Воспроизводство крупного рогатого скота

Таблица 81.1 Области применения технологии IVF.

(b)

(a)

Рисунок 81.1 (а) Ультразвуковой датчик с иглой для аспирации ооцитов, выступающей из направителя иглы. (б) Схема расположения ультразвукового датчика, прижатого к своду влагалища; положение яичника регулируют рукой через прямую кишку и удерживают его у стенки влагалища. Воспроизведено с разрешения Хаслера.¹¹

Количество ооцитов, получаемых за один сеанс OPU, можно увеличить предварительным введением донору гонадотропинов.^18,19В весьма обстоятельном исследовании, в котором сравнивались различные интервалы между процедурами OPU с применением фолликулостимулирующего гормона (FSH) и без него, Chaubal и соавт.²⁰ сообщили, что наиболее продуктивный протокол по выходу ооцитов и эмбрионов включал удаление доминантного фолликула, введение FSH через 36 часов и проведение OPU через 48 часов после введения FSH. Эту схему чередовали по неделям с однократным проведением OPU без стимуляции. При еженедельном проведении OPU с применением FSH получали в среднем 10.6 ооцитов и 2.4 бластоцист, а при чередовавшемся с ним еженедельном проведении OPU без FSH — в среднем 4.6 ооцитов и 0.9 бластоцист. Взаимодействие факторов, в том числе частоты проведения OPU и применения либо отсутствия стимуляции FSH, недавно было рассмотрено в обзорной работе.²¹

Порода крупного рогатого скота также имеет большое значение. Низкое среднее количество пригодных к использованию ооцитов — от 4.1 до 5.3 — отмечали Hasler и соавт.²² и Looney и соавт.²³ в смешанных группах животных молочных и мясных пород, включавших коров старшего возраста с различными нарушениями фертильности. Применение FSH с последующим периодом без гормональной стимуляции сейчас успешно практикуется несколькими коммерческими предприятиями Северной Америки, занимающимися получением эмбрионов крупного рогатого скота in vitro; это позволяет получать в среднем около 20 ооцитов у животных Bos taurus раз в 2 недель (данные предоставлены Trans Ova Genetics). В Южной Америке (преимущественно в Бразилии) у скота породы нелоре обычно получают 17–25 ооцитов без предварительной стимуляции FSH. Нелоре — местная порода брахманского происхождения, у которой в ходе каждой фолликулярной волны, как известно, развивается больше фолликулов, чем у самок Bos indicus (данные предоставлены In Vitro Brazil).

Возраст донора также может влиять на количество ооцитов, получаемых за одну процедуру OPU. Данные по коровам голштинской породы свидетельствуют о том, что

у коров в возрасте 6–9 лет можно получать значительно больше ооцитов, чем у коров в возрасте 14–18 лет.¹⁶ Однако в основном это были животные, которым проводили OPU/IVP из-за ранее возникших нарушений фертильности. Недавно полученные неопубликованные данные крупного коммерческого in vitro в программе с участием доноров со здоровой репродуктивной системой показала, что число полученных ооцитов мало менялось до возраста 13 лет, а затем неуклонно снижалось с 14 до 18 лет (данные предоставлены Trans Ova Genetics). Примечательно, что в этой программе потенциал развития ооцитов был сходным во всех возрастных группах доноров.

Число ооцитов, получаемых от разных доноров за определённый период, значительно варьирует. Например, от 8-летней коровы голштинской породы, ранее признанной бесплодной, за 167 недель при 167 сборах ооцитов получили в общей сложности 176 эмбрионов от 23 разных быков-производителей.¹⁶ При повторных сборах методом OPU среднее число ооцитов снижалось, однако потенциал развития ооцитов, полученных методом OPU, не менялся. Это наглядно демонстрирует возможность получения большого числа эмбрионов методами OPU–IVP, а также преимущество, заключающееся в возможности использовать разных быков-производителей каждую неделю или даже раз в две недели.

Сбор ооцитов из удалённых яичников

Помимо получения ооцитов у крупного рогатого скота методом OPU, существует несколько ситуаций, в которых ооциты извлекают из удалённых яичников. При развитии у коров смертельных заболеваний или тяжёлой хромоты яичники можно удалить посредством боковой

лапаротомии или через разрез влагалища, а ооциты извлечь путём аспирации содержимого фолликулов или разрезания яичников. Stringfellow и соавт.²⁴ сообщили, что при разрезании коркового слоя яичников от 18 выбракованных молочных коров получали в среднем 46 ооцитов. В рамках весьма успешной коммерческой программы Green и McGuirk²⁵ сообщили, что в более чем 100 случаях от коров с хроническими заболеваниями, травмами и старческими изменениями получали в среднем 46 ооцитов и девять эмбрионов на одного донора.

Сбор ооцитов из яичников, полученных на бойне

Крупным источником ооцитов служат яичники коров, забитых на бойнях. Содержимое всех фолликулов диаметром от 3 до 8 mm аспирируют, а собранные ооциты используют для получения эмбрионов методом IVP. В системе массового производства с использованием яичников, полученных на бойне, Lu и Polge²⁶ сообщили о получении более 200 000 бластоцист in vitro из приблизительно 700 000 ооцитов за 2 лет. Хотя эта программа уже не действует, она продемонстрировала возможность получения эмбрионов методом IVP после убоя крупного рогатого скота. Согласно сообщениям, из одной пары яичников иногда можно извлечь 100 и даже 200 ооцитов Bos taurus яичников.²⁶В Японии яичники отдельных коров Коби получают при убое и отправляют в лабораторию для получения эмбрионов in vitro. Позднее в тот же день по стоимости туш животных с установленными индивидуальными номерами определяют, какие ооциты сохранить и провести через все этапы процедуры получения эмбрионов in vitro. Помимо коммерческого применения, эмбрионы in vitro получают в университетах и лабораториях по всему миру как ценный материал для исследований репродукции крупного рогатого скота.²⁷

Питательные среды

После сбора ооциты последовательно культивируют в нескольких средах, обеспечивающих созревание in vitro (IVM), оплодотворение in vitro (IVF) и развитие in vitro. Как правило, для получения эмбрионов in vitro используют не менее шести различных сред. Большинство этих сред не выпускается промышленно, и их необходимо готовить в лаборатории, хотя некоторые коммерческие системы сред существуют. Все эти среды содержат общие компоненты, которые кратко рассмотрены ниже; затем описаны особенности сред, используемых на отдельных стадиях развития.

Вода

Чистая вода — основной по количеству компонент всех сред, используемых при любых процедурах работы с эмбрионами. Более того, качество воды можно считать важнейшим фактором, определяющим качество сред для эмбрионов. Вопросы о том, какую воду считать чистой и как лучше всего её получать, подробно рассмотрены в литературе.²⁸

Соли

Для приготовления практически всех сред, используемых при получении эмбрионов in vitro, применяют различные соли, в том числе хлорид натрия и фосфат калия. Эти компоненты, как и все химические вещества, используемые для приготовления сред, должны быть реактивами

соответствующей степени чистоты и по возможности иметь подтверждение того, что они «прошли испытания на эмбрионах мышей».

Источники энергии

В качестве источников энергии в состав сред часто включают глюкозу, фруктозу и/или пируват. Установлено, что на ранних стадиях развития эмбрионов крупного рогатого скота оптимальная концентрация глюкозы должна быть низкой — около 0.5 mmol/L. Однако после достижения стадии поздней морулы желательна более высокая концентрация глюкозы, и большинство сред для переноса эмбрионов содержат примерно 2.0 mmol/L глюкозы.

Макромолекулы

К макромолекулам относятся сыворотка, бычий сывороточный альбумин (BSA), гиалуроновая кислота и синтетические вещества, такие как поливиниловый спирт. Важнейшая причина включения макромолекул в среды для получения эмбрионов in vitro — их поверхностно-активные свойства, благодаря которым снижается вероятность того, что эмбрионы будут всплывать или прилипать к оборудованию, наконечникам пипеток, соломинкам и чашкам Петри. В частности, сыворотка содержит широкий спектр компонентов, полезных для развития эмбрионов, включая белки, факторы роста, витамины, минеральные вещества и энергетические субстраты; установлено, что сыворотка способствует развитию бластоцист.²⁹ Сыворотка и BSA также обеспечивают ряд физико-химических свойств среды, в том числе хелатирование, регуляцию коллоидно-осмотического давления и pH. К сожалению, добавление сыворотки при культивировании in vitro (IVC) связано с высокой частотой патологий беременности и развития потомства, часто называемых синдромом крупного потомства.^30–33

Поливиниловый спирт используют главным образом как поверхностно-активное вещество в средах для вымывания и хранения эмбрионов, состав которых не включает компонентов животного происхождения. Эти среды применялись при работе с сотнями тысяч коров-доноров и дали весьма удовлетворительные результаты, о чём свидетельствуют многочисленные повторные продажи и устные отзывы большого числа специалистов по переносу эмбрионов крупного рогатого скота и лошадей (неопубликованные данные предоставлены компанией Bioniche Animal Health, Inc.).

Гиалуроновая кислота (HA) — гликозаминогликан, присутствующий в фолликулярной жидкости, а также в жидкостях яйцеводов и матки.³⁴ Показано, что на поверхности эмбрионов имеются рецепторы к HA, которая участвует в регуляции экспрессии генов, пролиферации и дифференцировки клеток. Добавление HA в системы культивирования эмбрионов крупного рогатого скота улучшает развитие до стадии бластоцисты, повышает частоту выхода из прозрачной оболочки и устойчивость к криоконсервации.^35–38 Традиционным источником HA служат петушиные гребни, однако её также можно получать биосинтетическим путём при ферментации с участием Streptococcus equi без использования каких-либо продуктов животного происхождения.

Аминокислоты

Добавление всех 20 незаменимых и заменимых аминокислот в системы культивирования эмбрионов стало практически повсеместной практикой. Роль отдельных аминокислот, а также всех 20 аминокислот в совокупности в развитии эмбрионов и повышении их жизнеспособности рассмотрел Гарднер.³⁹ При отсутствии сыворотки в средах для культивирования добавление аминокислот отчасти заменяет её полезное действие.

Антиоксиданты

Антиоксиданты уменьшают образование в средах свободных радикалов, способных вызывать повреждения. В качестве антиоксидантов в средах для эмбрионов часто используют глутатион, BSA, аскорбиновую кислоту и каталазу.

Хелатирующие агенты

Хелатирующие агенты — это вещества, связывающие ионы тяжёлых металлов. В совершенно чистой среде они не требовались бы, однако всегда существует вероятность того, что следовые количества тяжёлых металлов попадут в состав среды с водой или солями реактивов. Трансферрин, BSA и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) действуют как хелатирующие агенты.

Осмолиты

Осмолиты — это органические соединения, которые участвуют в поддержании объёма клеток и внутриклеточных органелл, а также водного баланса. Когда клетки набухают под действием внешнего осмотического давления, в мембране открываются каналы, через которые осмолиты выходят из клетки, увлекая за собой воду и восстанавливая нормальный объём клетки. Глицин — осмолит и самая маленькая из так называемых заменимых аминокислот, которые обычно добавляют в культуральные среды и в некоторые составы сред для временного хранения и криоконсервации. Физиологические основы осмолитных свойств глицина при культивировании эмбрионов подробно описали Steeves и соавт. .⁴⁰

pH и буферные системы

Внутриклеточный pH (pHi) эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro, составляет 7.2 при измерении с помощью pH-чувствительного зонда.⁴¹ Это исследование также показало, что культивируемые эмбрионы крупного рогатого скота после воздействия кислой среды восстанавливались гораздо легче, чем после воздействия щелочной. В действительности при воздействии на эмбрионы среды с pH выше 8 значение pHi снижалось лишь приблизительно до 7.8. В классическом исследовании Kane⁴² показал, что наибольшая доля бластоцист кролика выходила из прозрачной оболочки в ходе IVC при pH в диапазоне 7.2–7.4; при pH ниже 7.0 или выше 7.8 эта доля резко снижалась. pH большинства сред для IVP крупного рогатого скота находится в диапазоне 7.3–7.4, за исключением сред для оплодотворения, у которых он обычно составляет 7.5–7.6.

Фосфатно-солевой буфер (PBS), широко применяемый при извлечении эмбрионов, полученных in vivo, содержит фосфат в качестве буферного компонента. Хотя фосфат не является особенно эффективным буфером, добавление сыворотки или BSA повышает буферную ёмкость PBS. Среды для IVP, напротив, обычно находятся в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% CO2. Бикарбонат в составе этих сред обеспечивает стабильный pH благодаря равновесию, устанавливающемуся между бикарбонатом и CO2. Однако после извлечения сред на основе этой системы из инкубатора pH быстро снижается и за несколько минут на воздухе достигает неприемлемого уровня кислотности. Поэтому среды, используемые для промывания яйцеклеток и зигот между этапами IVP, а также для их хранения на воздухе перед переносом или криоконсервацией, содержат цвиттерионные буферы MOPES или HEPES.

Осмолярность

Оптимальная осмолярность для поддержания жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота при получении эмбрионов in vitro составляет приблизительно 275 mmol/L. Это справедливо и для других видов, таких как кролик, крыса и свинья.⁴³На практике кратковременное воздействие среды с осмолярностью от 250 до 300 mmol/L не оказывает неблагоприятного влияния на эмбрионы крупного рогатого скота и, вероятно, лошадей. Исследования показали, что общая осмолярность от 250 до 270 mmol/L, по-видимому, оптимальна, когда эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vitro, культивируют в среде KSOM.⁴⁴

При регулировании осмолярности сред важно учитывать, какие вещества добавляют или содержание каких веществ уменьшают, чтобы повысить или понизить осмолярность. Наиболее распространённая соль во всех средах, используемых при процедурах ЭКО, — NaCl, однако было показано, что при концентрациях выше 95 mmol/L она отрицательно влияет на развитие эмбрионов крупного рогатого скота.⁴⁴Таким образом, положительный эффект осмолярности ниже 300 mmol/L, наблюдавшийся в большинстве исследований, вероятно, обусловлен снижением концентрации Na⁺, а не снижением осмолярности как таковой (осмолярность жидкости яйцевода составляет >300 mmol/L).

Созревание

Успех получения эмбрионов in vitro во многом зависит от качества исходного материала — ооцита. Микрофотографии свежеполученных ооцитов четырёх основных категорий представлены на рисунке 81.2. Потенциал ооцитов этих категорий к созреванию и развитию в эмбрионы существенно различается: от типа 1 с наибольшим потенциалом до типа 4, потенциал которого практически равен нулю.¹⁶В таблице 81.2 показана способность этих ооцитов к оплодотворению, развитию до стадии бластоцисты и наступлению беременности.

Ооцит, пригодный для получения эмбрионов in vitro, называют «созревшим». Созревание включает ряд процессов, которые начинаются во внутриутробном периоде с вступления в мейоз. К моменту рождения мейоз в ооцитах останавливается на стадии диплотены, хотя они продолжают расти. Мейотическая активность возобновляется лишь после полового созревания, когда ооциты подвергаются воздействию предовуляторных пиков гонадотропинов — лютеинизирующего гормона (LH) и FSH. Эти гормоны вызывают изменения экспрессии генов, а также морфологических и физиологических характеристик текальных клеток, клеток гранулёзы, кумулюса и ооцита в составе фолликула яичника. В каждом эстральном цикле часть ооцитов вовлекается в продолжение мейоза, который вновь останавливается на стадии метафазы II; на этой стадии происходит их овуляция. Изменения, происходящие между остановкой мейоза на стадиях диплотены и метафазы II, считаются созреванием.⁴⁵

Созревание незрелых ооцитов in vitro (IVM) происходит по иному механизму, чем созревание ооцитов in vivo. Извлечение ооцита из фолликулярной среды, сдерживающей его созревание, и последующее помещение в благоприятные условия культивирования приводят к спонтанному созреванию без той последовательности физиологических процессов, которая происходит in vivo , хотя могут наблюдаться некоторые морфологические изменения (например, разрастание клеток кумулюсаg).⁴⁶ Условия in vitro моделируют некоторые физиологические изменения благодаря добавлению гормонов, в том числе LH, FSH и эстрадиола-17β, характерных для преовуляторного фолликула, а также гормонов роста или эпидермального фактора роста.⁴⁷

Способ получения ооцитов и степень их зрелости определяют, как с ними следует обращаться после получения. Незрелые ооциты можно получать от коров, не подвергавшихся стимуляции,