooij E, Van Rijn P. Трансплацентарная и пероральная передача вируса блютанга дикого типа серотипа 8 у крупного рогатого скота после экспериментального заражения. Vet Microbiol 2009;138:235–243.

12. Jimmeénze-Clavero M, Aguero M, san Miguel E и др. Высокопроизводительное выявление вируса блютанга с помощью новой флуорогенной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени: применение к клиническим образцам из районов текущих вспышек в Средиземноморье. J Vet Diagn Invest 2006;18:7–17.

13. Wrathall A, Simmons H, Van Soom A. Оценка рисков передачи вирусов реципиентам эмбрионов крупного рогатого скота при оплодотворении спермой, заражённой вирусами. Theriogenology 2006; 65:247–274.

14. Kirschvink N, Raes M, Saegerman C. Влияние естественного заражения вирусом блютанга серотипа 8 на качество спермы бельгийских баранов в 2007 году. Vet J 2009;182:244–251.

15. DeClercq K, De Leeuw I, Verheyden B и др. Трансплацентарное заражение и, по-видимому, развитие иммунологической толерантности вследствие естественного заражения вирусом блютанга дикого типа серотипа 8. Transbound Emerg Dis 2008;55:352–359.

16. Maclachalan M, Drew C, Darpei K, Worwa G. Патология и патогенез блютанга. J Comp Pathol 2009;141:1–16.

17. Menzies F, McCullough S, McKeown I и др. Доказательства трансплацентарной и контактной передачи блютанга у крупного рогатого скота. Vet Rec 2008;163:203–209.

18. Mintiens K, Meroc E, Mellor P и др. Возможные пути заноса вируса блютанга серотипа 8 в эпицентр эпидемии 2008 года в Северо-Западной Европе. Prev Vet Med 2008;87:131–144.

19. Hare W. Состояние исследований передачи болезней и их значение для международного перемещения эмбрионов крупного рогатого скота. Can Vet J 1985;27:37–45.

20. Singh E. Возможности использования эмбрионов для борьбы с болезнями. Theriogenology 1987;27:9–20.

21. Stringfellow D. Рекомендации по санитарной обработке эмбрионов, полученных in vivo. В кн.: Stringfellow DA, Seidel SM (ред.) Руководство Международного общества трансплантации эмбрионов , 3-е изд. Савой, Иллинойс: Международное общество трансплантации эмбрионов, 1998, с. 79–84.

22. Аноним. Кодекс здоровья наземных животных 4.7.14. Всемирная организация здравоохранения животных (OIE), Париж, 2013. http://www. oie.int/index.php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_1.4.7.htm.

23. Thibier M. Трансплантация эмбрионов: сравнительное преимущество в обеспечении биобезопасности при международном перемещении генетического материала. Rev Sci Tech 2011;30:177–188.

24. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединённых Наций (FAO). Учебное руководство по трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота . http: //www.fao.org/docrep/004/T0117E/T0117E14.htm.

25. Mapletoft R. Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота. В кн.: Morrow DA (ред.) Современные методы лечения в териогенологии , 2-е изд. Филадельфия: Saunders, 1986, с. 59, 60.

26. Brock K, Grooms D, Ridpath J, Bolin S. Изменения уровня виремии у крупного рогатого скота, персистентно инфицированного вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота. J Vet Diagn Invest 1998;10:22–26.

27. Stringfellow D. Использование материалов животного происхождения в программах получения эмбрионов: по-прежнему рекомендуется соблюдать осторожность. Embryo Transfer Newsletter 2002;20:11.

28. Gard J, Givens M, Stringfellow D. Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV): эпидемиологические вопросы, связанные со спермой и эмбрионами. Theriogenology 2007;68:434–442.

29. Cohn E, Strong L, Hughes W мл. и др. Препараты и свойства белков сыворотки и плазмы. IV. Система разделения белковых и липопротеиновых компонентов биологических тканей и жидкостей на фракции. J Am Chem Soc 1946;68:459–475.

30. Schiewe M. Общие правила гигиены и контроля качества в лаборатории по получению эмбрионов. В кн.: Stringfellow DA, Seidel SM (ред.) Руководство Международного общества трансплантации эмбрионов , 3-е изд. Савой, Иллинойс: Международное общество трансплантации эмбрионов, 1998, с. 93–102.

31. Rossi C, Bridgman R, Kiesel G. Вирусная контаминация культур клеток лёгких плодов крупного рогатого скота и фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Am J Vet Res 1980;41:1680–1681.

32. Bolin S, Ridpath J. Распространённость генотипов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота и антител к ним в фетальной сыворотке крупного рогатого скота. J Vet Diagn Invest 1998;10:135–139.

33. Nettleton P, Vilcek S. Обнаружение пестивирусов в сыворотке крупного рогатого скота. В сб.: Материалы международного семинара, организованного EDQM, Париж , 2001, с. 69–75.

34. Sweeney R, Whitlock R, Rosenberger A. Mycobacterium paratuberculosis выделена из плодов инфицированных коров без признаков заболевания. Am J Vet Res 1992;53:477–480.

35. Whittington R, Windsor P. Внутриутробное инфицирование крупного рогатого скота Mycobacterium avium подвида paratuberculosis : критический обзор и метаанализ. Vet J 2009;179:60–69.

36. Fray M, Prenctice H, Clarke M, Charleston B. Иммуногистохимические доказательства локализации вируса вирусной диареи крупного рогатого скота — одноцепочечного РНК-вируса — в ооцитах яичников коровы. Vet Pathol 1998;35:253–259.

37. Аноним. Глава 4.7.5 Кодекса здоровья наземных животных, раздел «Управление рисками». www.oie.int.

38. Stringfellow D. Возможности трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота для борьбы с инфекционными заболеваниями. Rev Sci Tech Off Int Epiz 1985; 4:859–866.

39. Stringfellow D, Riddell K, Zurovac O. Возможности трансплантации эмбрионов для борьбы с инфекционными заболеваниями сельскохозяйственных животных. NZ Vet J 1991;39:8–17.

40. Baker J. Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота: обзор. J Am Vet Med Assoc 1987;190:1449–1458.